La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Bioengineering

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Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

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Abstract

Introduction

Para aplicaciones terapéuticas de genes es de gran importancia para evitar efectos secundarios citotóxicos e inmunogénicas causadas por la expresión de proteínas virales, el propio transgén o por las proteínas virales entrantes. Los vectores de adenovirus (ADV) se utilizan ampliamente para introducir ADN extraño en una amplia variedad de células para investigar el impacto de la expresión transgénica 1,2. La versión más avanzada de AdV está representado por los vectores de adenovirus de alta capacidad (HCAdV) que carecen de todas las secuencias de codificación virales 3,4 y ofreciendo con ello una capacidad de envasado de hasta 35 kb combinados con baja inmunogenicidad y baja toxicidad 5-8. Debido a su alta capacidad de envasado que permiten la entrega de grandes o múltiples transgenes utilizando una dosis única vector. Por lo tanto, representan una herramienta valiosa para la comunidad de investigación.

En contraste con el primer o segundo AdV generación que carece de los genes tempranos E1 y / o E3 que se pueden producir fácilmente usando kits comerciales, vector producción de la construcción del genoma y virus de HCAdV es más compleja. El sistema para la construcción de genomas HCAdV se basa en la pAdFTC plásmido que lleva un genoma HCAdV desprovisto de todas las secuencias de codificación virales y el plásmido lanzadera pHM5 9-12. Cualquier gen de interés de hasta 14 bases kilo (kb) se puede clonar en el pHM5 vector lanzadera en la que el sitio de clonación múltiple está flanqueada por el reconocimiento / sitios de las endonucleasas de la vivienda escindir PI Sce I y I-Ceu I. Por lo tanto, un gen clonado de interés puede ser liberado por PI- Sce I y consecutiva I- Ceu I digiere para la inserción dirigida posterior en los mismos sitios de restricción presentes en el genoma HCAdV contenida en el plásmido pAdFTC. En pAdFTC el sitio de inserción del transgén situado entre el PI- Sce I y I-Ceu I división sitios está flanqueado por ADN de relleno y las secuencias no codificantes adenovirales requeridos para el envasado del genoma tales como repeticiones terminales 5 'y 3' invertida (ITR)en ambos extremos y la señal de empaquetamiento aguas abajo de la 5'ITR. El ADN de relleno adicional proporciona tamaño óptimo del genoma HCAdV final en un intervalo de 27 a 36 kb para asegurar el empaquetamiento eficaz durante la producción de virus. Desde pAdFTC es un plásmido grande con hasta 45 kb (dependiente del tamaño del transgén insertado) y el uso de endonucleasas de la vivienda con los sitios de reconocimiento de ADN largas comparativamente exhibe una fuerte unión a ADN, varios pasos de limpieza son necesarios durante la transferencia del transgén de pHM5 a pAdFTC. Se recomienda un manejo cuidadoso evitando fuerzas de cizallamiento.

Las ITR del genoma HCAdV están flanqueadas por No me sitios de reconocimiento de enzimas de restricción localizados directamente arriba de la 5'ITR y aguas abajo del 3'ITR 12. Por lo tanto, HCAdV puede ser puesto en libertad por no digiero para la posterior transfección del genoma viral en la línea celular productora HCAdV. Tenga en cuenta que el uso de la enzima de restricción Not I para relfacilidad del genoma viral de la pAdFTC plásmido implica que el transgén insertado carece de sitios de reconocimiento Not I de ADN. Las células productoras basadas en células HEK293 (116 células) expresan de forma estable la recombinasa Cre. Para la amplificación del virus 116 células están coinfectados con un virus auxiliar (HV) proporcionar todos los genes AdV necesarias para la replicación y el embalaje en trans 3,4. El HV es un AdV primera generación con una señal de embalaje floxed que se elimina durante la amplificación del virus por la recombinasa Cre expresada en células 116 4. Esto asegura que los genomas predominantemente HCAdV contienen una señal de embalaje intacto se encapsidados.

Pre-amplificación de la HCAdV se lleva a cabo mediante la realización de pasos pases seriados en 116 células cultivadas en superficies en placas de cultivo de tejidos. Después de cada paso de partículas víricas se liberan de las células infectadas mediante la realización de tres pasos de congelación-descongelación consecutivas. Con cada paso de un número creciente de células se infectan con1/3 del lisado celular del paso anterior. Finalmente lisado procedente se utiliza el último paso de pre-amplificación para infectar células productoras se cultivan en suspensión en un matraz de agitación para la amplificación a gran escala. Los viriones se purificaron a partir de las células en suspensión mediante la realización de ultracentrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio 4,12. Con este procedimiento las partículas vacías y las partículas totalmente ensamblados se separan en dos bandas distintas. Para concentrar aún más el HCAdV partículas se lleva a cabo una segunda etapa de ultracentrifugación no gradual. Posteriormente se recoge la banda resultante que contiene el HCAdV y se dializa frente a un tampón fisiológico. Preparaciones de vector final se caracterizan con respecto a los números absolutos de partículas virales, partículas infecciosas y los niveles de contaminación HV. Partículas virales absolutos pueden ser determinados mediante la lisis de las partículas virales y midiendo la absorbancia a 260 nm o mediante la realización cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) 12. La infectividad del purpartículas de virus ficados pueden ser determinados por los genomas de medición HCAdV qPCR presentes dentro de las células infectadas 3 hr después de la infección.

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Protocol

1. Construcción del recombinante HCAdV Genomas basado en el plásmido pAdFTC

Nota: Todos los plásmidos se han descrito anteriormente 11,12 y están disponibles a petición. El procedimiento de clonación se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

  1. Clonar un gen de interés (GOI) incluidos el promotor y señal de poliadenilación (pA) en la lanzadera de plásmido pHM5, usando una estrategia de clonación de elección, para generar pHM5-GOI.
    NOTA: Como pAdFTC es un plásmido relativamente grande, se recomienda protocolos de preparación de plásmido clásicos para evitar sheering del ADN plasmídico mediante el uso de kits comerciales de purificación de plásmido que se basan en las membranas de sílice. I- Ceu I y PI -Sce Ato fuertemente al ADN y cambiar la movilidad electroforética de ADN digerido. Por lo tanto, se requiere una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH (paso 1.3) antes de la electroforesis en gel de agarosa.
  2. Recopilación de 20 g de pHM5-GOI y 10 g de pAdFTC por I-CeuI (10 U) durante 3 horas a 37 ° C en un volumen total de 100 l para linealizar plásmidos (~ 2,8 kb + GOI secuencia ORF y ~ 31kb, respectivamente).
  3. Purificar plásmidos linealizados utilizando extracción con fenol-cloroformo, seguido de etanol (EtOH) precipitación 13.
    1. Añadir 100 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y mezclar suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar durante 2 min a 15.000 x g.
    2. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, añadir 20 l de acetato de sodio (pH 5, 3 M) y 400 l de hielo frío EtOH (99,8%) y mezclar la suspensión vigorosamente. Centrifugar durante 10 min a 15.000 x g.
    3. Eliminar el sobrenadante, añadir 300 l de EtOH al 70% y centrifugar durante 2 minutos a 15.000 x g. A continuación, retire el sobrenadante y sedimento de ADN se seque al aire. Disolver el precipitado en 10- 20 l de dH 2 O. Haga sedimento de ADN no se seca demasiado tiempo, ya que será más difícil obtener ADN en solución.
  4. Digesto I-Ceu I -digested pHM5-GOI y el plásmido pAdFTC desde el paso 1.3) durante al menos 3 horas o O / N con la enzima de restricción PI -Sce I (10 U) a 37 ° C en un volumen total de 50 l y posteriormente purificar I -CeuI y PI -Sce I digirieron los plásmidos utilizando extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (véase el paso 1.3). Disolver ADN en 20 l de nucleasa libre dH 2 O.
  5. Plásmido separada backbone pHM5 (2,8 kb) y el Gobierno de la India (del paso 1.4) en un gel de agarosa preparativa y gel-purifican el Gobierno de la India utilizando una de gel comercial y PCR kit de limpieza. Un gel de agarosa al representante de la digestión se muestra en la Figura 2A.
  6. Desfosforilar I- Ceu I y digerido I-PI -Sce pAdFTC (del paso 1.4) con fosfatasa alcalina intestinal de ternera CIP (10 U) durante 1 hora a 37 ° C en un volumen total de 25 l y purificar el plásmido desfosforilado pAdFTC por extracción con fenol-cloroformo y posterior EtOH precipitation (paso 1.3). Eluir el ADN en 20 l de nucleasa libre dH 2 O.
  7. Realizar la electroforesis en gel analítica a partir de una alícuota de la plásmido desfosforilado pAdFTC (del paso 1.6) y el GOI-fragmento purificado (procedente de la etapa 1.5) para analizar si digiere están completos y los tamaños de los fragmentos esperados son correctos (~ 31 kb para pAdFTC linealizado ).
    Nota: El tamaño del GOI es variable dependiendo del tamaño de la casete de expresión del transgén. Estimar las concentraciones relativas de los respectivos fragmentos para ligación posterior. Un gel de agarosa al representante de fragmentos purificados se muestra en la Figura 2B.
  8. Configurar la reacción de ligación en un volumen total de 20 l usando 400 U de ADN ligasa de T4 y una relación molar de vector para insertar de 1: 3.
    NOTA: En concordancia con el gel de agarosa se ​​muestra en la Figura 2B por lo general ligar en un volumen total de 20 l con 2 a 6-l vector, de 8 a 12 linsertar y 400 U de T4 ADN ligasa. A medida que la concentración de ADN es generalmente baja después de varios pasos fenolización, utilizar tanto ADN como sea posible de modo que ningún adicional H 2 O tiene que ser añadido para alcanzar el volumen final de 20 l. Ligar a 16 ° CO / N y posteriormente realizar la extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (paso 1.3).
    1. Eluir el ADN en 15 l de nucleasa libre de dH 2 O y digerir la reacción de ligación se purificó con la enzima de restricción SwaI (10 U) durante 2 horas a 25 ° C en un volumen total de 20 l. A continuación, concentrar y purificar el ADN, mediante la realización de la extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (paso 1.3). Eluir el ADN en 10 l de nucleasa libre dH 2 O.
  9. Transformar 2 l de la SWA purificado digerido producto de ligación mediante electroporación en DH10B o DH5a electrocompetentes E. coli y seleccionar clones de 16 a 24 horas a 37 ° C sobre que contiene la ampicilina-LBplacas (50 mg / ml de ampicilina). Seleccionar 5- 10 clones y preparar mini-preparaciones de ADN plásmido utilizando lisis alcalina seguido por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH posterior (paso 1.3) 13.
  10. Realizar una digestión analítica de mini-preparaciones de plásmido seguido de electroforesis en gel de agarosa para comprobar el tamaño de fragmentos de ADN. Enzimas de restricción sugeridos son, por ejemplo I-Ceu I y PI Sce I liberando el inserto, Spe I o HincII (Figura 2C).
  11. Amplificar un clon correcto en medio LB que contiene ampicilina (50 mg / ml de ampicilina) y llevar a cabo una preparación midi- o-maxi plásmido utilizando cualquier kit de purificación de plásmidos disponibles comercialmente.

2. La liberación de HCAdV-genomas de pAdFTC plásmido y preamplificación de HCAdV Vectores en la Línea 116 Productor celular

  1. Digerir 20 mg del plásmido adenoviral de producción basados ​​en pAdFTC contiene el GOI clonado a partir del paso 1.11) enun volumen total de 100 l usando Not I (20 T) a 37 ° C durante> 2 horas y realizar la extracción con fenol-cloroformo dos veces seguidas por precipitación con EtOH. Disolver en 20 a 30 l dH 2 O. estéril
  2. Compruebe una alícuota de 1:10-GOI-ADN digerido pAdFTC diluida por electroforesis en gel. Un fragmento de 9 kb para el esqueleto del plásmido y, dependiendo del tamaño de la GOI, un segundo fragmento de ADN para el genoma HCAdV (tamaño: 28- 36 kb) es detectable.
    NOTA: Un ejemplo representativo de la No he digerido se muestra en la Figura 2D. ADN linealizado se puede almacenar durante varios días a 4 ° C o -20 ° C a durante varias semanas.
  3. Antes de proceder con el protocolo, asegúrese de que el virus auxiliar AdNG163R-2 ha sido amplificada 4.
    Nota: Las células transfectadas con pAdFTC derivada vectores HCAdV son organismos modificados genéticamente clasificados como nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), por favor utilice la contención y manejo de desechosmedidas, incluido el equipo de protección personal, y trabajar bajo BSL-2 campanas de flujo laminar.
  4. Cultura 116 células en medio MEM de Eagle suplementado con 10% de FBS y la higromicina B (100 mg / ml). Semilla de paso bajo (por debajo de pasaje 10) 116 células (~ 0,4 x 10 6 células) en un 60 mm placa de cultivo tisular un día antes de la transfección para que lleguen a 50- 80% de confluencia el día siguiente.
  5. Transfectar linealizado genoma HCAdV de la etapa (2.1) en 116 células mediante el uso de métodos, tales como transfección con fosfato de calcio u otros reactivos de transfección disponibles comercialmente (Figura 3A). 16- 18 horas después de la transfección, retire con cuidado el medio, añadir 3 ml de medio fresco (MEM, 5% de SFB) e infectar a las células con el HV AdNG163R-2 4 aplicando 5 unidades de transducción (TU) por célula (ya que una confluencia de 60 mm placa de cultivo de tejidos contiene ~ 3.2x 10 6 células, añadir ~ 1.6x 10 7 TU de HV).
    1. Mueva suavemente el plato cada 20 minutos durante la primera hora después de la infección agarantizar una distribución igual HV. Cultivar las células infectadas a 37 ° C y 5% de CO 2. En caso de efecto citopático amplificación del virus eficiente (CPE) causada por la replicación del virus (células se redondean y vagamente unidos o separados de la placa de cultivo de tejidos) es observable 48 horas se observa después de la infection.If CPE anterior la cantidad de HV tiene que ser reducido. Si CPE comienza más tarde, más virus auxiliar tiene que ser utilizado.
  6. Células de la cosecha incluyendo sobrenadante 48 horas después de la infección por el lavado de las células de la placa de cultivo utilizando el medio de cultivo. Las células que se encuentran suspendidas en el medio de cultivo se llaman pasaje 0 (P0). Dividir P0 en dos fracciones.
    1. A partir de 0,5 ml de las células desprendidas giran hacia abajo las células durante 3 min a 2.000 xg y eliminar medio del sedimento celular, que se utiliza después para aislar ADN genómico (ADNg) para el análisis basado qPCR del proceso de amplificación. Sedimentos celulares Almacenar a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.
    2. De 2.5ml de las células desprendidas liberar partículas virales por congelación (a -80 ° C o en nitrógeno líquido) y descongelación (a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37 ° C) las células se resuspendieron en que su medio de tres a cuatro veces. Esta fracción es de llamada lisado de P0.
  7. Asegurar que las placas de cultivo de tejidos con 116 células que se cultivan al 90- 95% de confluencia utilizando MEM-medio suplementado con FBS (10%) e higromicina B (100 mg / ml) y HV están disponibles para los siguientes pasos pases.
  8. Mezclar 1 ml de medio fresco (MEM, FBS al 5%) con 2,5 ml del lisado del paso anterior (paso 2.6.2) hasta un volumen final de 3,5 ml, añadir HV aplicar 2 TU por célula (ya que un tejido 60 mm placa de cultivo a una confluencia de 90- 95% contiene ~ 3.2x 10 6 células, añadir ~ 6.4x 10 6 TU de HV). (Figura 3B). Retirar con cuidado el medio de un plato 60 mm de 116 células y añadir la mezcla viral a las células. Repita el paso 2.6) - 2.8) dos veces para obtener lisados ​​de paseedades P1 y P2.
  9. Mezclar 17,5 ml de medio fresco (MEM, 5% de FBS) con el 2,5 ml del lisado de P2 y añadir HV aplicar 2 TU por célula (ya que un 150 mm placa de cultivo de tejido a una confluencia de 80- 100% contiene 10 ~ 2x 7 células, añadir 10 ~ 4x 7 TU del HV). Retire el medio de un plato de 150 mm de 116 células e infectar las células con la mezcla viral. Cultivar las células infectadas a 37 ° C y 5% de CO 2.
  10. Las células de la cosecha después de la infección 48h como se describe en el paso 2.6) para obtener el paso P3 (Figura 3B).
    1. Repita el paso 2.6) 1.
    2. Desde el restante 19,5 ml de liberación P3 partículas virales de las células resuspendidas por congelación y descongelación tres a cuatro veces. Esta fracción es de llamada lisado de P3.
      Nota: Algunos vectores finalmente pueden requerir pasos adicionales en 150 mm platos hasta que se amplifican lo suficiente. Por lo tanto la efectividad del proceso de pre-amplificación debe ser monitoreado durante el pase de serieenvejecimiento. análisis basado qPCR del proceso de amplificación puede llevarse a cabo como se describe en la sección 3 (véase también la figura 4A). Pre-amplificación de HCAdV que lleva un casete de expresión para la proteína verde fluorescente (GFP) puede ser fácilmente evaluada mediante la observación de la señal flourecscent GFP usando un microscopio de fluorescencia (Figura 4B).

3. Seguimiento del proceso de amplificación usando-cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) (véase también la figura 4A).

  1. Aislar gDNA de sedimentos celulares de cada paso de la preamplifaction (pasos 2.6) - 2,10) utilizando cualquier kit de aislamiento de ADN comercial para aislamiento de gDNA de células cultivadas u otro método de elección. Para obtener resultados óptimos PCR utilizar gDNA lo más fresco posible. De lo contrario gDNA se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
  2. Para determinar el número de genomas HCAdV presente en las células del paso respectivo mediante análisis de qPCR generar una curva estándar usando 10 1 </ sup> - 10 9 copias de un plásmido que lleva el GOI contenidas en el genoma HCAdV.
  3. Analizar la misma cantidad de gDNA de P0- P3 (paso 2.6- 2.10) aplicar qPCR usando 400 nM de cebadores específicos para el GOI contenidas en el genoma HCAdV. Para llevar a cabo las instrucciones de seguimiento del fabricante qPCR de los respectivos productos químicos qPCR. Ajuste el programa de qPCR de la siguiente manera: pre-incubación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación en 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55- 60 ° C durante 15 s y 72 ° C durante 20 s. Sobre la base de la curva estándar el número de genomas HCAdV en la reacción se puede interpolar.

4. Gran Escala La amplificación de HCAdV vectores en 116 células que crecen en suspensión

  1. Añadir 900 ml de precalentado (37 ° C) MEM fresco suplementado con FBS al 10% e higromicina B (100 mg / ml) en un matraz de 3 l de cultivo spinner (Figura 3B).
  2. Retire medio de al menos 10 150 mm platos individuales de cultivo de tejidos con 116 células cultivadas a una confluencia del 90% 100 y al ras de las células con 10 ml de fresco precalentado (37 ° C) suplementado con FBS MEM (10%) y la higromicina B (100 mg / ml) utilizando una pipeta serológica. Pipeta arriba y abajo varias veces para obtener una suspensión celular homogénea. Transferencia de células directamente en el matraz spinner que ya contiene 900 ml del paso 4.1).
    Nota: No utilice tripsina / EDTA, ya que puede afectar negativamente el crecimiento de células en suspensión. Después de la eliminación del medio de transferir inmediatamente las células en el matraz spinner. No manipule más de dos placas de cultivo de tejido a la vez. El más largo el tiempo de espera después de la adición de medio fresco más difícil será independiente de las células de la placa de cultivo tisular.
  3. Para asegurar el crecimiento celular óptimo matraz spinner Incubar en un agitador magnético en una incubadora de cultivo de tejidos durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajustar el agitador magnético a 70 rpm para evitar la unión de las células a las superficies de vidrio. Monitorear el crecimiento celular en frasco de cultivo spinner para examinar si las células cultivadas en el frasco de cultivo spinner son viables y si crecen a cantidades suficientes. Cada vez antes de añadir medio fresco de transferencia de 2 ml del biorreactor a un 60 mm placa de cultivo tisular. Observar la morfología celular bajo un microscopio.
    Nota: Las células que forman grumos que flotan en el medio de cultivo indican crecimiento y la viabilidad (véase también la Figura 4C) óptimo. Después de 24 hr forman colonias en la superficie de la placa de cultivo tisular. 30- 50% de confluencia indica la densidad óptima.
  4. 24 horas después de la creación de la frasco de cultivo centrifugador añadir 500 ml de medio fresco (MEM, 10% FBS), complementado con higromicina B (100 mg / ml). 24 horas más tarde repetir este paso.
  5. 72 hr después de configurar el cultivo giratorio, añadir 1.000 ml de medio MEM fresco (10% FBS) con higromicina B (100 mg / ml) dando como resultado un volumen total de 3 l de suspensión celular.
  6. 24 horas después de llegar a avolumen de tres litros, cosecha 116 células en suspensión por centrifugación durante 10 min a 500 xg a TA. Eliminar el sobrenadante. Mantenga el frasco de cultivo spinner vaciado bajo el capó de cultivo de tejidos.
  7. Resuspender los sedimentos celulares en MEM fresco suplementado con 5% de FBS pipeteando arriba y abajo sobre 8- 10 veces para obtener una suspensión celular homogénea. El volumen de medio depende de si el lisado procedente de la Etapa 2.10) 2. (19,5 ml, véase paso 4.8) 1. la opción a) o una acción viral purificada de HCAdV desde el paso 5.9) 2. (varios l depanding el título viral, ver el paso 4.8) 2., la opción b) se utiliza para la infección de las células. Utilice un volumen total de 150 ml.
    1. Opción A: Para la infección de 116 células en suspensión con lisado de P3 (amplificación primaria) células de transferencia desde el paso 4.8) a una botella de 250 ml de almacenamiento equipado con una barra estéril de agitación magnética o un matraz de agitación a pequeña escala de 250 ml y las células con la co-infectar virus dentro del lisado de P3 (paso 2.10.2) y 2 TU de HV por célula. Suponiendo una densidad de 3x10 5 células por ml, el número total de células es 9x 10 8 células. Así agregar 1.8x 10 9 TU del HV.
    2. Opción B: Para la infección de 116 células en suspensión con Stock viral purificada, las células de transferencia desde el paso 4.8) a una botella de almacenamiento 250 ml equipado con una barra estéril de agitación magnética o un matraz de agitación a pequeña escala de 250 ml y co-infectar las células con las partículas virales 100 por célula de HCAdV anteriormente purificado (procedente de la etapa 5.9) 2.). Por lo tanto añadir 9x 10 10 VP de acuerdo con el título físico (medido por absorbancia a 260 nm; paso 6) de la HCAdV purificada y 1.8x 10 9 TU del HV.
  8. Se agita la mezcla de células-virus de SEP 4.8.1) o 4.8.2) en en un agitador magnético en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 horas a 60 rpm. Asegúrese de que la botella de almacenamiento no está completamente cerrada para permitir la circulación del aire.
  9. 2 horas después de la infección transferir el volumen total de la mezcla de células de virus de nuevo en el 3 l spinner cultomatraz de ure y añadir 1.850 ml de fresco precalentado (37 ° C) MEM medio suplementado con 5% de FBS a un volumen total de 2 L y se incuban en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 horas a 70 rpm.
  10. Cosecha células por centrifugación durante 10 min a 890x g a temperatura ambiente en 500 ml tubos de centrífuga. Retire el medio y volver a suspender las células sedimentadas en un volumen total de 28 ml de DPBS. Pipetear hacia arriba y abajo para obtener una suspensión celular homogénea. Congelar la suspensión de células de virus en nitrógeno líquido o a -80 ° C asegurándose de que la suspensión está completamente congelado. Almacenar la suspensión de células de virus a -80 ° C hasta el momento de comenzar la purificación de virus.

5. Purificación y Diálisis de HCAdV

  1. Para preparar lisado viral de cloruro de cesio (CsCl) gradientes, congelar suspensión de células de virus desde el paso 4.11) en nitrógeno líquido y descongelación en un baño de agua a 37 ° C en cuatro ocasiones.
  2. Centrifugar el lisado viral a 500 xg durante 8 min a RT y recoger el sobrenadante que contiene el HCAdV.
  3. Para preparar soluciones de CsCl Ultracentrifugación como follows.Weigh 37,5 g (por 1,5 g / cm 3), 33,5 g (por 1,35 g / cm 3), y 31,25 g (por 1,25 g / cm 3) de polvo de CsCl, respectivamente, y llenar con dH 2 O y 25 ml.
    1. Stirr hasta que la solución se vuelve filtro transparente y estéril las soluciones. Finalmente retire 1 ml de cada solución y pesar en una escala fina para comprobar wether la densidad es correcta. 1 ml debe ponderar 1,5 g, 1,35 y 1,25 g, respectivamente.
    2. Si la densidad es demasiado alta ajustar por adición gradual de pequeños volúmenes (mu l) de dH estéril 2 O. Tras la adición de dH2O medir la densitiy nuevo. Si es necesario añadir más H2Od
    3. Repita el procedimiento hasta que la densidad es la correcta. Si la densidad es demasiado baja ajustarlo añadiendo una pequeña cantidad de polvo de CsCl. Filtro estéril de nuevo y comprobar la densidad. Si la densidad es demasiado alta ajustarlo por complementog H2Od como se describe antes. Si la densidad es demasiado baja añadir mor CsCl, filtro estéril de nuevo y comprobar la densidad. Repita el procedimiento hasta que la densidad es la correcta.
  4. Preparar paso gradientes de CsCl en seis tubos de ultracentrífuga claras. Con cuidado y lentamente pipetear soluciones de CsCl en los tubos utilizando el siguiente orden: 0,5 ml de 1,5 g / cm 3 solución de CsCl, 3 ml de 1,35 g / cm 3 solución de CsCl y 3,5 ml de 1,25 g / cm 3 solución de CsCl (Figura 2C) .
  5. Superposición ~ 4,5 ml de sobrenadante aclarado vector del paso 5.2) en la parte superior del g / cm 3 capas CsCl 1,25. Centrifugar los gradientes en una ultracentrífuga utilizando un columpio cabo rotor (SW-41) a 12 ° C durante al menos 2 horas a 226.000 xg (35.000 rpm) con una aceleración lenta y deceleración para HCAdV-genoma separado que contiene las partículas virales de partículas vacías y celular escombros.
    NOTA: En condiciones óptimas de una banda difusa de formes escombros celular en la parte superior de lalos tubos. A continuación se pueden observar de dos bandas blancas. La banda superior contiene partículas vacías mientras que la banda inferior es igual a la HCAdV (Figuras 2C y 5A).
  6. Retirar con cuidado las capas de restos de células y las partículas vacías y recoger 1 ml de las bandas más bajas de cada tubo y virus de transferencia con una punta de pipeta limpia en un tubo de 50 ml estéril. Añadir un máximo de 24 ml de 1,35 g / cm 3 solución de CsCl a las partículas del virus recogidos y mezclar con cuidado.
  7. Llenar los tubos de centrífuga con 1,35 g / cm 3 solución de CsCl-virus para el O superior y centrifugar / N (18- 20 h) a 226.000 xg (35.000 rpm) a 12 ° C en una ultracentrífuga usando un columpio cabo rotor (SW-41 ) con una aceleración lenta y desaceleración.
  8. Recoger el HCAdV presente en la banda inferior prominente. Como banda superior potencial contiene partículas vacías eliminar las capas superiores de la parte superior con una pipeta (ver Figuras 2C y 5B) Luego quita el usi banda inferiorng de una pipeta.
  9. Dializar las partículas del virus recogidos para el intercambio de búfer.
    1. Cortar una tira de tubos de diálisis (MWCO: 50000) de unos 8 cm de longitud, lávela con dH 2 O estéril durante tres veces. A continuación, cierre un lado del tubo de diálisis con una abrazadera de plástico y transferir el virus recogido desde el paso 5.8) en el tubo usando una pipeta de 1 ml. Evitar las burbujas de aire dentro de la tubería y cerrarla en el otro lado con un plástico cierres de diálisis abrazadera.
    2. Se dializa en 1 l de tampón de diálisis (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% de glicerol y 1 mM de MgCl 2 en desionizada H 2 O) durante 2 horas a 4 ° cwith agitación lenta. Tampón de diálisis Exchange con 2 l de tampón de diálisis y se dializa O / N a 4 ° C con agitación lenta. Alternativamente, puede utilizar un sucrosebuffer (NaCl 140 mM, 5 mM Na 2 HPO 4 x2H 2 O, mM KH sacarosa mM 1,5 2 PO 4 y 730, pH 7,8).
    3. Recoge partículas virales dializados desde el paso 5.9) 2. utilizando un 1 ml de pipette. Preparar múltiples alícuotas de pequeños volúmenes deseados (25- 100 l) y almacenar virus purificado a -80 ° C.

6. Medir la Titer física de Preparativos HCAdV finales por densidad óptica (DO)

  1. Diluir 25 l de la preparación de vector final de la etapa 5.9) 2 con 475 l de tampón de lisis (Tris-HCl 10 (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS)), agitar suavemente durante 20 min a RT y finalmente Centrifugar durante 2 min a TA a 15.000 x g.
  2. Dado que los valores de absorbancia a 260 nm (A260) son generalmente bajos, medir la absorbancia cuatro veces con 100 l de sobrenadante y calcular el valor medio de las cuatro mediciones. Calcular el número de partículas virales por ml (vp / ml -1) utilizando la siguiente fórmula: vp / ml -1 = (A260 media) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb de tamaño / HCAdV en kb ).
    NOTA: Los resultados de un rendimiento típico de las partículas virales absolutos (titulación OD) se muestran en la Figura 7A

7. Medición total Partículas, Unidades Infecciosas del HCAdV y Niveles HV contaminación en la final Preparación del vector por qPCR. Un esquema del procedimiento de titulación se muestra en la Figura 6

  1. Semilla células HEK293 en 6 ó 12 placas de cultivo tisular de modo que así células alcanzan 90% de confluencia en el día siguiente. Para determinar el número de partículas virales infecciosas (título infeccioso), infectar las células de un pocillo de una placa de múltiples pocillos con 1 l y un segundo bien con 10 l de virus purificado de la etapa 5.9) 3.
  2. Las células de la cosecha después de la infección de 3 horas. Retire medio y agregar la tripsina para cubrir todo el bien e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 5 min. Enjuague fuera de las células con el tripsina usando una pipeta y centrifugar las células a 890 xg durante 3 min a TA.
  3. Resuspender las células sedimentadas en 200 l de DPBS y lavarlos a fondo para eliminar (no-infecciosos) partículas libres de vectores. Centrifugar durante 3 minutos a 890 xg a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender sedimentos celulares en 200 l de DPBS fresco.
    Nota: Para la determinación precisa de la título infeccioso, es crucial para eliminar todas las partículas virales no infecciosas a partir de las superficies de las células mediante tratamiento con tripsina y lavado a fondo.
  4. Para determinar el número de partículas virales totales (partículas infecciosas y no infecciosas las partículas = título física), la cosecha no infectados células HEK293 de dos pozos sin tripsina por lavado fuera de las células con su medio de cultivo utilizando una pipeta.
  5. Centrifugar las células durante 3 min a 890 xg a TA. Deseche el medio y volver a suspender las células sedimentadas en 200 l de DPBS. Suañadir bsequently 1 l y 10 l de preparación HCAdV purificado directamente a las células, respectivamente. Utilice las células no infectadas como fondo, para garantizar las mismas condiciones para el aislamiento gDNA y posterior q-PCR.
  6. Aislar gDNA a partir de células HEK293 derivados de pasos 7.3) y 7.5)
    1. Vortex células resuspendidas en 200 l de DPBS (paso 7.3 y 7.4) durante 3 s, añadir 200 l de solución de SDS. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS) y 20 l de proteinasa K (20 mg / ml) y la suspensión de vórtice durante 3 seg. Incubar 12- 16 horas a 55 ° C y agitar lentamente. A continuación, añadir 2 l de RNasa A (20 mg / ml) y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
    2. Añadir 350 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se centrifuga durante 2 min a 15.000 x g. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y repita este paso una vez
    3. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, se añaden 50 l de acetato de sodio (pH 5, 3 M) y 1 ml de hielo frío EtOH (99,8%) y mezclar la suspensión. CentriFUGE muestras durante 10 minutos a 15.000 xg para sedimentar el ADN genómico.
    4. A continuación, eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EtOH al 70% y se centrifuga durante 2 min a 15.000 x g. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EtOH al 70% y agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar durante 2 minutos a 15.000 x g.
    5. Eliminar el sobrenadante y sedimento de ADN se seque al aire. Hacer bolitas de ADN no seco durante mucho tiempo, ya que será más difícil de conseguir gDNA en solución. Resuspender el sedimento de ADN en 120 l de dH 2 O y se incuba durante ~ 1 hora a 37 ° C mientras se agita. Si la solución de ADN aparece viscosa, agitar durante varias horas a 37 ° C, o se incuba a 55 ° C durante ~ 1 hora.
  7. Para determinar HCAdV-partículas infecciosas y HCAdV-partículas absolutas, generar una curva estándar de 10 8 01 al 10 copias de un plásmido que lleva el GOI contenidas en el genoma HCAdV.
  8. Determinar partículas totales y partículas infecciosas mediante el análisis de las mismas cantidades de ADNg de c infectados HEK293anas desde el paso 7.3) y 7.4) se aplican qPCR usando 400 nM de cebadores específicos para el Gobierno de la India que contiene el genoma HCAdV.
  9. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: pre-incubación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación en 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 10 seg y 72 ° C durante 20 seg. Sobre la base de la curva estándar (paso 7.7), interpolar el número total de los genomas adenovirales en la reacción.
  10. Calcular el número de genomas adenovirales en la preparación vector final utilizando el siguiente Formular: (Número de HCAdV / peso en ng de gDNA en la reacción) x (peso en ng de ADN de todas las células en el plato infectada virus / volumen en l) .
    NOTA: El rango típico de partículas virales infecciosas absolutos y los rendimientos son alrededor de 1x10 7 -1x10 8 viral partículas / l. Los títulos que son diez veces mayor o menor que mostró aquí se pueden considerar como normal. Títulos más altos sería una mejora. Con respecto a la relación de partic HCAdV absolutales a partículas HCAdV infecciosas, la experiencia muestra que aproximadamente 5- 10% de las partículas HCAdV absolutos son infecciosas (Figura 7A).
  11. Para determinar los niveles de contaminación con HV, realice qPCR mediante la amplificación de una parte de la tarde gen adenoviral 3 (L3) presente en el genoma HV. Utilice un plásmido que lleva el gen adenoviral tarde 3 (L3) para generar una curva estándar (paso 7.7).
  12. En esta reacción aplicarán 400 nM de la L3 cebadores adelante 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'y L3 inverso 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3', junto con 300 nM de la sonda-L3 específica 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: pre-incubación / activación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación durante 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Utilice cualquier sonda universal de PCR Mastermix para la reacción qPCR. Sobre la base de la curva estándar (paso 7.7), calcular el número de enpartículas infecciosas de alta tensión en la preparación vector final. Ver (Figura 7A) para los rendimientos típicos para partículas de alta tensión.
  14. Finalmente calcular la relación de partículas infecciosas absolutos de HCAdV a los niveles de contaminación de alta tensión para evaluar la calidad de la preparación del vector.
    NOTA: Hasta ahora una pequeña parte del restante HV no se puede excluir. Por lo general, el porcentaje de contaminación HV es de ~ 5% de las partículas infecciosas o menos, lo que es aceptable (Figura 7B). Por supuesto como menos HV como sea posible es deseable, especialmente si el preparado vector va a ser utilizado para los experimentos con animales.

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Representative Results

Se muestran ejemplos Aquí representativos para la clonación, amplificación y purificación de preparaciones HCAdV. Una visión general de la estrategia de clonación (Figura 1) y ejemplos representativos para la clonación y la liberación del genoma HCAdV por enzimas de restricción digerir son proporcionados (Figura 2). Un patrón de restricción típica después de la liberación del casete GOI-expresión de pHM5 por PI Sce I y I-Ceu I digerir y extracción con fenol-cloroformo y posterior precipitación con EtOH (véase también los pasos 1.2- 1.5) se muestra (Figura 2). Normalmente, una banda de ~ 3 kb correspondiente a la cadena principal plasmídica pHM5 y una segunda banda correspondiente a la casete de expresión del GOI puede ser observada. La banda que contiene el casete GOI-expresión se purifica a continuación a partir del gel de agarosa. El casete de expresión GOI-purificada se analizó en un gel de agarosa junto con el, pAdVFTC desfosforilado purificada que wcomo digerido con PI- Sce I y I-Ceu I, respectivamente (paso 1.7) para verificar el tamaño correcto y para estimar la cantidad relativa de moléculas de ligación posterior (Figura 2B). Después de la ligación (véase el paso 1.8) seguido de extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH y Swa digiero para eliminar pAdFTC sin cortar y extracción con fenol-cloroformo subsiguiente y precipitación con EtOH (paso 1.9), productos de ligación se transforman en bacterias y los clones se seleccionan en ampicilina que contiene placas de agar lb-. Por lo general, se obtienen decenas a cientos de clones, a partir del cual se preparan 5- 10 clones para mini-preparaciones de ADN plásmido. Un patrón de restricción de un análisis HincII compendio de clones positivos y negativos junto con un pAdFTC vacío como control negativo (véase también el paso 1.10) se muestra (Figura 2C). Aquí clones positivos no muestran una banda de 5 kb, que está presente en pAdFTC vacía y clones negativos y aparece un fragmento de 1,7 kbque no está presente en el pAdFTC vacía y clones negativos. Por esta respectivo GOI esto indica clonación tha se ha realizado correctamente. A continuación, un clon positivo que ha sido purificada a través de midiprep se digirió con No tI para liberar el HCAdV-genoma que lleva el GOI desde pAdVFTC-GOI (paso 2.2). Finalmente No tI ADN digerido ist purificó dos veces mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH para asegurar una alta pureza del ADN para la posterior transfección en células 116. El análisis de una pequeña fracción de la No tI digerido pAdVFTC-GOI en un gel de agarosa muestra una banda kb ~ 9 que corresponde a la columna vertebral plásmido pAdFTC y una gran banda de hasta ~ 36 kb (dependiendo del tamaño de la casete de expresión de GOI) correspondiente al genoma HCAdV (Figura 2D). Una visión general de la tubería de amplificación y purificación se muestra esquemáticamente (Figura 3). Se proporcionan ejemplos representativos de la supervisión del proceso de vectores de pre-amplificación ( (Figura 4A). Tenga en cuenta que el número de genomas de vector generalmente descreases durante los primeros pasajes y aumenta fuertemente en los pasajes posteriores. Un número de copias del vector de 06 10-07 10 por 15.000 células es suficiente para infectar a 116 células para la producción a gran escala en un matraz spinner 3 l. Si el GOI dentro del genoma HCAdV vector contiene un casete de expresión de GFP, el proceso de pre-amplificación (sección 2) también puede ser monitoreada por microscopía fluorescente. Imágenes representativas de cada pasaje se muestran (Figura 4B). Tenga en cuenta que el número de células GFP positivas generalmente disminuye durante los primeros pasajes y aumenta fuertemente en los pasajes tardíos. Si el número de células GFP positivas llega a ~ 100%, el vector se amplificó suffcientemente para infectar 116 células para la producción a gran escala en un matraz spinner 3 l. El proceso de amplificación a gran escala de un casete de expresión de GFP que contiene HCAdV se monitorizó mediante análisis microscópico de medio de cultivo y las células que se transfiere desde el matraz de agitación a una placa de cultivo tisular. Imágenes microscópicas de células productoras de HCAdV en cultivo en suspensión (véase el paso 4.4 y 4.11) se proporcionan (Figura 4C). Tenga en cuenta que las células están creciendo en grupos que indican que el crecimiento de las células precedente era suficiente y las células son saludables. Cuando se utiliza la microscopía fluorescente ~ 100% de estas células fueron GFP positivo, lo que indica la transducción eficiente de células en suspensión en el biorreactor y el vector eficiente de producción. Partículas del vector se purificaron a partir del medio y células del cultivo en suspensión 3 l por ultracentrifugación CsCl. Imágenes representativas de la purificación HCAdV vector usando CsCl ultracentrifugación en gradiente de densidad se muestran (Figura 5). Después den centrifugación inicial con un paso gradiente de CsCl generalmente se observan dos bandas. La banda superior contiene vacíos de cápsides parciales mientras que la banda inferior está compuesto de ADN que contiene partículas de vector (paso 5.4- 5.5) (Figura 5A). ADN que contiene partículas de vectores son posteriormente cosechó (paso 5.6) y se agruparon para una segunda etapa de ultracentrifugación para concentrar las partículas de vector. Este paso lo general resulta en una única banda de ADN que contiene partículas de vectores que finalmente cosechado para su posterior diálisis (paso 5.7- 5.8) (Figura 5B). Preparaciones de vector dializados se caracterizan por la medición del número de partículas absolutos, partículas infecciosas y la contaminación HV. Un plan esquemático del procedimiento de valoración (artículo 6 y 7) se proporciona (Figura 6). Los resultados representativos para la caracterización de la preparación de vector final se muestran (Figura 7). El gráfico de barras muestra el número de partículas de vectores típicos que sonobtenida por el procedimiento que se describe en este protocolo. Números de partículas absolutas de partículas del vector se determinaron mediante densidad óptica (artículo 6), partículas de vectores infecciosos y la contaminación HV se midieron por qPCR (sección 7) (Figura 7A). La experiencia demuestra, que el título OD sobreestima el número de partículas de virus. Partículas virales absoluto medido por OD pueden ser de 20 a 500 veces mayor que las partículas virales infecciosas medidos por Q-PCR. Partículas de vectores infecciosos usally oscilan entre 5- 10% de las partículas absolutas cuando ambos se midieron por q-PCR (apartado 7). Si la preparación vector tiene una muy buena calidad, más de 20% de las partículas son absolutos infecciosa. La relación típica entre AT y partículas HCAdV infecciosas (paso 7,14) por lo general oscila entre el 1-5% de las partículas infecciosas (Figura 7B). Esto es aceptable en la HV es deficiente replicación. Sin embargo como menos contaminación HV posible (<1% de partículas infecciosas) haríaser preferido.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo de la clonación del Gobierno de la India en pAdFTC. El Gobierno de la India se clona en el MCS del plásmido lanzadera pHM5. Los plásmidos pAdFTC y pHM5-GOI se digieren con I- Ceu I y PI- Sce I y se purificaron mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH. El pHM5 digerido se cargó en un gel de agarosa preparativa para purificar el gen de interés (véase también el paso 1.5), mientras que el plásmido digerido se desfosforiló pAdFTC. Posteriormente la reacción de ligación con pAdFTC tratado con CIP y el casete de expresión del transgén está configurado (véase el paso 1.8) y tras la finalización purificaron por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH. La subsiguiente Swa I Recopilación de el producto de ligación seguido por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH impide el crecimiento de los clones que llevan pAdFTC sin inserto. Tri negroángulos indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción; cajas grises indican AdV5 repeticiones terminales invertidas (ITR), cajas blancas marcadas con Ψ indican señal de empaquetamiento AdV5, flecha roja indica el promotor, cajas verdes indican transgén (gen de interés, GOI) a expresar, cajas azules indican señal de poliadenilación, naranja o azul flechas indican los genes de resistencia a antibióticos de la columna vertebral plásmido, respectivamente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Los resultados representativos para el procedimiento de clonación y la liberación del genoma HCAdV de pAdVFTC. (A) La liberación de casete GOI-expresión de pHM5 por PI Sce I y I-Ceu I digestión (véase también pasos 1.2- 1.5). (B) Sce I y I-Ceu I respectivamente (paso 1.7). (C) Analítica HincII compendio de clones pAdVFTC con y sin GOI (véase también el paso 1.10). (D) La liberación de la HCAdV-genoma que lleva el Gobierno de la India a partir pAdVFTC-GOI por No tI resumen (paso 2.2) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Infección Figura 3. Diagrama esquemático de alta capacidad de amplificación de vector adenoviral y purificación (A) transfección de ADN HCAdV y virus auxiliar (HV):. La transfección de linealizado genoma HCAdV que lleva el GOI en la línea celular productora HCAdV (116 células [4]) y subsequent infección con el HV AdNG163R-2 [4].   (B) Amplificación de HCAdV: Después de las etapas de pre-amplificación por serie transferencia de lisado de células a una nueva placa de cultivo tisular y co-infectar con HV, la producción a gran escala se lleva a cabo en un cultivo de 3 L de suspensión (C) Purificación HCAdV:. Para purificación, virus se aísla por ultracentrifugación utilizando gradientes de cloruro de cesio (D) Diálisis:. HCAdV partículas purificadas se dializaron frente a tampón de almacenamiento 2 L. HCAdV, alta capacidad vector adenoviral; ITR, serotipo de adenovirus 5 invertida repetición terminal; Ψ, señal de empaquetamiento; HV, virus auxiliar; MOI, multiplicidad de infección. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 <br /> Figura 4. Los resultados representativos del proceso de amplificación (A) Seguimiento del proceso de pre-amplificación mediante la amplificación de genomas virales mediante qPCR (véase también la sección 3);. (B) Si el Gobierno de la India contiene GFP como transgén, el proceso de pre-amplificación puede ser monitoreado por microscopía fluorescente. (C) Los resultados representativos del proceso de amplificación a gran escala en un matraz de agitación ejemplifica para la codificación HCAdV GFP. El panel izquierdo muestra una imagen microscópica de 116 células infectadas del matraz de agitación. Una muestra de medio de cultivo y las células se transfirieron a un 60 mm placa de cultivo tisular. Tenga en cuenta que grupos de células amplificadas son visibles. El panel derecho muestra la misma imagen usando microscopía fluorescente. Casi el 100% de las células son transducidas con HCAdV llevar las buenas prácticas agrarias. Por favor haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Los resultados representativos después CsCl gradiente de centrifugación (A) Después de realizar un gradiente escalonado (véase también el paso 5.5);.. (B) Después de gradiente continuo (véase también el paso 5.7) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Representación esquemática del procedimiento de titulación. (A) Medición de partículas infecciosas: Las células en una placa de múltiples pocillos están infectadas con diferentes volúmenes de virus purificado y se recogieron en forma de gránulos celulares (B) o de medición.f partículas absolutos: células Unifected forman una de múltiples pocillos se recogen por tripsinización y centrifugación. Después se añade el virus purificado resuspensión y el ADN genómico es aislado. (C) Aislamiento de ADN genómico. (D) Para cuantificar el número de copias del genoma viral una PCR cuantitativa (Q-PCR) se lleva a cabo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 7
Figura 7. Los resultados representativos para la caracterización de la preparación del vector final. (A) los números absolutos de partículas de una preparación vector de acuerdo con el protocolo presentado determinó con diferentes métodos:. Titulación OD mide por la densidad óptica (artículo 6), título infeccioso y la contaminación HV medido por qPCR (sección 7) (B)Relación entre el total de partículas HCAdV infecciosas y los niveles de contaminación de alta tensión medidos por qPCRs (sección 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo que aquí se presenta permite la purificación de los vectores basados ​​en adenovirus HCAdV tipo humano 5 basado en procedimientos descritos previamente 4,12. El genoma HCAdV dentro del plásmido pAdFTC está desprovisto de todos los genes de adenovirus y sólo lleva a los 5 'y 3'-RTI y la señal de empaquetamiento. En esta estrategia, el HV AdNG163R-2 4 proporciona todos los genes necesarios para la producción de virus eficiente en trans. Esto ofrece una capacidad de envasado de hasta 35 kb, que outcompetes claramente ADVS primera y segunda generación o la lentivirus ampliamente utilizado (LV) - o virus adeno asociado (AAV) vectores basados. Una segunda ventaja de HCAdV especialmente para aplicaciones in vivo es el hecho de que en contraste con de primera o de segunda generación ADVS que muestran niveles reducidos de citotóxica y efectos secundarios inmunogénicos causadas por la expresión de proteínas virales 5-8.

Sin embargo, el protocolo descrito aquí es más tiempo ytrabajar intensivo que para otros vectores virales como LV- o AAV-vectores, así como de primera o segunda generación ADVS. Un obstáculo importante es la clonación de grandes transgenes y la posterior transferencia al plásmido la producción de virus PADV-FTC. El uso de endonucleasas de la vivienda PI- Sce I y I- Ceu Ofrezco inserción precisa y dirigida del transgén de la lanzadera de plásmido pHM5, pero tienen la desventaja de que se pega fuertemente a la DNA escindido. Por esa razón muchos pasos de limpieza fenol-cloroformo son necesarios en la preparación de plásmidos e insertar-DNA durante el procedimiento de clonación. Por lo tanto, siguiendo rigurosamente el protocolo de clonación siempre es estrictamente recomendable. Después de clonar el genoma HCAdV se libera de la pAdFTC plásmido mediante la enzima de restricción Not I digerir y posteriormente se transfectaron en la línea celular productora. Tenga en cuenta que la eficiencia de transfección iniciales son cruciales para lograr la amplificación de virus suficiente. Es importante destacar que, el protocolo ofrece varios pasosa partir del cual el procedimiento se puede reiniciar en caso de pasos posteriores fallan. Durante pre-amplificación de un tercio de los lisados ​​se puede almacenar como copia de seguridad para iniciar el proceso desde ese punto de nuevo o para acortar una repetición en caso de que más virus necesita ser producido.

HCAdV llevar grandes, complejas o varios transgenes o cierta ADN de relleno puede ser amplificar más lenta de lo esperado. Por lo tanto, es crucial seguir cuidadosamente el proceso de pre-amplificación antes de cultivo en suspensión se cultiva en un matraz de agitación. Si pre-amplificación no tiene éxito, el procedimiento debe ser detenido y comenzó desde el principio otra vez. Si pre-amplificación es ineficiente, pases adicional puede ser necesaria hasta que la cantidad de virus es lo suficientemente alto como para infectar a las células cultivadas en un matraz de agitación de 3 l. Como una alternativa al cultivo en suspensión en un matraz de agitación, de 20 a 30 placas de cultivo de 150 mm de tejido se pueden utilizar para el paso final. Sin embargo, esto puede ser más tiempo y trabajo intensivo.

Para las mediciones de qPCR gDNA o bien se puede purificar a través del protocolo mencionado aquí o cualquier kit disponible comercialmente para el aislamiento de gDNA de las células cultivadas. Mediante el uso de kit disponible comercialmente el protocolo se puede acortar un día, pero una porción variable de las copias del genoma HCAdV que están presentes en las células infectadas se puede perder durante la purificación, dependiendo del kit utilizado. Por lo tanto genomas HCAdV serán ligeramente subrepresentados en los siguientes mediciones q-PCR en comparación con el método presentado en el paso 7.4).

Obtetítulos infecciosos totales definidos en una preparación de vector final derivan de gama matraz de un spinner de 1 x 10 10 a 5 x 10 11 partículas infecciosas. Esta cantidad es suficiente para llevar a cabo numerosos experimentos in vitro. Dependiendo de las células diana, también varios experimentos in vivo puede llevarse a cabo. Por ejemplo, para lograr suficiente transducción de hígado después de la administración sistémica se necesitan 1 x 10 9 partículas infecciosas.

En resumen, la amplia tropismo celular y la posibilidad de producir adenovirus modificado de la cápside-junto con el perfil de seguridad mejorado de HCAdV vectores desprovisto de todos los genes virales hacer que estos sistema de vector HCAdV una herramienta de gran valor para aplicaciones terapéuticas de genes.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

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References

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