Microbead Implantation i zebrafisk embryot

1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den zebrafisk har blivit en värdefull genetisk modellsystem för studier av utvecklingsbiologi och sjukdomar. Zebrafisk delar en hög grad av genom-bevarande, liksom likheter i cellulära, molekylära och fysiologiska processer, med andra ryggradsdjur inklusive människa. Under tidig ontogeni, zebrafisk embryon är optiskt transparenta, vilket gör att forskare att visualisera dynamiken i organogenesen med hjälp av en enkel stereo. Mikrokornet implantation är en metod som gör det möjligt för vävnad manipulation genom ändring av faktorer i lokala miljöer. Detta gör det möjligt för forskarna att analysera effekterna av ett obegränsat antal signalmolekyler av intresse, såsom utsöndrade peptider, vid specifika rumsliga och tidspunkter inom det växande embryot. Här har vi detalj ett protokoll för hur man manipulerar och implantat pärlor under tidig zebrafisk utveckling.

Introduction

Utvecklingsbiologi forskare använder ett brett spektrum av cellulära, molekylära och genetiska metoder för att avslöja de mekanismer som styr hur en organism formas. Bland dessa metoder är vävnad manipulation ett viktigt verktyg för att dechiffrera komplexa frågor om cell öde, cellrörelse, och organisationen av vävnader. Ett sätt att ändra lokala vävnadsmiljöer är genom den kirurgiska tillämpningen av mikrokorn som används för att leverera en fokal källa av proteiner eller andra signalmolekyler 1. Denna typ av experimentell manipulation har i stor utsträckning genomförts i klassiska ryggradsdjur embryologi modeller, såsom grodan och chick 2.

Den zebrafisk har blivit en viktig ryggradsdjur modellorganism för studier av organogenesen och ger också många unika fördelar för sjukdom modellering 3-5 som de delar med hög genetisk bevarande med människor 6. I synnerhet den optiska transparens och exinterna utvecklingen av zebrafisk embryot ger en oöverträffad synvinkel för observation av vävnad ontogeny 3-5. Genomförandet av storskaliga framåt genetiska skärmar har genererat en kraftfull slutförvar av zebrafisk mutantstammar för vidare studier 7,8, och identifieringen av alternativa screening tekniker som effektivt kan genomföras vid förminskad skala i enskilda laboratorier 9,10. Ytterligare experimentellt arbete med zebrafisk har underlättats genom framsteg inom transgena metoder och omvänt genetiska metoder 11,12, samt kemisk genetik 13-15.

Vävnads manipulation tekniker, såsom genomförandet av mikropärlor, inte har varit så stor utsträckning används i zebrafisk, men ändå ge ett användbart verktyg för att ytterligare förstå cellsignalering under utveckling. Mikrokorn implantering har använts för att förhöra processerna för organbildning i zebrafisk näthinnan16,17, hjärta 18, hjärna 19-22, neurallisten 23 och fin 24,25. I dessa och andra studier har pärlor använts under utveckling för att förstå spridningen av signalmolekyler 26, hur övertoningar påverkar cellmigration 27 och axiell mönstring 28. På senare tid har mikropärlor använts för att utvärdera regenereringsmekanismer i zebrafisk vuxna 29. I utvecklingsstudier, till exempel, har zebrafisk microbead arbetsuppgifter som insikter mekanismerna för lem bildning genom studier av bröstfenan 25. Zebrafisk bröstfenan knopp är homolog med forelimb knopp i musen 30 och fågelunge 31. Den ryggradsdjur lem knopp har två viktiga signalnoder: zonen för polariserande aktivitet (ZPA) som fastställer den främre till bakre axeln genom uttrycket av Sonic hedgehog (Shh) och nedströms Hox genmål,och den apikala ektodermala åsen (AER) närvarande vid spetsen av lemmen knopp, som verkar för att etablera proximalt distala identitet av lemmen genom expression av fibroblasttillväxtfaktorer (FGF). Genom att implantera Fgf indränkta mikropärlor i zebrafisk Shh genetiska mutanter, utredare identifierade Fgf som avgörande för utvecklingen av cellcykeln och tillväxt av ryggradsdjur lem 25. Förutom den FGF och Shh signaleringskaskader som etablerar positions identitet, banbrytande studier med chick extremitetsanlag identifierad retinoinsyra (RA) som en molekyl som kan härma verkan av den polariserande regionen att upprätta främre till bakre identitet 32. Dessa experiment inblandade placera små remsor av RA-indränkt Whatman papper i chick lem att bedöma siffra mönstring 32. Vidare har forskare utfört andra eleganta studier som utnyttjar användningen av mikropärlor, celltransplantation och exogenaRA behandlingar i zebrafisk att fastställa att RA verkar för att ge långväga positions ledtrådar inom zebrafisk bakhjäman och mesoderm 28. För närvarande är dock många frågor kvarstår om roller signalering faktorer som Fgf och RA under många aspekter av ryggradsdjur utveckling. De signal effekterna av RA, i egenskap av en morfogen, påverka många organ 33, såsom utvecklings hjärtat 34 och njur stamceller, där RA anger proximala njurceller typ öden 35-39. Ytterligare förståelse för sådana frågor skulle ha stor nytta av experimentella studier med hjälp av vävnad manipulation och mikrokornet implantation tekniker.

Medan färre studier har utförts med microbead implantation i zebrafisk, jämfört med modeller som ungen, de som har genomförts har varit mycket informativ. En orsak till bristen på mikrokorn implantering baserad-forskning i zebrafisk embryot är likely uppfattningen att det finns svåra tekniska utmaningar, baserat på storleken av embryot, som utgör ett hinder för att framgångsrikt utföra sådana manipulationer. Däremot kan microbead implantation i zebrafisk embryon läras med praktik och stöd genom visuell observation av tekniken, och därmed kan drivas som ett sätt att förhöra de mekanismer för utveckling. Här visar vi den exakta tillämpningen av en mikropärla in i zebrafisk embryot, som kan utnyttjas för utförande av en mängd olika analyser på vävnadsbildning och cellulär morfogenes.

Protocol

Procedurerna för att arbeta med zebrafisk embryon som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame.

1. Ringer-lösning Framställning

  1. Gör en lösning av 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl2, och 5 mM HEPES med ultrarent H2O genom ständig omröring för att undvika saltutfällning.
  2. Efter tillsats av salter och medan lösningen fortfarande omrörning, tillsätt 100 enheter / penicillin per ml och 100 ug streptomycin per ml.
  3. Efter tillsats alla antibiotika och salter, utföra filtersterilisering av lösningen och förvara i sterila behållare.
    Anmärkning: N-fenyltiokarbamid (1-fenyl-2-tiourea) eller PTU kan läggas till Ringer-lösning för att blockera bildningen av pigment i bead implanterade embryon utan negativa konsekvenser för embryo hälsa. För att förbereda Ringers / pigmenteblockeringslösning, använd en koncenttion av 0,003% PTU. På grund av den låga koncentrationen av PTU som ska läggas det rekommenderas att en större volym av Ringers lösning göras, åtminstone 1 L, för att undvika att lägga minimala mängder PTU pulver. Lägg PTU under steg 1,2, medan lösningen omröring.

2. Tricaine Lösning Beredning

  1. Lägg 2 g etyl-3-aminobensoat metansulfonatsaltet (Tricaine) per liter lösning plus 0,1 M Tris, från en 1 M stam balanserad till ett pH av 9,5 och görs med ultrarent H2O
    Obs: Tricaine kommer att användas för att avliva de zebrafisk embryon vid önskad tidpunkt för att analysera pärla implantation fenotyper.

3. E3 lösning Förberedelse

  1. Gör en lösning av 0,25 M NaCl, 10 mM KCl, 12,5 mM CaCl2, och 16,6 mM MgSO 4 till 1 L av ultrarent vatten för att skapa en liter E3.
  2. Lägg 200 pl av metylenblått till E3-lösning för att hämma svamptillväxt.

4. Dra Nålar för mikrokorn Transfer

  1. Använd brand polerat borsilikatglas med glödtråd vid en OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, med en längd av 10 cm.
  2. Placera borosilicated glas i en mikropipett avdragare för att förbereda fina nålar.
    Obs: Följande fyra dimensioner kan användas som en utgångspunkt för att dra nålar: Värme = 540, Pull = 245, Velocity = 200, och tid = 125.
  3. Efter att dra ett tillräckligt antal nålar, butik i täckta plastpetriskålar, placerade på remsor av modellera eller tejp för att förhindra att bryta nålspetsen, fram till användning.
  4. För att trimma nålspetsen till den önskade hålstorlek, använda ett par fin pincett för att poängsätta änden av nålen.
    Obs: Nål hålstorlek kommer att variera beroende på vilken mikrokornet storlek utnyttjas liksom användarhanteringspreferenser. En bra utgångspunkt är att hantverk hålstorlekar i ett intervall mellan 100 och 200 nm om mikropärlor som sträcker sig från 50 till 100 um kommer att utnyttjas.
  5. Prior att använda, sätter den beskurna nålen i kapillärrör innehavaren till mode den färdiga mikrokornet överföringsinstrument.

5. Whisker / Lash Tool Förberedelse

  1. Skaffa ett morrhår, piska, eller annan liten men fast bit av naturliga eller syntetiska hår filament. Klipp nära basen av tråden vid en 45 ° vinkel. Fäst morrhår till ett P-1000 mikropipett spets med hjälp av permanent klart lim.

6. mikrokorn Implantering fack Framställning

  1. Blanda 2 g agaros med 100 ml av E3-lösning för att göra en 2% E3 agarosgel.
  2. Värm 2% agaros-lösning under 1 min och 30 sek i en 250 ml Erlenmeyer-kolv, virvlande kolven varje 30 sekund, för att undvika att gelén från att bubbla över.
  3. Ta locket på en 60 mm x 15 mm petriskål och placera den i en större 150 mm x 15 mm skål med det inre vänd uppåt.
  4. Häll den heta agarosgel i 150 mm x 15 mm petriskål, och se till att förankra nerlocket på mindre skålen med pekfingret.
    Obs: Låt ett tunt lager av agaros under locket på mindre skålen för att avlägsna kondens som bildas när du häller gelén; detta kommer att göra pärlorna lättare att se under en dissektion mikroskop.
  5. Som agarosen svalnar, men innan det stelnar, placera en väl mögel på gelén. Detta kommer att möjliggöra enklare placering av embryona.
  6. Notera: För att undvika bubblor i brunnarna, placera formen långsamt i en vinkel tills den flyter på toppen av gelén.
  7. Med hjälp av en microspatula, försiktigt bort väl mögel när gelen har stelnat. Lägg till E3-lösning och förvara vid 4 ° C.

7. embryosamlings

  1. Förbered parningskammare, åtskilda av avdelare, genom att fylla upp dem med Vattenanläggning, och sedan placera vuxna zebrafisk hane (s) och kvinnliga (s) par i kamrarna O / N.
  2. Samla befruktade ägg med en fin trådnät sil (embryonala stadier kommer att variera något).
  3. Sätt in de befruktade äggen i en ren, 10 cm petriskål diameter genom att vrida silen upp och ned och skölja det med en fin ström av E3 tills det inte finns några ägg kvar i silen, och där ungefär 25 ml av E3-lösning i skålen.
  4. Efter insamling, dela äggen i flera rätter (ca 50-60 ägg per fat) för att undvika trängsel, vilket kan leda till utvecklingsomvandlare i kopplingen och gör samla önskade tider poäng svårt.
  5. Inkubera embryon i E3-lösning vid 28,5 ° C för att möjliggöra utvecklings bedömning enligt standarden zebrafisk iscensättning serie 40.
    Obs: De embryon bör överföras till E3 / PTU vid 24 timmar efter befruktning (HPF) för att förhindra pigment utveckling om manipulationer på äldre stadier kräver optisk klarhet.

8. Bead Implantation

  1. Inkubera mikropärlorna i önskad testmolekyl koncentration eller motsvarande fordon solution för önskad tid i en lämplig volym.
    Obs: Forskaren kan använda sterila petriskålar som sträcker 3-6 cm i diameter, eller flerbrunnsplattor, av vilka båda möjliggör visualisering av mikropärlorna i lösningen. Tiden kan variera beroende på typ och mängd av molekyl av intresse, och forskaren bör avse tillverkaren eller publicerade rekommendationer för längden av inkubationstiden och andra aspekter såsom känslighet för ljus och temperatur.
  2. När embryona har nått önskad utvecklings tidpunkt, ta bort embryon från sina chorions med fin pincett.
  3. Inkubera embryona i den filtrerade Ringer-lösning med antibiotika för 10 min för att acklimatisera dem till lösningen.
  4. Medan embryona acclimating, överför mikropärlorna i mikrokornet plattan inbäddat i implantation brickan och skölj dem i Ringer-lösning under 10 min.
    Observera: Implantera pärlorna inom 50 minuter efter att ha nått denna punkt. Denna viktsjuk minska sannolikheten för att en kommer att implantera en vulst med en mindre koncentration av molekylen av intresse.
  5. Array embryon till brunnarna i microbead implantation facket, var noga med att orientera dem så intresseområde där microbead ska implanteras är tillgänglig.
  6. Gör ett litet snitt på embryot med användning av volfram nål.
  7. Överför en mikropärla på embryo med hjälp av mikrokapillär överföringspipetten: deprimerande lampan av pipetten försiktigt dra microbead i kapillärkolonnen och släpp sedan trycket att överföra microbead på önskad destination.
  8. Använd whisker / frans verktyget för att placera mikrokornet inuti embryot. Obs: Var noga med att placera microbead i vävnaden bort från platsen för snittet så microbead inte kommer att avvisas från embryot som det läker.

Representative Results

Flera typer av manipulation verktyg är användbara för att hantera mikropärlor under forskningsansökningar (Figur 1). Dessutom kan en enkel agaros mögel med små brunnar användas för att hålla zebrafisk embryot, vilket är nödvändigt för att utföra dessa experiment i ett snabbt och effektivt sätt (Figur 1). Implantation av en mikrokorn kan utföras vid den rumsliga positionen och tids skede av intresse, vilket gör det möjligt för forskare att minska ett specifikt fönster handlingsprogram för molekylen av intresse.

Här har enskilda mikropärlor implanteras i zebrafisk embryon på svansen knoppstadiet eller vid senare tidpunkter under somitogenesis steg (Figur 3). Två olika stora mikropärlor, sköljdes med Ringer-lösning ensam, användes i detta protokoll demonstrationen (figur 3A, 3B och 3C). Denna mikrokornet implantation i frånvaro av någon konjugeradsmå molekyler visar att pärla implantation kan uppnås utan brutto morfologiska effekter under en sund utveckling av zebrafisk embryot (Figur 4).

Den experimentalist kan stöta på svårigheter med att manövrera microbead i punktionshålet som gjorts av en volfram nål ovanpå embryot. För att uppnå bättre hantering av mikrokorn gång placeras på embryot av mikro nålen, kan användas ett morrhår / lash verktyg. Detta kan vara utformad med naturligt skjul kattdjur eller hund whiskers, även om andra naturliga eller syntetiska lash filamenten kan utnyttjas (Figur 1). Ett lätt tryck av mikrokornet med antingen volfram nål eller morrhår verktyget bör se mikrokornet sjunka ner i Ringers lösning av formen. När mikrokornet har sjunkit i formen det bör flyttas långa sträckor vid behov med hjälp av volfram nål och en gång på toppen av embryot nålen eller morrhår verktyg kan användas till positioneringn mikrokornet i embryot. Framgången med mikrokorn implantering omedelbart kan mätas genom visualisering vid ett stereomikroskop, eftersom vulsten förblir stabilt positionerad i vävnaden. För att utvärdera pärla position över tid, kan varje embryo prov avbildas via live tidsförloppet fotografering eller kontrolleras med jämna mellanrum (som visas i Figur 4) för att säkerställa att pärlan platsen inte har skiftat under hela experimentet på grund av endogen vävnad morfogenes. Förstå ställning pärla över tid är avgörande för den mest informerade tolkning av resultat, såsom att utvärdera effekten av en liten molekyl på en målvävnad eller utvecklingsprocess.

Användningen av dessa ovanstående steg kommer att ge en perfekt miljö att imbed mikrokulor i zebrafisk embryot vid en önskad tid och placering. I vår erfarenhet, nybörjare i denna microbead implantation protokoll fick typiskt skicklighet nevändig för att utföra konsekvent kirurgisk implantation av mikrokulor i zebrafisk embryot efter ungefär en vecka praktik.

Figur 1
Figur 1. Verktyg som används för att utföra microbead implantation. (A) pärla implantation facket (vänster, 15 cm i diameter) med embryo formar (till vänster) och en microbead inkubation fack (till höger, 6 cm i diameter). Detta arbets fack gör det möjligt för forskare att placera embryon i önskad riktning för mikrokorn implantation, och att ha de preparerade mikropärlorna för implantation i närheten vid mikroskopet stationen. Mikropärlor bör inkuberas i liten molekyl (er) och / eller fordonet och sedan sköljas i en separat microbead platta (till höger) innan du placerar dem i pärlan implantation fack som är placerat under mikroskop stationen. (B) Två par fin pincett kommer att användas för att ta bort choripå omger varje zebrafisk embryot och också att bryta slutet av mikrokapillär nålen. (C) En volfram nål kommer att användas för att göra en mycket fin punktering i zebrafisk embryot på sig att placera microbead. (D) Den mikrokapillär överföringspipett kommer att användas för att plocka upp och placera en mikropärla ovanpå zebrafisk embryot nära platsen för punktering. (E) Den morrhår / lash verktyg gör det möjligt för milda positioneringen av mikrokornet i snittet plats inom embryot som tidigare gjordes av volfram nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Schematisk av mikrokornet implanteringsproceduren. (A) En microbead implantation bricka med mikropärlor soaking i önskad tvättlösning är som inrättats genom en stereostation, och embryona placeras med vävnad uppåt. (B) med hjälp av en volfram nål, kan ett litet snitt i embryot göras med en liten men ändå kraftfull rörelse. (C) med hjälp av en mikrokapillär överföringspipett, kan den önskade microbead hämtas från microbead inkubationskammaren i magasinet, som ligger på höger sida, och förde till vänster utrymmet där embryot arbetsområdet ligger. Den mikrokorn skall deponeras nära platsen för snittet, sedan försiktigt placeras i snittstället gjorts av volfram nålen med hjälp av whisker / frans verktyg. När en mikropärla manövreras in i snittstället bör det stoppas in i vävnaden (bort från snittet) att stabilt placera mikrokornet och förhindra efterföljande rörelse ut av embryot som utvecklingen fortsätter. Pleasa klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. mikropärlor kan implanteras i embryon i olika utvecklingsstadier. (A) Zebrafish embryon implanterades med en mikropärla (diameter av ungefär 50 | j, m) in i stammen vid svansknoppstadiet. Vid undersökning på posten pärla implantatet 24 h (hpbi) hade embryona utvecklats normalt och microbead visade minimal rörelse under tidens utvecklings tid. (B) zebrafisk embryon implanterade med mikropärlor (med en diameter av ca 50 | j, m) in i gulesäcken vid 3 somit steget (ss) visas normal utveckling med relativt liten pärla rörelse över tiden. (C) Större mikropärlor (diameter på cirka 70 pm) implanterades i 7 ss embryot liknande visade normala efterföljande utveckling, liksom minimal om varje förflyttning från implantationsstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Brutto utveckling av zebrafisk embryot är ostörda av närvaron av en mikrokorn genom 72 hpbi. Zebrafish embryon implanterades med mikropärlor indränkt i Ringers lösning (med en diameter av ca 50 | j, m) vid 7 somit steget (ss). Varje mikrokorn kirurgiskt in i stammen, mellan somites 3 ​​och 4. Förekomsten av pärlan var inte förknippad med uppenbara utvecklingsdefekter på 24 timmar efter pärla implantat (hpbi), 48 hpbi, eller 72 hpbi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Under det senaste århundradet har förståelse för kropp plan mönstring och organ genomgått monumentala framsteg. Vävnadsmanipuleringstekniker var avgörande för att avslöja viktig information om dessa viktiga processer. Genmodifiering är en av de vanligaste metoderna för att fastställa genfunktion, och metoder för mosaik analys, såsom celltransplantation, ger användbara metoder för att förstå autonomi av geners funktion. Microbead implantation ger en annan plats att förhöra hur vissa molekyler förändrar utvecklings dynamik, eftersom denna metod gör det möjligt för forskare att ändra en lokal vävnadsmiljö genom att införa signalmolekyler eller hämmare. En rad olika mikropärlor är kommersiellt tillgängliga, som har varierande storlek och andra fysikaliska egenskaper existerar (t.ex., laddning), så att de kan användas för att för de experimentella betingelserna av intresse. Således, genom att implantera mikropärlor som dränkts i ett protein eller kemical av intresse inom en organism, kan forskarna undersöka lokaliserade effekter under utveckling och hitta samband mellan genen eller molekylen av intresse och särskilt biologiska fenotyp (er).

Studier som en utförs av Wada och kollegor använde microbead implantation för att bedöma effekten av ökad Hedgehog-signalering i skelett mönstring i den främre neurocranium (ANC) i zebrafisk 23. Tidigare studier har visat att Shh är nödvändigt för ANC bildning 14. Använda Shh-belagda mikrokulor forskare upptäckt att denna signal främjar broskbildning i ANC. Den mikrokornet implantationsprocessen användes för att visa en tydlig koppling mellan Hedgehog-signalering och broskbildning i ANC. Ett annat viktigt exempel på denna vävnad manipulation teknik zebrafisk har observerats i studier där forskare undersökt transkriptionskontroll av Erythroblastoma tjugosex (ETS) domän faktörer ETS-besläktad molekyl (ERM) och polyomaförstärkaren aktivator 3 (Pea3) av Fgf signalering under tidig zebrafisk hjärnans utveckling 19. Genom microbead implantation experiment, kunde de visa att FGF8 och Fgf3 ectopically kan aktivera uttryck för erm och pea3. Dessa exempel illustrerar användbarheten av mikrokulor för att ge insikter i de utvecklings mekanismer som samverkar under vävnadsbildning, som kan vara väl kännetecknas av användningen av metoder för att bedöma genuttryck 41. Sålunda kan mikrokorn transplantation vara en genomförbar metod för att utforska andra vävnader, såsom det mellanliggande mesoderm (IM) som ger upphov till njuren. Specifikt, skulle det underlätta njurutvecklingsstudier, för att undersöka hur olika molekyler påverkar nephron segmente 42 och tubulogenesis 43,44, processer som bara ytligt förstås för närvarande. Vidare har mikrokorn implantering börjat användas till avely regenereringsprocesser i zebrafisk 29] och kan anpassas för användning med valfritt antal organregenereringsmodeller, såsom följande laserablation av embryonala vävnader som nefronet 45 eller i samband med metoder som har tagits fram för att utföra forskning med motsvarande vuxna strukturer 46-49. Slutligen har microbead implantation potential att användas i modeller av mänskliga sjukdomar, såsom cancer 50,51 eller vävnadsdegenerering 52,53.

I det nuvarande protokollet visar vi metoden för mikrokorn implantation i zebrafisk embryon, som också har liknande beskrivits av andra forskare, men inte visas genom video protokoll 1. Med minimal praktiken kunde vi att implantera mikropärlor med en ungefärlig hastighet på 8-10 embryon / h, vilket avser genomförbarheten av detta förfarande när forskaren har viss erfarenhet. De resultat som visas häri visar att pärlor av olika dimensions kan implanteras i tidiga skeden, och att med omsorg, kan denna vävnad manipulation teknik implementeras med minimal fysisk störning av embryot. En förbättring som bör betonas är användningen av en whisker / frans verktyget för att placera mikrokornet i embryot. Denna relativt billig och enkel utrustning är ungefär samma diameter som den mikrokornet, är lätt att få tag på och hjälper till att påskynda implantationsprocessen. Den whisker / lash kan kapas till en önskad längd för att producera ett fast men ändå känslig vulst-hanteringsverktyg, beroende på forskarens fingerfärdighet och preferens. Slutligen, medan vi beskrivit här hur man fysiskt manipulera mikropärlor och zebrafisk embryon för att utföra implantation, detta protokoll inte beskriva specifika hanteringsrutiner för olika läkemedel eller peptider. I allmänhet bör kemiskt behandlade mikropärlor implanteras i djuret med opportunism, för att undvika oönskade effekter i andra delar av organismen, och forskare bör vara väl ibildas om eventuella säkerhetsrisker i samband med sådana kemikalier innan inleda sina studier.

Sammanfattningsvis har vi visat en relativt enkel och effektiv microbead implantation metod med ett brett spektrum av tillämpningar som använder material som är lätt tillgängliga i labbet. I slutändan hoppas vi att denna manual kommer att hjälpa forskare med den känsliga naturen hos zebrafisk vävnad manipulation.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av NIH bidrag DP2OD008470.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250 ml Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. Nova Scientific Publishers. (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics