Un dispositif simple d'élaborer rapidement entiers Monts de l'intestin de souris

Medicine

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

Préparation montures entières de l'intestin grêle et le côlon de la souris pour l'analyse ou la quantification ultérieure peut être longue et difficile. Nous décrivons l'utilisation d'un dispositif simple de couper et les intestins 'roll' de la souris pour préparer rapidement les préparatifs entiers de montage de qualité supérieure et uniforme à ce qui peut être réalisé à la main. Le dispositif comprend une base qui contient 4 tiges en acier inoxydable et une partie supérieure, qui sert de guide de coupe. Les tiges sont insérés dans le lumen de l'intestin grêle [divisé en tiers] et le côlon. Les tiges et les échantillons sont ensuite placés sur un morceau de papier ou de carton filtre dans les fentes de retenue dans la base de l'appareil. La partie supérieure du dispositif est alors positionné et sert de guide de coupe. Les deux sections inclinées dans le centre de la pièce supérieure sont utilisés pour guider un couteau ou un scalpel et les intestins coupés longitudinalement sur la partie supérieure des tiges. Une fois les sections intestinales ont été coupés, le supérieur est retiré et la carte, tissue et les tiges délicatement retiré de l'appareil et placé sur le banc. Les tiges sont ensuite roulées délicatement sur le côté pour aplatir et coller les segments intestinaux sur la pièce sous-jacente de papier ou de carton filtre. La préparation finale peut ensuite être examinée et fixée ou stockée pour une analyse ultérieure. Les préparatifs sont très précieux pour l'étude des changements dans les modèles intestinales normales ou génétiquement modifiées souris. Les préparations ont été utilisées pour l'étude et la quantification des effets de l'inflammation (colite), des dommages, des lésions pré-cancéreuses (foyers de cryptes aberrantes (ACF) et mucine foyers (MDF) appauvri) et des polypes ou des tumeurs.

Introduction

La souris et la souris génétiquement modifiée 1-3 sont un modèle inestimable pour l'étude de diverses pathologies cancéreuses en particulier et de sa relation à l'inflammation dans le tractus gastro-intestinal. Cela nécessite souvent la préparation de supports entiers de l'intestin grêle et / ou du côlon.

La préparation des montures entières peut être fait avec une paire de ciseaux de décalage de précision, mais il peut prendre environ 20 minutes par souris 4. Ce ne sont pas très pratique pour des études comparatives, qui nécessitent une quantité importante de souris (disons 10 par groupe soumis à une analyse statistique). En outre, la longueur de temps nécessaire augmente le risque de dégradation tissulaire. Une tentative pour atténuer ce problème a conduit à l'essai de diverses aides à la préparation de coupe. Le premier a été basé sur une série de plaques de métal, avec des bosquets de coupe, mais les plaques occulté les tissus et la coupe était donc difficile à contrôler.

Un conventional crayon à six faces finalement fourni l'inspiration pour le dispositif de coupe, comme nous pourrions alors voir comment une forme de demi-crayon ferait un bon guide pour un scalpel (Figure 1). Cela a abouti à la conception d'un cadre avec quatre guides de coupe 5. L'efficacité de ce dispositif a été spectaculaire que les préparatifs de la figure 4 démontrent la différence entre la préparation de ciseaux et de la préparation de l'appareil.

Les sommets des dispositifs original a été construit à partir de plusieurs morceaux de métal, mais ceux plus tard, et le modèle actuel a été usiné sur un morceau solide de duralumin. La base a été usinée en résine haute densité plus haute qualité.

Le dispositif est avéré être d'une grande utilité pour la préparation de supports entiers de intestin de la souris car il accélère grandement et améliore la qualité et la cohérence des préparatifs, qui ont un large éventail d'applications.

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Protocol

Les différentes procédures expérimentales et l'euthanasie sont approuvés par le comité d'éthique institutions d'accueil et par les organismes de réglementation appropriés. L'euthanasie est normalement effectuée en utilisant CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale.

1. Dispositif

  1. Machine de la partie principale de la base de l'appareil à partir d'un bloc solide de résine acétyl-haute densité, tel que décrit dans ce manuscrit. A chaque extrémité de créer 3 mm de haut-élevé bandes, et une partie machine hors de ces 2,5 mm bosquets de prendre les tiges (voir la figure 2 et la figure 3).
  2. Assurez-barres de l'acier inoxydable d'un diamètre de 2,4 mm avec des extrémités arrondies.
    REMARQUE: Le cadre principal du couvercle a été usiné sur plaque de Duralumin. Un nombre limité de dispositifs finis sont disponibles à partir de Dr. Goodlad.

2. Utilisation du dispositif

  1. Disséquer l'intestin grêle et le côlon à partir de la cavité abdominale à l'aide de ciseauxet doigts gantés. Retirez le mésentère en le tenant avec des pinces courbes et en tirant doucement à l'écart de l'intestin.
  2. Rincer les intestins avec du phosphate froide saline tamponnée (PBS, pH 7,4) à l'aide d'une pipette de type Gilson, qui avait été coupé à son extrémité la plus large de sorte qu'il puisse tenir sur un raccord seringue en plastique de 10 ou 20 ml luer.
  3. Disposez l'intestin grêle (SB) sur une feuille de papier absorbant et diviser en trois parties égales en longueur (proximale, moyenne et distale - SB1, SB2 et SB3) en utilisant des ciseaux. Retirer le caecum et de jeter le côlon.
  4. Faire plusieurs très petites coupures dans les segments intestinaux avec des ciseaux pour permettre au fluide d'échapper et de placer une feuille de serviette en papier sur les intestins et doucement courir un doigt sur les préparatifs pour faire sortir le fluide et le sécher.
  5. Soulever les sections et insérer les tiges en acier inoxydable qui ont été précédemment mouillés par trempage dans un bêcher de solution saline tamponnée au phosphate.
    NOTE: L'intestin peut être enconverti si désiré (tourné à l'envers).
  6. Étiqueter un morceau de carton ou de papier filtre coupe à la taille pour tenir dans la base de l'appareil. Crayon est la meilleure, car elle est affectée par la quasi-totalité des solutions. Date de l'autopsie, code expérimental et le numéro d'identification des animaux sont suggérées.
  7. Placez la carte ou papier filtre dans la base de l'appareil. Insérer les tiges et les intestins dans les fentes de la base de l'appareil. Assurez-vous que l'extrémité proximale des segments est positionné de manière standardisée. Les extrémités proximales devraient être près les étiquettes de cartes.
  8. Placez la partie supérieure de l'appareil sur la base. Utilisez les barres obliques pour guider une lame de scalpel pour couper longitudinalement les sections.
    NOTE: Il aide si le tissu est doucement et soigneusement tenue avec un doigt pour veiller à ce qu'il ne se déplace pas avec le couteau.
  9. Retirer la partie supérieure de l'appareil. Retirez délicatement le papier et tissus filtre (toujours sur leurs tiges).
    REMARQUE: Un morceau de carton rigide placés sous le filpapier ter aidera levage.
  10. Légèrement humide (avec un doigt ganté trempé dans PBS) les segments. Rouler la tige, côté à l'autre d'ouvrir l'intestin et l'étaler à plat. Le tissu sera ensuite adhérer au papier filtre.
  11. Examiner visuellement les préparatifs pour des lésions macroscopiques.
  12. Transférer le tissu adhéré au papier filtre pour un bain peu profond (ou boîte à sandwich) contenant fixateur.
    NOTE: Après le tissu adhère à la papier filtre ou à la carte, il restera fermement attaché. Une large gamme de fixateurs peut être utilisé pour conserver la préparation. Il est recommandé que le liquide de Carnoy doit être utilisé pour l'étude des proliférations cellulaires intestinales 6, ce qui est idéal pour la fixation des meilleures méthodes de prolifération cellulaire; cependant la formaline ou d'autres fixateurs peuvent également être utilisés si d'autres paramètres sont nécessaires.
  13. Après fixation (généralement 3 h), transférer les préparatifs dans 70% d'éthanol. Les échantillons peuvent ensuite être stockés jusqu'à utilisation. Les préparations cun être étudié en visage et / ou utilisés pour la préparation des échantillons histologiques pour H & E ou d'autres techniques de coloration histologique, immunohistochimique et / ou hybridation in situ.
    REMARQUE: fixation prolongée peut réduire la réactivité immunohistochimique et / ou l'hybridation in situ réactivité. Boîtes à sandwich polypropylène sont idéales pour stocker un grand nombre de préparations.
  14. Si nécessaire les tissus fixés à partir des différents segments intestinaux peut être transformé en «roulés» et colorées avec toute la gamme des méthodes histologiques 6, y compris ceux décrits ci-dessus. Pour faire un 'roll suisse »les segments intestinaux sont retirés du papier filtre, enroulé autour d'un bâtonnet à cocktail ou un cure-dent, fixé avec une broche entomologique et traitée pour la cire intégrant 6.
  15. Si nécessaire, tacher le tissu en vrac avec du bleu de méthylène pour visualiser foyers de cryptes aberrantes 7.
  16. Note les préparations fixées auloisirs.

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Representative Results

Les polypes sont faciles à identifier sous un stéréomicroscope avec une source de lumière froide à l'autre illuminer le tissu (Figure 4). Il est utile de marquer la carte avec les marques de crayon quand un polype est observée afin que la notation peut être discuté plus tard et différents opérateurs peut parvenir à un accord. Le tissu peut également être teinté vrac [au bleu de méthylène] pour identifier les foyers de cryptes aberrantes 8 ou mucine foyers appauvri (MDF) 9 par l'éclairage par le dessus ou par illumination trans (Figure 5).

La localisation des lésions peut également être marqué sur une base de position 8. Pour ce faire, on a besoin de préparer d'abord une grille de 10 carrés dans un format de dessin à l'ordinateur, de copier plusieurs fois et puis étirez les plusieurs grilles à différentes tailles connues et imprimer sur une feuille d'acétate (voir Figure 6) [Intaglio est un outil utile et programme relativement simple pour ce faire]. On peut alors trouver une grille qui correspond à la l ONGUEUR de la section et l'utiliser pour marquer les événements d'intérêt.

Une fois marqué, tout ou partie du tissu peut être retiré pour une analyse plus approfondie ou des sections entières peut être enroulé dans un 'roll suisse »pour la coupe histologique. Bien que cette procédure a été décrit comme un défi technique 10 la nature plat et même des préparatifs rend cette procédure beaucoup plus simple. La préparation macro peut être utilisée pour marquer 'polypes macro »et les roulés utilisés pour marquer 11,12 (figure 7)' micro 'polypes.

Figure 1
Figure 1. Comment l'inspiration de l'appareil venait d'un crayon. Les discussions au sein de l'unité de plomb service biologique à l'idée d'utiliser une forme de demi-crayon pour agir comme un guide de coupe.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Photos de l'appareil d'origine. Le dispositif original a été construit à partir de plusieurs morceaux de métal, préparés à la main. (A) Le dispositif assemblé. (B) Le dessus de l'appareil a été enlevée pour montrer les tiges en position. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Photos du dispositif redessiné. (A) Le cadre principal du couvercle est usiné sur plaque de Duralumin. (B) la base (vu en noir)est constitué d'un bloc solide de résine acétyl-haute densité, ayant 4 tiges amovibles assis dans un canal. On a représenté un papier filtre (blanc) placé sur le dessus de la base (noir) (C) La position définitive du dispositif:. Le couvercle (A) est placé sur la partie supérieure du bassin (B). Dimensions en centimètres sont présentés. Les tiges étaient 2,4 mm de diamètre avec des extrémités arrondies. Voir référence 5 pour plus de détails. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. préparation de Gut fait avec décalage ciseaux et d'utiliser l'appareil. (A) Les intestins préparés en utilisant des ciseaux offset. (B) les intestins préparés avec le couteau de l'intestin montrant la même largeur tout au long de l'intestin et la meilleure présentation du tissu, ce qui rend le comptage et l'observation des polypes beaucoup plus facile. Modifié à partir de la figure 3 dans la prolifération cellulaire 6. Barre d'échelle avec l'unité est indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. foyers de cryptes aberrantes vus dans la montagne toute colon colorées au bleu de méthylène. Monter la totalité du côlon a été vrac coloré avec du bleu de méthylène pour identifier les foyers de cryptes aberrantes, représenté par des flèches. Barre d'échelle avec l'unité est indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. Modèle de feuilles d'acétate de notation de position. Différentes tailles de grille de 10 cases sont imprimées sur des feuilles d'acétate. L'intestin de coupe est mis sur la grille qui correspond à la longueur de la section, et les événements d'intérêt sont marqués, comme le nombre de comptage des lésions dans chaque carré. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. roulé d'un intestin grêle de souris H & E teinté. Le petit rouleau suisse intestin est montré à partir d'un Apc (Min / +) de la souris, un puits, caractérisé en modèle in vivo d'une tumeur intestinale genèse. Les flèches indiquent les adénomes représentatives. Barre d'échelle avec l'unité est affiché.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le dispositif accélère grandement le processus de sorte que deux opérateurs peuvent autopsie complète d'une souris dans 6 min. Cela inclura un contrôle visuel pour les lésions macroscopiques évidentes et de pesage et fixant les principaux organes. Il permettra également aux opérateurs de rincer, Blot et pèsent l'estomac, le caecum, l'intestin grêle et du côlon et de préparer l'ensemble des supports. Le tissu aplati peut être fixé très rapidement et ainsi éviter des artefacts de dégradation.

L'un des principaux avantages de l'appareil (à l'exception de la vitesse) est que le dispositif peut générer la production de bien meilleures préparations de qualité, ce qui rend alors l'analyse et la quantification ultérieure plus facile. En face notation est idéal pour la quantification des lésions cancérogènes et précancérigènes macroscopiques (telles que le nombre de polypes, le diamètre et le volume de la charge). Le même nature des préparations les rend idéales pour rouler plus tard en «roulés» et la coupe de telle sorte que l'analyse histologique de «micro pNuméro olyp 'peut également être quantifiée. Foyers de cryptes aberrantes et d'autres lésions pré-néoplasiques peuvent également être visualisés à l'aide l'ensemble des supports.

Les modifications inflammatoires dans divers modèles de colite peuvent également être observées en utilisant l'ensemble des supports.

En outre l'emplacement quantitative et spatiale de ces événements dans différentes régions de l'intestin peut être déterminée. Limitation de la technique est que l'utilisation de l'appareil nécessite une certaine dextérité, en particulier dans le ballon du tissu avec le scalpel. La plupart des opérateurs peuvent maîtriser la technique dans un court laps de temps après quelques minutes la pratique. Les préparations ne prennent que quelques minutes, mais de petits échantillons, si la préservation instantanée est requise peuvent être prises pour la fixation ou congelés, puis le reste du tissu préparé comme d'habitude.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
  3. Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
  4. Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
  5. Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
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  9. Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
  10. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
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