Protocole pour l'isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

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Biology

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Kegel, V., Deharde, D., Pfeiffer, E., Zeilinger, K., Seehofer, D., Damm, G. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J. Vis. Exp. (109), e53069, doi:10.3791/53069 (2016).

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Abstract

A côté hépatocytes parenchymateux, le foie est constitué de cellules non parenchymateuses (NPC), à savoir les cellules de Kupffer (KC), le foie des cellules endothéliales (LEC) et des cellules étoilées hépatiques (HSC). Deux dimensions (2D) culture de primaire hépatocytes humains (PHH) est toujours considéré comme le «gold standard» pour les tests in vitro du métabolisme des médicaments et l' hépatotoxicité. Il est bien connu que la monoculture 2D de PHH souffre de dédifférenciation et la perte de fonction. Récemment, il a été montré que hépatique NPC jouent un rôle central dans le foie (patho) physiologie et le maintien des fonctions PHH. La recherche actuelle se concentre sur la reconstruction de l' architecture in vivo dans des tissus en 3D- et co-culture des modèles pour surmonter les limites des monocultures 2D. Auparavant , nous avons publié une méthode pour isoler les cellules du foie humain et étudié l'aptitude de ces cellules pour leur utilisation dans des cultures cellulaires en biologie expérimentale et de médecine 1. Sur la base de l'intérêt général dans ce technique le but de cet article était de fournir un protocole plus détaillé pour le processus d'isolement des cellules du foie, y compris une vidéo, ce qui permettra une reproduction facile de cette technique.

des cellules hépatiques humaines ont été isolées à partir d'échantillons de tissu hépatique humain des interventions chirurgicales par une EGTA / P collagénase technique de perfusion en deux étapes. PHH ont été séparés de l'APN par une centrifugation initiale à 50 x g. Densité étapes de centrifugation à gradient ont été utilisés pour l'élimination des cellules mortes. populations de cellules hépatiques individuels ont été isolés à partir de la fraction enrichie NPC en utilisant les propriétés de cellules spécifiques et des procédures de tri des cellules. A côté de l'isolement PHH nous avons pu séparer KC, LEC et HSC pour plus de culture.

Pris ensemble, le protocole présenté permet l'isolement de PHH et NPC en haute qualité et la quantité d'échantillon de tissu d'un donneur. L'accès aux populations de cellules du foie purifiées pourrait permettre la création d'in vivo comme li humainemodèles de ver.

Introduction

un tissu de foie humain est très complexe et se compose de deux entités différentes de cellules, les cellules parenchymateuses et les cellules non parenchymateuses (CNP). les cellules hépatiques parenchymateuses comprennent hépatocytes et cholangiocytes. Hepatocytes représentent 60 à 70% des cellules hépatiques totales et représentent la majeure partie des fonctions métaboliques du foie, par exemple l' acide biliaire et de compléter la synthèse du facteur, la biotransformation et le métabolisme énergétique de 2,3.

La fraction NPC inférieure constitue 30 à 40% des cellules hépatiques totales. NPC comprennent les populations de cellules différentes, à savoir les cellules de Kupffer (KC), les cellules hépatiques endothéliales (LEC) et les cellules hépatiques étoilées (HSC). Cette fraction cellulaire hétérogène joue un rôle central dans les processus physiologiques du foie. En outre, NPC participer à la médiation des lésions hépatiques aiguës, par exemple, une lésion induite par le médicament foie (DILI), ainsi que des blessures chroniques du foie, comme la cirrhose 4.

Au cours des dernières années, hles cellules du foie Uman sont devenus de plus en plus essentiel dans la recherche et le développement du dépistage des drogues, le développement de médicaments et l'identification de nouvelles voies biochimiques dans les maladies du foie. Pour les tests in vitro monocultures PHH sont encore considérés comme le «gold standard» 5. La principale limite des modèles actuels de foie homotypique est dédifférenciation et la perte de fonction des hépatocytes en quelques jours 4. La mise en place de 3 dimensions techniques (3D) de culture a montré que ces limitations peuvent être compensées 4,6. Cependant, même les techniques de culture 3D modernes ne sont pas en mesure d'afficher tous les modes hépatotoxiques des actions 7. Disparues populations NPC dans les modèles in vitro existants sont discutés comme une raison possible de cet écart à la situation in vivo. Il a été démontré que la communication cellulaire entre les différentes populations de cellules du foie joue un rôle central dans l'homéostasie physiologique, mais aussi dans pathophysiologic traite 8. Par conséquent, l'attention scientifique se concentre de plus en plus sur les PNJ et leurs interactions cellule-cellule. Leur utilisation délibérée en co-culture et les systèmes de l' ingénierie tissulaire pourrait être une solution pour la forte demande des modèles in vitro du foie 8,9 qui sont aussi proches de la situation in vivo que possible.

Actuellement, le principal défi est le développement d'un modèle de co-culture de foie humain standardisé, qui contient des parties clairement définies de PHH et NPC. En conséquence, les techniques d'isolement des cellules hépatiques très hétérogènes sont nécessaires et celles-ci doivent être optimisés pour obtenir des populations cellulaires pures. Bien que des protocoles normalisés pour PHH isolement existent 10, l'isolement normalisé de NPC humaine est encore en développement. Protocoles d'isolement NPC plupart des publications sont basées sur des expériences avec des cellules non humaines 11,12. Seules quelques publications décrivent le processus d'isolement des PNJ humain et plus ne couvrent quedes procédés pour l'isolement d'une cellule de type 16/11. Les caractéristiques les plus importantes de cellules qui ont été mises à profit pour la séparation des cellules sont la taille, la densité, le comportement de fixation, et l'expression des protéines de surface. Sur la base de ces caractéristiques , nous avons développé un protocole simplifié pour isoler PHH, KC, LEC et HSC, qui a été publié précédemment dans la biologie expérimentale et de médecine 1. Étant donné le grand intérêt de cette technique, le but de cet article est de fournir un protocole plus détaillé du procédé d'isolement des cellules du foie, y compris la vidéo, ce qui permettra de reproduire la technique plus aisément. Le protocole comprend également des méthodes de contrôle de qualité pour l'évaluation du rendement et de la viabilité, ainsi que pour l'évaluation de l'identification et de la pureté en utilisant immunomarquages ​​spécifiques.

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Protocol

Remarque: Toutes les cellules ont été isolées à partir de tissu de foie réséqué non tumorales humaines, qui est restée après résection partielle du foie des tumeurs hépatiques primaires ou secondaires. Le consentement éclairé des patients a été obtenu selon les directives éthiques de la Charité - Universitätsmedizin Berlin.

1. Préparation des matériaux et solutions

  1. Stériliser tous les instruments et les matériaux à l'avance pour éviter la contamination bactérienne au cours du processus d'isolement.
  2. Préparer les solutions nécessaires pour la perfusion de l'échantillon de tissu hépatique, le processus d'isolement des hépatocytes et des cellules hépatiques non parenchymateuses et la culture des cellules primaires du foie humain selon les tableaux 1 et 2, à l' exception de la digestion, la solution qui est préparée fraîchement avant usage. Toutes les solutions peuvent être stockées à 4 ° C et il est recommandé de les utiliser dans les 4 semaines après la préparation.
  3. Stérilisertoutes les solutions en utilisant un filtre supérieur de 0,22 um bouteille.

2. Préparation de l'équipement Perfusion

  1. Installer l'équipement pour la perfusion et la digestion de l'échantillon de tissu hépatique comme représenté sur la figure 1A.
  2. Ajuster la température du bain d'eau à 39 ° C pour assurer une activité de collagénase P optimale au cours de la perfusion et de la digestion.

3. Perfusion et Digestion de l'échantillon de foie de tissus (1,5 h)

  1. Choisir un échantillon de tissu avec la capsule de Glisson intact à partir d'un tissu du foie réséqué. Lors de la coupe l'échantillon de tissu, essayez d'obtenir une surface de coupe petite avec de bons vaisseaux visibles. Éviter les temps d'ischémie chaude par le transport et la manipulation de l'échantillon de tissu de foie sur la glace jusqu'à la perfusion.
  2. Supporter le poids des tissus dans des conditions stériles et placer l'échantillon de tissu de foie dans une boîte de Petri dans l'écoulement d'air laminaire. Nettoyer la surface de l'échantillon de tissu avec une compresse stérile resang résiduel et rincer l'ensemble de la canule en utilisant 1x Perfusion-Solution I pour garantir que toutes canule étaient perméables.
  3. Utilisez de la colle de tissu pour fixer les olives des canules dans certains vaisseaux sanguins plus grands. Selon la taille de l'échantillon de tissu hépatique et le nombre de vaisseaux à la surface, utiliser une canule sertie de 3 à 8 canules. Test de la perfusion et vérifier les fuites. Fermer tous les vaisseaux sanguins qui fuient 1x Perfusion-Solution claire I, avec de la colle tissulaire.
  4. Placer l'échantillon de tissu de foie canulée dans l'entonnoir de Büchner sur son disque perforé du filtre (figure 1A).
  5. Régler le débit de la pompe péristaltique entre 7,5 ml / min et 14,6 ml / min en fonction du nombre de canules utilisées et de la résistance du tissu hépatique écoulement. Régler le débit à chaque fois afin d'assurer qu'il y ait une perfusion en cours, mais lent. Perfuser le tissu jusqu'à ce que le sang entier est rincé, mais au moins 20 min. Observer le tissu devient plus lumineux dans les zones avec de bonnes perfusisur.
    Remarque: Dans certains cas, il peut être nécessaire de bloquer l'un des canules avec des pinces en plastique ou pour augmenter la pression interne d'un espace en poussant doucement avec une spatule contre la capsule du foie, afin d'optimiser la perfusion. Un changement complet de la couleur à un jaune clair à la couleur brun clair indique une bonne perfusion.
  6. Changer le liquide de perfusion à la digestion, la solution contenant de la collagénase P (Tableau 1).
  7. Réorganiser la configuration (figure 1A) pour l'étape de digestion. Par conséquent réaliser un écoulement circulaire de la digestion, la solution selon la figure 1B pour un maximum de 15 min.
    Remarque: Il est essentiel d'arrêter la perfusion immédiatement lorsque l'échantillon de tissu du foie est suffisamment digéré. Une bonne digestion peut être observée, lorsque le tissu ne montre aucun signe d'élasticité tel qu'évalué par l'entretien des déformations de la capsule, lorsqu'elle est poussée avec une spatule.

4. Isolement des hépatocytes (1 h)

  1. Turn la pompe péristaltique hors tension et placer l'échantillon de tissu hépatique dans un plat en verre. Rincer à l'extérieur de l'échantillon de tissu avec de la glace froide Stop solution (Tableau 1). Retirer les canules de l'échantillon de tissu hépatique. Utilisation d'un scalpel pour ouvrir l'échantillon de tissu du foie, en incisant au milieu de la zone où les canules ont été attachés. Gardez les soins que la capsule Glisson's reste intacte.
  2. Rincer l'intérieur de l'échantillon de tissu, puis couvrir l'ensemble de l'échantillon de tissu avec de la glace froide Stop-Solution. Secouer doucement le tissu afin de libérer les cellules hors du tissu.
  3. Recueillir la suspension cellulaire et le filtrer à travers un regard entonnoir (entonnoir en plastique doublée avec de la gaze compresse) dans 50 ml tubes en plastique. Ajouter plus de solution Stop à l'échantillon de tissus du foie jusqu'à un volume final de 500 ml est consommé.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recueillir le surnageant pour l'isolement des cellules non-parenchymateuse plus tard. Laver le culot cellulaire avec du PBS (Figure 2A).
  5. Centrifuger à nouveau la suspension de cellules à 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recueillir le surnageant et remettre en suspension le culot dans du milieu d' incubation des hépatocytes (tableau 2, figure 2B).
  6. Déterminer le nombre de cellules et la viabilité de la suspension cellulaire obtenue en utilisant une coloration au bleu trypan. Comptez les vivants et les cellules mortes dans une chambre de comptage de Neubauer. Calculer le nombre de cellules, la viabilité et le rendement de PHH en utilisant les formules ci-dessous.

    Rendement (cellules comptées) = cellules comptées x facteur de dilution x volume de suspension de cellules (ml) x 10 000

    Rendement (hépatocytes / (g de foie, un échantillon de tissu)) = (rendement (hépatocytes / (ml support)) x volume de suspension de cellules (ml)) / (poids de l'échantillon de tissu du foie (g))

    Viabilité (%) = 100% x (nombre de cellules vivantes) / (nombre total de cellules)

5. Purification des hépatocytes (1 h)

Remarque: Cette étape de purification, il est recommandé, si la viabilitéest inférieur à 70%.

  1. Effectuez toutes les étapes de la glace. Préparer un gradient de densité de 25% par mélange d'une solution de gradient de densité de 5 ml et 15 ml de PBS pendant la centrifugation en gradient de densité.
  2. Mettez un maximum de 50 cellules Mio au total de la riche suspension de cellules hépatocytes soigneusement et lentement au - dessus de la couche de gradient de densité de 25% pour qu'une séparation claire des deux couches est atteint (figure 2C). Mettre les tubes avec précaution dans la centrifugeuse et centrifuger à 1.250 xg, 20 min, 4 ° C sans frein (figure 2D).
  3. Aspirer la suspension cellulaire restante, et les cellules mortes dans l'interphase. En fonction de la teneur en matière grasse peut également une Aspirer la solution à gradient de densité.
    Remarque: PHH avec une faible teneur en lipides forment une pastille dense et le gradient de densité peut être aspiré complètement. PHH avec forte teneur en lipides forment une pastille plus diffuse et beaucoup de cellules viables peuvent rester dans la solution de gradient de densité au-dessus du culot.
  4. Remettre en suspension les pastilles d'hépatocytes avec du PBS et on centrifuge à nouveau à 50 x g, 5 min, 4 ° C. Réunir les pellets, lavez à nouveau avec du PBS et remettre en suspension purifiée PHH en milieu hépatocytes Incubation. Effectuer le comptage des cellules comme décrit dans l'étape 4.6.

6. La culture des hépatocytes

  1. Préparer les boîtes de culture cellulaire pour l'ensemencement de PHH en les enrobant avec une matrice extracellulaire, par exemple du collagène de queue de rat (collagène de type I). Préparer du collagène de queue de rat selon le protocole établi par Rajan et al. 17
  2. Diluer la solution mère collagène de queue de rat 1: 200 dans du PBS. Transfert / cm solution 100 pi 2 de queue de rat de collagène dans les boîtes de culture, en prenant soin que toute la surface est couverte. Incuber la matière plastique de culture cellulaire pendant 20 min à température ambiante. Aspirer la solution restante de collagène de queue de rat.
  3. Seed 15 x 10 4 hépatocytes / cm 2 dans un milieu d' incubation des hépatocytes sur la culture dishes enduit de queue de rat collagène. Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant au moins 4 heures. Après 4 h les hépatocytes ont adhéré et le milieu peut être changé.
  4. Effectuer des enquêtes en fonction de la configuration expérimentale. Un temps de culture de 48 heures est recommandée pour permettre aux cellules de récupérer du processus d'isolement.

7. Isolement des cellules hépatiques non parenchymateuses (1,5-2 h)

  1. Centrifuger le surnageant ont été recueillies (étape 4.5 et 4.6) à 72 x g, 5 min, 4 ° C pour éliminer les globules rouges restants et les hépatocytes. Mutualiser les surnageants et centrifuger les deux pour obtenir deux culots cellulaires: 300 xg, 5 min, 4 ° C pendant la sédimentation des HSC, CEL et partiellement KC et 650 x g, 7 min, 4 ° C pendant la sédimentation du KC restant.
  2. Piscine des pastilles et re-suspendre dans HBSS. Préparer un 25% et une densité de 50% des gradients en mélangeant une solution à gradient de densité et du PBS pour un gradient de densité centrifugation (solution à 25% de gradient de densité: 5 solution à gradient ml de densité et de 15 ml de PBS, une solution de gradient de densité de 50%: la solution de gradient de 10 ml de la densité et de 10 ml de PBS, voir la figure 2). Placer la solution à gradient de densité de 25% avec précaution au-dessus de la couche à 50% de la solution de gradient de densité.
  3. Mettez la suspension NPC soigneusement et lentement au-dessus de la couche de 25% de la solution de gradient de densité de manière à une séparation claire des deux couches est atteint.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire sur le gradient de densité à 1800 x g, 20 min, 4 ° C sans freinage (figure 2.2).
  5. Aspirer Les cellules mortes et les débris cellulaires à partir de la couche supérieure. L'APN sont situés dans l'interphase entre la couche de gradient de densité de 25% et 50% (figure 2). Collecter NPC, les laver avec HBSS et centrifuger la suspension cellulaire appliquant l'étape décrite ci-dessus à double centrifugation (étape 7.2.).

8. Séparation des cellules Kupffer (AdhésionÉtape de séparation) (1 h)

  1. Effectuer une numération cellulaire pour le KC dans la fraction NPC comme décrit dans l'étape 4.6. (Pour apparition de KC en suspension voir la figure 3B). Centrifugeuse la fraction NPC avec l'étape de centrifugation double décrite ci - dessus (étape 7.2) et remettre en suspension le moyen NPC dans Kupffer cellulaire ensemencement (tableau 2).
  2. Graine de la fraction contenant KC sur les navires de culture cellulaire en plastique à une densité de 5 x 10 5 KC / cm 2. Incuber les cultures KC pendant 20 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. KC primaire adhérer sur les matières plastiques de culture cellulaire dans un court laps de temps (Figure 2.3).
  3. Recueillir le surnageant contenant pas adhéré NPC, composé principalement de LEC et HSC. Mutualiser les surnageants pour la séparation ultérieure du LEC (voir section 9) et HSC (voir section 10). Laver le KC adhérente avec HBSS et les cultiver dans Kupffer milieu de culture cellulaire (tableau 2) à 37 ° C, 5% CO2 dans un incubateur humidifié.

9. Séparation des cellules endothéliales (1,5 h)

  1. Centrifuger le surnageant recueilli (étape 8.5.) À 300 xg, 5 min, 4 ° C. Laver le culot avec du PBS. Après centrifugation à 300 xg, 5 min, 4 ° C re-suspendre les cellules dans Stellate cellules / Endothelial milieu de séparation cellulaire et effectuer un nombre de cellules pour toutes les cellules restantes comme décrit à l'étape 4.6.
  2. Re-suspendre 1 x 10 7 cellules Mio dans 1 ml de cellules Stellate / Endothelial milieu de séparation cellulaire, ajouter 20 ul de solution de blocage du MACS-KIT et 20 pi des perles CD31 Micro pour immunomarquage et incuber la suspension résultante pendant 15 min à 4 ° C la température (Figure 2.4).
  3. LEC séparée de HSC comme décrit dans le protocole pour le système Référence rechange de tri cellulaire activé magnétiquement MACS (Figure 2.5). Eluer retenu magnétiquement LEC CD31-positif et suspendre dans Stellate Cell / Endothelial milieu de culture cellulaire (tableau 2).
  4. Effectuer le comptage des cellules LEC comme décrit à l'étape 4.6. Seed LEC dans une densité de 1,25 x 10 5 cellules / cm 2 dans des récipients de culture cellulaire revêtus de collagène de queue de rat (voir étape 6.1). Cultiver les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.

10. Séparation des cellules étoilées (0,5 h)

  1. HSC non marqué passe la colonne de séparation MACS pendant la procédure. Recueillir la fraction HSC (voir l' étape 9.5, Figure 2.5). Effectuer le comptage des cellules comme décrit dans l'étape 4.6.
  2. Seed HSC avec une densité de 5 x 10 4 cellules / cm 2 dans des récipients de culture cellulaire revêtus de queue de rat collagène (voir l' étape 6.1) dans Stellate cellulaire / milieu de culture des cellules endothéliales (tableau 2) et les cultiver à 37 ° C, 5% CO 2 dans un incubateur humidifié.

"Tableau Tableau 1: Perfusion et d'une solution d'isolation.

Tableau 2
Tableau 2: Culture et isolement des médias.

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Representative Results

La séparation en une fraction du parenchyme et non parenchymateuse, en utilisant la centrifugation en gradient de densité comme une procédure de nettoyage combinée à l'utilisation des propriétés d'adhérence et MACS conduit à succès PHH et NPC isolement. PHH et NPC peuvent être isolés en haute qualité et la quantité. La figure 1 montre la configuration représentative de l'équipement pour la perfusion du foie et la digestion. 10% de FCS a été ajouté à la collagénase P contenant Perfusion - Solution II pour réduire l'activité protéolytique des protéases et de stabiliser l'activité de collagénase P en retour. En conséquence plus temps de digestion nécessaires à l'isolement NPC peut être appliqué sans un impact négatif sur la viabilité de PHH.

Figure 1
Figure 1:. Perfusion et l' installation de digestion La première étape de perfusion est effectuée en order pour éliminer le sang résiduel, chauffer le tissu et retirer Ca2 + pour dissoudre cellule-cellule à l'aide de connexions 1x Perfusions solution I (PI) (A). Remise en circulation de la solution Digestion-(DG) est réalisée pour la digestion du tissu hépatique pendant l' étape de perfusion II (B).

Figure 2
Figure 2:. Simplifié représentation schématique du processus d'isolement complet PHH et NPC modification de Pfeiffer et al 1, 2014 , avec la permission of Experimental Biology and Medicine.. Tout d' abord, l'échantillon de tissu du foie est perfusé et digérée par une EGTA / P collagénase technique de perfusion en deux étapes (A). La suspension cellulaire est centrifugée acquise initialement à 50 xg, 5 min, 4 ° C (B), pour séparer la plus grande PHH-fraction (culot) à partir du NPC-petite fraction (Supernatant). Dans le cas d'une viabilité PHH inférieure à 70%, la fraction viable PHH peut être enrichie par une centrifugation à gradient de densité à 1250 x g, 20 min, 4 ° C (C) , résultant en décantation du PHH au fond du tube, tandis que les morts les cellules de débris / de cellules sont situées au - dessus de la couche de gradient de densité (D). surnageants Collected de la centrifugation initiale (1) sont centrifugés en utilisant deux étapes: 1) 300 xg, 5 min, 4 ° C et 2) 650 xg, 7 min, 4 ° C. Après la première centrifugation KC sont en partie situé dans le surnageant. Dans ce contexte, la deuxième étape d'isolement est nécessaire. Les culots cellulaires obtenues sont rassemblées et remises en suspension dans du HBSS. Par la suite, la suspension de cellules sont soigneusement en couche sur le dessus de deux couches (25% / 50%) à gradient de densité. Les tubes à gradient de densité en couches sont centrifugés à 1800 x g, 20 min, 4 ° C (2). Les cellules mortes au-dessus de la couche à gradient de densité de 25% sont mis au rebut. NPC situé entre l'interphase de 25% et 50% dcouche de gradient de ensité sont recueillis et mis en commun. La fraction de l'APN est ensemencée sur des matières plastiques non revêtues de culture cellulaire. En utilisant un temps d'incubation de 20 minutes (adhérence étape de séparation) KC sont séparés des autres populations de cellules hépatiques (3). LEC et HSC sont séparés en utilisant le MACS-kit. Par conséquent, les autres cellules du foie recueillies dans le surnageant sont centrifugés à 300 xg, 5 min, 4 ° C, et sont marquées avec des microbilles CD31 conjugué (4). Seul CD31 négatif HSC passer la colonne MACS de séparation (5). CD31-positif LEC bâton à la colonne. Enfin , la colonne est retirée du dispositif magnétique et le LEC CD31-positives sont élues de la colonne (5). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'isolement PHH a montré un rendement de 14,2 x 10 6 ± 6,6 x 10 6 PHH viables / g de tissu hépatique et une viabilité d' environ 760,6 ± 4,2% (Tableau 3 1). Microscopiquement caractéristiques visibles étaient typiques d' un grand volume cytoplasmique en association avec les gouttelettes lipidiques et entre un et quatre noyaux (Figure 3A). La taille des cellules varie entre 20 à 30 um en suspension.

KC étaient de type cellulaire le plus courant dans la fraction NPC. On a isolé environ 1,9 x 10 6 ± 0,2 x 10 6 cellules viables / g de tissu hépatique KC avec une viabilité de 92,8 ± 3,5% (Tableau 3 1). KC sont de très petites cellules (environ 5 pm) avec un rapport cytoplasme / noyau bas et microvillosités sur la surface caractéristique (figure 3B).

Enfin, nous avons utilisé la technique MACS de séparation pour séparer CD31-positif LEC du reste CD31 négatif HSC. Le rendement du LEC était d' environ 2,7 x 10 5 ± 0,1 x 10 5 viable LEC / g livtissu er et la viabilité atteint était de 95,6 ± 2,8% (tableau 3 1). Les critères d'identification sont le granulae multiple et une taille d'environ 10 um en suspension de cellules (figure 3C), ainsi que la forme caractéristique de la broche après une courte durée de culture (figure 3G).

Le procédé d'isolement a donné lieu à un rendement HSC environ 4,7 x 10 5 ± 0,2 x 10 5 HSC viables / g de foie (N = 8) avec une viabilité de 89,6 ± 3,8% (Tableau 3 1). Microscopiquement caractéristiques identifiables ont une taille d'environ 20 pm et une apparence granulée typique avec une quantité variable de gouttelettes lipidiques (figure 3D).

Tableau 1
Tableau 3: Les rendements, la viabilité et la pureté de PHH isolée et NPC. Trois donneurs différents ont été évalués. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± écart-type. Ce tableau a été publié auparavant dans Pfeiffer et al. 1, 2014 et est reproduit avec la permission de la biologie expérimentale et de médecine.

Pour l'identification et la détermination de la pureté de la culture cellulaire, chaque fraction cellulaire isolée a été traitée avec des anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques d'un type cellulaire. Les cellules ont été traitées avec des anticorps secondaires fluorescents et examinées par microscopie à immunofluorescence. La pureté a été déterminée par comptage des cellules colorées fluorescentes positives par rapport au nombre total de cellules visualisées par coloration de Hoechst.

Après 24 heures de culture PHH a montré une forme polygonale caractéristique et souvent polyploïdie (Figure 3E). PHH étaient positifs pour CK 18 (figure 3I) et a montré une pureté de 92,3 ± 3,2%(Tableau 3 1).

KC a adhéré à moins de 20 min sur culture cellulaire surfaces en plastique. Après un temps d'incubation de petites cellules rondes 24 h avec un noyau de cellules rondes de premier plan ont été observées (figure 3F). La protéine de surface CD68 a été utilisée pour identifier KC (figure 3J). La pureté des cellules positives CD68 est élevé à 81,0 ± 5,4% (Tableau 3 1).

Malgré la séparation MACS utilisant un marquage CD31 lors de la séparation NPC, il était encore possible de tacher LEC isolée avec CD31. Par conséquent, le LEC isolé et cultivé ont été colorées avec CD31 pour l'identification et la détermination de la pureté. En outre LEC a montré une immunoréactivité pour le marqueur de cellules mésenchymateuses vimentine (Figure 3K). Nous avons observé environ 81,0 ± 1,7% des cellules colorées positives (tableau 3) 1. HSC avec leurs gouttelettes lipidiques proéminents typiques (figure 3H) ont été marquées par immunofluorescence pour GFAP (Figure 3L). HSC pureté était de 93,0 ± 1,7% (Tableau 3 1).

Chaque fraction de cellules a été de contraste avec d'autres marqueurs de l'APN. Toutes les fractions de cellules contenaient un petit nombre d'autres types de cellules spécifiques du foie, mais étaient négatives pour le marqueur hépatocytaire CK18 et CK19 le marqueur de cholangiocytes.

Figure 3
. Figure 3: La morphologie de l' homme et parenchymateuse cellules hépatiques non parenchymateuses en suspension et après l' adhésion La colonne gauche (A - D) montre les différentes populations de cellules hépatiques isolées , directement après le processus d'isolementen phase vue au microscope à contraste: PHH (A), KC (B), LEC (C), et HSC (D). La colonne du milieu (E - H) présente des images de isolé et cultivé PHH (E), KC (F), LEC (G) et HSC (H) après 24 h de culture (microscopie à contraste de phase). Caractérisation basée immunofluorescence-des différentes fractions de cellules est indiquée dans la dernière colonne: PHH a montré des signaux positifs pour le CK18 marqueur des hépatocytes (I, 24 heures après l' isolement), KC étaient positives pour le CD68 marqueur (J, 24 heures après l' isolement), LEC a montré des signaux positifs pour la vimentine (K, 72 heures après l' isolement) et HSC étaient positifs pour GFAP (L, 72 heures après l' isolement). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst; grossissement: 400X. Modifié à partir de Pfeiffer et al. 1, 2014 , avec la permission des experiencesBiologie imental and Medicine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole publié décrit une technique pour isoler pur PHH et NPC, à savoir KC, HSC et LEC, simultanément en haute qualité et la pureté du même échantillon de tissu de foie humain. La majorité des publications traitant des isolements de cellules hépatiques ne couvrent que l' un de ces populations de cellules 18-20 et les procédures d'isolement réalisées avec des tissus humains sont rares (examinés par Damm et al.) 21. Adaptation des méthodes établies avec les tissus des animaux (par exemple, le foie de rat) au foie humain a révélé plusieurs différences dans les propriétés cellulaires entre les populations animales et de cellules humaines. La mise en place d'un procédé d'isolation de cellules hépatiques couvrant les différentes populations de cellules du foie a révélé que la combinaison de l'isolement des cellules parenchymales et non-parenchymales est une étape critique en raison de la différence dans le temps de digestion nécessaire pour des résultats optimaux. Face à ce défi, nous avons développé un protocole d'isolement des cellules du foie combinant différentes techniques et adapté lese à notre protocole d'isolement PHH 10.

En plus de 10% de FCS à la collagénase P contenant Solution II, nous avons pu réduire l'activité protéolytique des protéases. Cette modification a permis de plus longs temps de digestion, nécessaires pour gagner un grand nombre de NPC. En conséquence, nous avons été en mesure d'isoler PHH ainsi que NPC de bonne qualité et en grande quantité. l'isolement des cellules du foie réussie dépend fortement de la qualité du tissu initial. Les données des donateurs et l'anamnèse peuvent influencer la qualité de la cellule et de la quantité. De notre expérience, il n'y a aucune corrélation avec des facteurs spécifiques de donateurs, ainsi que le personnel très expérimenté peut faire face à l'isolement cellulaire sans succès. Parce que la qualité du tissu du donneur est un point critique, toutes les sources externes, ce qui peut nuire à la qualité du tissu, doivent être réduits au minimum.

La plupart des facteurs critiques sont les temps d'ischémie chaude après l'intervention chirurgicale et les temps d'ischémie froide pendant le transport du tissu To laboratoire. En outre toutes les sources d'infections bactériennes doivent être évitées. Il est à noter que , parfois , l'organe lui - même peut contenir une contamination bactérienne, par exemple, en cas de maladies des voies biliaires. Les étapes critiques au sein de la procédure d'isolement couvrent les temps de perfusion et gradient de densité étapes de centrifugation. La première étape de perfusion doit durer 20 à 30 minutes. Réduction du temps de perfusion peuvent conduire à un décollement incomplet des contacts cellule-cellule conduisant à l'apparition d'amas de cellules dans la suspension cellulaire acquise. Une première perfusion prolongée réduit la viabilité cellulaire et induit un stress cellulaire due à l'épuisement Ca.

La deuxième étape de perfusion réalisée pour la digestion enzymatique des tissus nécessite une certaine expérience pour déterminer le degré de digestion optimale pour la prise de décision sur l'arrêt de la réaction protéolytique au point de bon moment. temps de digestion courts conduisent à des rendements faibles et des temps de digestion prolongée à la cellule stress et les dommages cellulaires.De notre expérience, le laps de temps entre le tissu non digérés et les tissus endommagés lors de la digestion se trouve souvent dans une fenêtre de 1-3 min. Une perfusion incomplète peut être contré en déplaçant la pression à l'intérieur du tissu dans une autre zone à l'aide des pinces pour pincer hors canules. En outre la pression douce à la spatule vers l'échantillon de tissu aboutit à une modification de la perfusion tissulaire. Le tissu est comprimé et la pression augmente intérieure. Par la suite, les vaisseaux sanguins sont également compressées et que leur rayon diminue. Avec une diminution de rayon, la résistance augmente (loi de Hagen-Poiseuille) et la solution de perfusion préfère la voie de moindre résistance et perfuse d'autres domaines. Conformément à l' Baccarani et ses collaborateurs , nous avons observé que le tissu fibrotique ou cirrhotique a besoin d' une plus longue période de digestion conduit à une baisse des viabilités cellulaires 22. Pour cette raison, nous recommandons d'éviter les tissus des patients atteints de fibrose du foie ou une cirrhose.

La préparation et lamanipulation des gradients de densité, ainsi que la récolte de cellules sur les gradients (voir l'étape 5 et 7) couvrent également les étapes critiques. Les différentes couches de gradient de densité et la suspension cellulaire doivent être transférés d'une manière lente et minutieuse pour la création d'interphases pointus. En outre, il y a toujours le risque d'endommager le gradient lors de la manipulation, en particulier pendant la récolte des cellules. Lors de la séparation NPC l'étape de séparation d'adhérence est cruciale pour obtenir des rendements plus tard et la pureté de toutes les fractions de l'APN. Pour augmenter le nombre de cellules de ne pas être respectées NPC et la pureté de KC une étape supplémentaire de lavage peut être utile. La solution de lavage de cette étape est mis en commun avec les surnageants pour une séparation supplémentaire de l'APN. Pour éviter la contamination par des bactéries, des champignons ou des virus conditions aseptiques strictes doivent être assurées 23.

En fonction des populations cellulaires nécessaires au protocole peut être modifiée et ajustée en sautant les étapes spécifiques. Par exemple, si seulement sont KCnécessaire l'étape consistant à double centrifugation NPC sédimentation peut être ramené à la deuxième étape de centrifugation et les étapes de séparation et de HSC CEL peut être supprimée. les temps de perfusion et la force g pour la centrifugation peuvent également varier en fonction de la qualité des tissus et des cellules. tissu fibrotique nécessite prolongé temps de digestion, par conséquent, il est nécessaire de contrôler soigneusement l'élasticité des tissus. L'accumulation de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes gras diminue la densité cellulaire et modifie donc les propriétés de sédimentation. Selon nos observations, il peut être utile pour ajuster la force g pendant PHH isolement en fonction de la teneur en lipides du PHH, lorsque de grandes quantités sont nécessaires PHH. Il est à noter que toute modification de l'étape de centrifugation initiale auront une influence négative sur l'isolement NPC en termes de qualité et de quantité. Jusqu'à présent, nous recommandons forces g entre 50 xg (hépatocytes avec une faible teneur en matières grasses) et 150 xg (hépatocytes à haute teneur en matières grasses). hepa De plus grastocytes ont tendance à former un culot cellulaire moins compact après centrifugation en gradient de densité et de la poursuite de la récolte de cellules doit être modifié comme décrit dans l'étape 5.5.

Pour accélérer la procédure d'isolement certaines étapes peuvent être effectuées simultanément. Par exemple, en parallèle avec la purification des hépatocytes isolés, une deuxième personne peut commencer par l'isolement de l'APN. En outre, les solutions à gradient de densité peuvent être préparées à l'avance. S'il y a plus de deux personnes, voire plusieurs étapes peuvent être exécutées en même temps.

En comparaison à d' autres protocoles d'isolement des cellules hépatiques humaines nos résultats montrent des rendements et des viabilités cellulaires similaires ou plus élevées telles que publiées précédemment dans Experimental Biology and Medicine 1. KC isolement Alabraba et ses collaborateurs ont montré des résultats d'isolement avec un rendement de 2,3 x 10 6 cellules viables / g de tissu hépatique KC combinée avec une viabilité de 98% environ 13, qui sont comparables ànotre KC (numéro de cellule: 1,9 x 10 6 KC viables / g de tissu hépatique, de la viabilité environ 93%) les résultats. La majorité des données d'isolement LEC publiées décrivent isolements d'organes entiers 15,24. Gerlach et coll, ainsi que Lalor et ses collaborateurs ont isolé le nombre de cellules compris entre 10 3 et 10 6 cellules / organes 15,24. Ces données ne peuvent être comparées directement à la cellule isolements à partir d'échantillons de tissus. Cependant, en utilisant notre protocole , nous avons montré des rendements pour les CEL de 2,7 x 10 5 / g de tissus hépatiques LEC viables, qui sont de loin plus grande extrapolés sur un organe entier. HSC ont été isolés avec un rendement d'environ 4,7 x 10 5 / g de tissus hépatiques viables HSC et la viabilité de 90%. Les résultats existants publiés par Friedman et ses collègues ont montré la moitié inférieurs rendements cellulaires (2,3 x 10 5 HSC / g foies), mais un même degré de pureté (91%) 14. En ce qui concerne notre protocole, les rendements cellulaires faibles peuvent être causés par une mauvaise perfusion et la digestion due à une faible ou aucune circulation de 1x Perfusion-Solution-I et digestion Solution dans le tissu. En outre des bulles de gaz dans le tissu peuvent perturber la circulation intra-tissu 1x Perfusion-Solution I et Digestion-Solution. Dans ces cas, la perfusion peut être améliorée en augmentant la pression de perfusion et l'élimination des bulles de gaz par serrage canules simples et / ou à l'aide d'une spatule pour pousser contre l'échantillon de tissu. Une mauvaise viabilité est dans la plupart des cas, une conséquence du stress cellulaire. Les temps d'ischémie prolongée, les dommages causés par Ca2 + et l' épuisement protéolyse des protéines de membrane sont liées à des lésions cellulaires, visible par les blebs de la membrane cellulaire. De nos observations ces cellules très sensibles au cisaillement et dans la plupart des cas meurent au cours de la procédure d'isolement. En résumé, l'isolement et la séparation réussie des cellules hépatiques parenchymateuses et non parenchymateuses exige que les étapes critiques sont réalisées dans le laps de temps à droite, les étapes de pipetage sont réalisées avec soin et de manière générale le temps pour l'isolement des cellules et la séparation dhould être aussi courte que possible 21. Un inconvénient du protocole décrit est que les conditions d'isolement (par exemple, les temps de perfusion) ne peuvent pas être complètement normalisée, mais doivent être adaptées individuellement à la qualité des tissus. En outre, le rendement et la pureté des populations de cellules obtenues peut varier en fonction de la qualité du tissu et le résultat de la digestion.

Nous avons récemment publié une étude démontrant l'influence des conditions de culture associées à la caractérisation fonctionnelle de chaque type de cellule PNJ isolés par cette méthode 1. La possibilité d'isoler et de différentes populations cellulaires distinctes du foie permet la création de cellules de foie humain co-cultures innovantes et modèles in vitro du foie de l' ingénierie tissulaire en. Il est bien connu que la culture PHH en 2D mono-cultures conduit à la dédifférenciation et la perte des fonctions typiques de la cellule 7. Pour cette raison , il est nécessaire de mimer in vivo dans des tissus archi-tecture dans les modèles in vitro du foie. Kostadinova et ses collaborateurs (2013) 8,9 ainsi que Messner et ses collaborateurs (2013) 8,9 établis avec succès des modèles fonctionnels co-culture foie pour la détection des effets hépatotoxiques. Cependant, l'APN n'a pas été caractérisée et les fonctions spécifiques n'a pas été étudié dans ces systèmes.

Par conséquent, de nouvelles recherches devraient se concentrer sur les enquêtes sur la survie à long terme de l'APN, de leurs caractéristiques spécifiques et les interactions au sein des co-cultures. Pour ces études, il pourrait aussi être d'intérêt pour établir un protocole pour l'isolement de cholangiocytes. Réalisation de co-cultures fonctionnels in vitro , y compris tous les types de cellules contenues dans le foie natif pourrait être une étape supplémentaire dans la direction de in vivo comme des modèles de foie humain.

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Acknowledgments

Nous tenons à remercier Jia Li Liu pour leur soutien dans la création de la figure 1. Cette étude a été soutenue par le ministère fédéral allemand de l'éducation et de projets de recherche (BMBF) Foie virtuel: 0315741.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Equipment
PIPETBOY Eppendorf
pipettes Eppendorf
microscope Carl Zeiss
microscope Olympus
CO2-incubator Binder
Lamin Air Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R Heraeus
Urine Beaker Sarstedt 2041101
perfusor syringe 50 ml B.Braun 12F0482022
Bottle Top Filter Nalgene 1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352096
Tissue Culture plate BD Biosciences 533047 24 well
serological pipettes BD Biosciences 357525, 357551, 357543 25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips SARSTEDT 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name Company Catalog Number Comments
Isolation Equipment
water bath Lauda
peristaltic pump Carl Roth
circulation thermostat Lauda
pH meter Schott
fine scales Sartorius
stand
Büchner funnel Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel Feather 12068760
Neubauer counting chamber Optic Labor
cell lifter Costar
Surgical Drape Charité Universitätsmedizin Berlin A2013027
compress Fuhrmann 40013331
sterile surgical gloves Gammex PF 1203441104
Tissue glue B. Braun 1050052
glass bottle VWR
Collagenase P Roche 13349524
Percoll Separating Solution Biochrom L6145 Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS PAA H00911-3938
Dulbecco’s PBS PAA H15 - 002 without Mg/Ca
Ampuwa Plastipur  13CKP151 
Albumin Sigma-Aldrich A7906
NaCl Merck 1,064,041,000
KCl Merck 49,361,000
Hepes Pufferan  Roth 133196836
EDTA Sigma E-5134
Name Company Catalog Number Comments
Media Equipment 
DMEM PAA E15-005 Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M GIBCO 1135546
L-Glutamine GIBCO 25030-024 200 mM
MEM NEAA GIBCO 11140-035
penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
RPMI 1640 PAA E15 - 039 without L-Glutamine
Sodium Pyruvate GIBCO 1137663 100 mM
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154 0.4%
William’s E   GIBCO 32551-020
with GlutaMAX™
EGTA Sigma-Aldrich 03780-50G
Fortecortin Merck 49367 8 mg/2 ml
Human-Insulin Lilly HI0210 100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Fetal calf serum (FCS) PAA A15-101
Name Company Catalog Number Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68 R&D Systems, USA monoclonal
CK 19 Santa Cruz D2309 polyclonal
CK18 Santa Cruz K2105 monoclonal
Vimentin Santa Cruz monoclonal
GFAP Sigma Aldrich monoclonal
Triton X-100 Sigma Aldrich 23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE Santa Cruz C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC Santa Cruz L0412
Methanol J.T.Baker 1104509006
Formaldehyde 4% Herbeta Arzneimittel 200-001-8
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906-100G

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References

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