En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I detta arbete beskriver vi en ny metod som kombinerar ex vivo drogkänslighetsanalyser och digital bildanalys för att uppskatta chemosensitivity och heterogenitet av patienthärledda multipelt myelom (MM) celler. Denna strategi består i sådd primära MM celler nyligen utvinns ur benmärgsaspirat i mikroflödessystem kammare genomförs i flerbrunnsplattor, var och en består av en rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive extracellulära matrix (kollagen eller basalmembranet matris) och stroma (patient- mesenchymala stamceller) eller humant ursprung endotelceller (HUVEC). Kamrarna är drogade med olika medel och koncentrationer, och avbildas sekventiellt för 96 h genom ljusfältsmikroskopi, i en motoriserad mikroskop utrustat med en digitalkamera. Digital bildanalys Programvaran upptäcker levande och döda celler från närvaron eller frånvaron av membranrörelse, och genererar kurvorna av förändring i lönsamhet som en funktion of läkemedelskoncentration och exponeringstid. Vi använder en beräkningsmodell för att bestämma parametrarna för chemosensitivity av tumören befolkningen att varje läkemedel, såväl som antalet sub-populationer som finns som ett mått på tumör heterogenitet. Dessa patientanpassade modeller kan sedan användas för att simulera terapeutiska regimer och uppskatta kliniska svaret.

Introduction

Målet med denna metod är att karakterisera läkemedelskänslighet av multipelt myelom (MM) primära celler till en panel av medel ex vivo, så nära som möjligt till fysiologiska betingelser, och med tillräcklig precision att dessa resultat kan användas för att identifiera kemoterapiresistent sub- populationerna inom tumörbördan och, slutligen, för parameter beräkningsmodeller utformade för att uppskatta det kliniska svaret.

Beräkningsmodeller är kraftfulla verktyg för att analysera komplexa system, såsom cancer-värd-terapi interaktioner. Men modeller är bara så bra som de data som används för parameter dem. Tyvärr kan de flesta tillgängliga uppgifter i litteraturen inte användas i sin nuvarande form för parameter sådana modeller, eftersom de ofta erhålls i ömsesidigt uteslutande experimentella förhållanden. Sålunda är nya experiment krävs ofta med målet att erhålla uppsättningen av experimentella parametrar som behövs. De flesta viabilitetsanalyser, dock är destruktiva och thoss begränsade till ett litet antal tidpunkter, ofta bara ett. Detta handikapp kraftigt användningen av chemosensitivity analyser för parameter beräkningsmodeller, eftersom sådana försök misslyckas med att ge information om den tidsmässiga dynamiken i systemet. Detta gäller särskilt med primära cancerceller, som ofta är begränsade till ett fåtal miljoner per prov, och har en kort livslängd efter biopsi, vilket begränsar antalet experimentella förhållanden som. Dessutom har de flesta viabilitetsanalyser kräver separation av cancer från de icke-cancer (stroma) celler vid tidpunkten för kvantifiering, vilket ger extra arbete till protokollet, vilket ytterligare stör cellerna, och begränsar antalet experiment som kan utföras .

40 år sedan, lax och medarbetare 1 föreslog deras berömda i kolonibildning in vitro analys för bedömning av chemosensitivity av tumörceller. Tyvärr denna analys fann blandad framgång på grund av det lilla antalet multipla myeloma (MM) patientprover som var i stånd att bilda kolonier under kontroll förhållanden: Man uppskattar att endast en liten subgrupp av 0,001% till 0,1% av MM-celler kan föröka sig, som betecknas som multipelt myelom stamceller 2. Detta begränsade signifikant framgång för analysen och det antal läkemedel som kan testas på en gång, även på senare modeller 3. Denna fråga är mycket viktigare nu när MM medel (standard eller experimentella) är fler än fyra decennier sedan.

En viktig begränsning av dessa tidiga analyser är deras dikotomiserades utgång: antingen en patient är "känslig" eller "resistent" till ett visst läkemedel. Ingen information ges om graden av känslighet och heterogenitet av tumören befolkningen. Således skulle patienter med små delpopulationer av snabbväxande resistenta celler klassificeras som "känsliga" till behandling, men skulle återfall inom kort, och därmed inte benbestämda från behandling. Med tanke på betydelsen av varaktigheten av svaret i total överlevnad (OS) av cancerpatienter 4,5, är det klart hur dessa analyser kunde inte riktigt uppskatta OS konsekvent.

För att kringgå dessa begränsningar och för att kunna generera patientspecifika beräkningsmodeller som skulle uppskatta personlig kliniskt svar på en panel av droger, har vi utvecklat en metod för icke-förstörande testning läkemedelskänslighet av multipelt myelom (MM) cellinjer och primära MM celler i en ex vivo rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive extracellulära matrisen och stroma 6. Denna analys, hade dock begränsningen att förlita sig på en viss kommersiell mikroflödes slide, vars dimensioner och kostnader begränsat antal experiment eller läkemedel som skulle kunna utföras på en gång i en given del av utrustningen.

Det här beskrivna systemet förlänger denna ursprungliga analys i en hög-throughput organotypisk dos-respons plattform, för in vitro-screening av läkemedel, baserat på en digital bildanalys algoritm för att icke-destruktivt kvantifiera cellernas livskraft. Varje brunn i 384 eller 1536 brunnar är en 3D-rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive primär MM celler, extracellulär matris och patientgenererade stroma och tillväxtfaktorer. Levande mikroskopi och digital bildanalys används för att detektera celldödshändelser i olika läkemedelskoncentrationer, som används för att generera dos-responsytor. Från de data in vitro, en matematisk modell identifierar storleken och chemosensitivity av delpopulationer i patientens tumörbörda, och kan användas för att simulera hur tumören skulle svara på läkemedlet (er) i fysiologiska betingelser i en klinisk kur 6 ( Figur 1).

De viktigaste nyheterna i denna plattform är: (a) litet antal cancerceller som krävs (1,000-10,000 per läkemedel concentranson); (B) bedömning av läkemedlets effektivitet i fysiologiska förhållanden (extracellulärmatrix, glatta, patientgenererade tillväxtfaktorer); (C) Ingen toxicitet från livskraft markörer 7 eftersom endast ljusa fält avbildning används, alltså ingen anledning att transfektera celler med fluorescens 8 eller bioluminiscens 9; (D) kontinuerlig avbildning ger läkemedelseffekt som en funktion av koncentration och exponeringstid (farmakodynamik); och (e) integrationen mellan in vitro och beräknings evolutionära modeller för att uppskatta kliniska resultat 6 (Silva et al., som en förberedelse).

Den viktigaste faktorn som gör att digital bildanalys algoritm för att urskilja cancer från stromala celler är deras olika affinitet till botten av brunnen: MM celler inte vidhäftar, och förblir i suspension i matrisen, medan stromaceller vidhäfta till botten av väl och sedan sträcka.

Denna separation inträffar trots MM och stroma enre ympades vid samma tid, och sker under O / N-processen för inkubation. Den snurrar i centrifugen efter sådd av plattan accelererar ytterligare denna process. Som en konsekvens, MM-celler visas i bilden som runda ljusa skivor omgivna av en mörk ring, medan stroma bibehåller en låg profil och en mörkare nyans (Figur 2). Således är bäst lämpad för icke-vidhäftande cancerceller analysen i sin nuvarande form, även om justeringar i algoritmen kan göras för att separera cancer och stroma utifrån andra morfologiska egenskaper, såsom storlek och form. I detta protokoll beskriver vi två typer av extracellulära matrix (kollagen och basalmembranet matris) samt två typer av co-kulturer, med (benmärgs härledd mesenkymala stamceller) BMSC och HUVEC, som företräder de mellanliggande och perivaskulära nischer i benmärgen , respektive.

Med hjälp av en 384-brunnar, 5 koncentrationer per läkemedel och två repliker, kunde vi test upp till 31 olika läkemedel med prov av en enda patient. I 1536-brunnsplattor detta antal är 127. Figur 3 visar layouten för närvarande används för manuell cellsådd, medan Supple Figur 1 representerar den optimala fördelningen med användning av en robotliknande pipett. Vid utformningen av figur 3, kan varje 384-brunnar bära 3 patientprover med 7 olika läkemedel, eller en patientprovet testas med 21 läkemedel. Varje läkemedel representeras av fem koncentrationer, och varje tillstånd såddes i dubbletter. 4 kontrollbrunnar (inget läkemedel tillsatt) sås för varje uppsättning av 7 läkemedel (t.ex., brunnar 36-39, 126-129 och 200-203). För att säkerställa potensen hos de läkemedel som används, är också ympade, och drogade i duplikat vid den högsta koncentrationen av var och en av de läkemedel som används (brunnar 76-89) en human myelomcellinje (t.ex. H929 eller MM1.S). Den positiva cellinje kontroll säkerställer att de läkemedel som används har tillräcklig styrka, eftersom deras dosresponskurvor är jämförbara across experiment. Två brunnar sås med en myelomcellinje som kontroll för de miljöförhållanden, med andra ord, för att upptäcka eventuella problem i bänk inkubator under avbildning (brunnar 75 och 90). Uppräkningen av brunnarna följer ett sicksackmönster, för att minska avståndet som täcks av den motoriserade steget av mikroskopet, vilket minskar anskaffningstiden och reducerar slitage på utrustningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av mänskliga celler från biopsier som beskrivs nedan godkändes av Moffitt institutionella Review Board och genomförs inom ramen för den kliniska prövningen MCC # 14745 bedrivs vid H. Lee Moffitt Cancer Center och Forskningsinstitut.

1. Sortering av MM Celler från benmärgsaspirat

  1. Samla benmärgsaspirat (20 ml) från patienter i natriumheparin spruta.
  2. Isolera mononukleära celler genom att centrifugera utspädd märg (1: 1 med steril PBS) över ett sterilt vattenhaltigt medium centrifuge gradient vid 400 xg under 30 min vid omgivande temperatur.
  3. Samla upp gränssnittet, som innehåller de mononukleära cellerna. Tvätta cellerna med kall PBS och räkna med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare, använder trypanblått för bestämning av lönsamheten.
  4. Förbered ett tunt skikt förberedelse cell sliden 10 och fläcken med Wright-Giemsa fläcken för att bedöma plasmacell procentsats 11.
  5. Beräknamängden CD138 pärlor som skall användas baserat på antalet celler och plasmacell procentsats. Om du börjar provet är mindre än 20% plasmaceller, sedan återsuspendera celler med användning av 90 pl av separation buffert och 10 pl CD138 pärlor per 5 x 10 6 celler. Om start provet är mer än 20% plasmaceller, återsuspenderades med användning av 80 | il av separationsbuffert och 20 pl av CD138 pärlor per 1 x 10 7 celler.
  6. Inkubera cellerna med pärlorna vid 4 ° C under 15 minuter.
  7. Pass celler genom en 35 um sil läggas till pre-fuktade separation (LS) kolumner placeras i magnetfältet separatorn (se lista över material).
  8. Ta bort kolumnen från magneten. Samla CD138-selekterade celler genom tvättning av kolonnen 3 gånger med 1 ml separationsbuffert.
  9. Bedöm CD138 anrikning med en annan färgade tunnskiktscellberedningen glida 10.
  10. Filter plasma erhållen från benmärg biopsi från varje patient med en 0,22 um sprutfilter. Använd färsk plasmafrån samma patient som de CD138 + -celler.
  11. Förbered media för experimentet genom att komplettera RPMI-1640 med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 10% patientplasma och 1% penicillin-streptomycin.
  12. Samla genomströmning av markeringen (CD138-) och följer den klassiska vidhäftningsmetoden 12 för att selektera för benmärgs mesenkymala celler (BMSCs). Eftersom denna process kräver veckor innan BMSCs är klar att användas, är det nödvändigt att ha BMSCs redo från tidigare patienter eller friska donatorer.

2. sådd Celler i Plattor (med en manuell flerkanals pipetten)

  1. Använd en platta med flera brunnar (384 eller 1536) med svarta väggar och ett öppet plan botten, företrädesvis en optimerad för optiska applikationer och cellodling.
  2. Co-kultur BMSCs med MM celler i antingen kollagen typ I eller basalmembranet matris, dock HUVECs kräver basalmembranet matris.
  3. Behåll de slutliga densiteterna för varje celltyp iföljande intervall: 3 x 10 5 celler / ml för MM cellinjer, 2 x 10 5 celler / ml för HUVEC eller BMSCs, och 2 x 10 6 celler / ml för patientgenererade MM-celler.
    Notera: Dessa densiteter är resultatet av experimentellt optimering för att möjliggöra högsta möjliga bildkvalitet och längsta möjliga imaging tid medan biologisk relevans bibehållande i analyserna. MM cellinjer såddes vid lägre densiteter än primära MM celler på grund av deras snabbare replikering hastighet och större storlek.
  4. Co-kultur av primära MM celler med BMSCs:
    1. Bered 100 | il alikvoter av förblandad medier bestående av 20 ul av 10x MEM, 20 | il avjoniserat H2O, 10 ^ il av 7,5% natriumvätekarbonatlösning och 50 | il av 1 x RPMI 1640 och förvara vid 4 ° C.
    2. Vid tidpunkten för sådd av plattorna med MM-celler, blanda alikvoter av förblandad media med 150 pl av 3,1 mg / ml bovint kollagen typ I till en slutlig volym av 250 | il.
    3. Re-suspavsluta 50 pl celler i RPMI 1640 vid sex gånger den slutliga önskade densiteten.
    4. Blanda till cellsuspension med kollagenblandning för att skapa en slutlig volym av 300 | j, l med användning av en P200 pipett.
    5. Med hjälp av en manuell eller repeater pipett deponera en 8 pl droppe slutlig cell / matris mix i mitten av varje brunn i 384-brunnsplattor, eller 2 pl i varje brunn i 1536 brunnar (se steg 2.6 för ett exempel på rumsliga arrangemang av brunnar).
    6. Centrifugera plattan under 2 min vid 500 xg för att koncentrera alla celler till samma fokalplanet under avbildning.
    7. Lämna plattan i en inkubator (5% CO2, 37 ° C) under 1 timme, för gelpolymerisation.
    8. Lägg 80 il kompletterat tillväxtmedia (RPMI-1640, 10% FBS Hl, 10% patient härledda plasma, 1% P / S) till varje brunn i 384-brunnsplattor, eller 8 ul i 1536-brunnars plattor.
    9. Lämna plattan O / N i inkubator (5% CO2, 37 ° C) under vidhäftning av stroman till botten av plattan.
  5. Co-culture av primära MM celler med HUVEC:
    1. Överföring basalmembranmatris från -80 ° C till en hink med is för att tina.
    2. Räkna och återsuspendera primära celler och HUVEC i RPMI-1640 medier vid 4 gånger den slutliga densiteten, var och en i ett separat rör.
    3. Blanda patientceller och HUVEC volymer vid en 1: 1 proportion.
    4. När basalmembran matris tinas, men ändå inte polymeriseras, blanda 1: 1 med cellblandningen från föregående steg.
    5. Seed droppar med tillräcklig volym av cellmatris mix i mitten av varje brunn (8 il för 384 brunnar och 2 pl för 1536-brunnsplattor, se steg 2.6 för ett exempel på rumsliga arrangemang av brunnar).
    6. Centrifug plattan vid 500 xg under 10 min.
    7. Placera plattan i inkubator (5% CO2, 37 ° C) under 1 h för matris polymerisation.
    8. Lägg tillväxtmedia (RPMI-1640 supplementerat med 10% FBS, 10% patientplasma och en% P / S) till varje brunn (80 | il för 384-brunnsplattor, 8 ^ il för 1,536-brunnsplattor).
    9. Lämna plattan O / N i inkubator (5% CO2, 37 ° C) under vidhäftning av HUVEC till botten av plattan.
  6. Seed en 384-brunnar. Figur 3 visar en typisk geografiska fördelningen av sådd.
    1. Från och med den väl B2, utsäde så många kolumner som läkemedel som ska testas. I exemplet i figur 3, använder sju droger.
    2. Upprepa sådd så många gånger som koncentrationer som skall användas. I exemplet i Figur 3, använder fem koncentrationer.
    3. Seed fyra brunnar för kontrollförhållanden.
    4. Upprepa steg 2.6.1 och 2.6.2 för andra replikera.
    5. Upprepa steg 2.6.1 till 2.6.4 för varje patientprov som skall testas i plattan.
    6. Seed en MM cellinje i två rader av brunnar, var och en med så många brunnar som läkemedel som ska testas (i duplikat). Var och en av dessa brunnar kommer att behandlas med den högsta koncentrationen av varje läkemedel för att säkerställa att mälden som användes hade tillräcklig potency (se figur 3 för exempel).
    7. Seed två brunnar med en MM cellinje för att tjäna som kontroll av de experimentella förhållanden, såsom väl fungerande bänk inkubator, tillväxtmedier, osv.

3. Sådd Celler i plattor (med hjälp av en Robotic pipetten)

Obs: Denna serie av steg frön en 384-brunnar med hjälp av en robot pipett. Utformningen av plattan är avbildad i handböcker Figur 1, där primära MM celler testas mot en panel av 31 olika droger vid fem olika koncentrationer i två replikat, plus negativ kontroll. En cellinje också seedade som positiv kontroll för bedömning av läkemedlets effektivitet och testas mot alla 31 läkemedel vid den högsta koncentrationen i två replikat. Filerna som är för ett visst märke och modell (se Material tabell) men algoritmen kan anpassas till eventuella robotpipetter.

  1. Samodling av primär mm cells med BMSCs:
    1. Förbered en 15 ml rör bestående av 240 pl 10x MEM, 240 pl avjoniserat H2O, 120 pl 7,5% natriumbikarbonatlösning, 600 pl av 1x RPMI 1640 och 1,8 ml 3,1 mg / ml bovint kollagen typ I. Label röret som "förblandning för CD138 +". Placera på is fram till användning.
    2. Bered en 1,5 ml rör bestående av 50 ul av 10x MEM, 50 | j, l avjoniserat H2O, 25 ^ il 7,5% natriumvätekarbonatlösning, 125 | il 1 x RPMI 1640 och 375 | il av 3,1 mg / ml bovint kollagen typ I. Etikett röret som "förblandning för cellinje". Placera på is fram till användning.
    3. Återuppslamma 300 pl CD138 + celler i RPMI 1640 vid sex gånger den slutliga önskade densiteten. Återuppslamma 300 pl BMSC celler i RPMI 1640 vid sex gånger den slutliga önskade densiteten. Blanda båda volymerna tillsammans i ett 1,5 ml rör och etikett "CD138 +". Placera i inkubator fram till användning.
    4. Återsuspendera 60 | ilcellinjen i RPMI 1640 vid sex gånger den slutliga önskade densiteten. Återuppslamma 60 pl BMSC celler i RPMI 1640 vid sex gånger den slutliga önskade densiteten. Blanda båda volymerna tillsammans i ett 1,5 ml rör och etikett "cellinje". Placera i inkubator fram till användning.
    5. Med hjälp av programvaran som medföljer robot pipett, ladda första skriptfilen "cell_seedingPt47.PGM". Placera en 200 mikroliter pipettspets box, en mikrotiterplatta, och en steril 384-brunnsplatta i stationerna A, B och E, respektive, av roboten.
    6. Blanda innehållet i rör "förblandningen för CD138 +" och "CD138 +". Överför 1,5 ml av dess innehåll till brunnen # 1 av mikrotiterplattan. Placera röret med återstående volymen på is. Starta programmet. Roboten kommer att ympa första 176 brunnar (11 längst till vänster kolumner) av 384-brunnar och sedan pausa. Överför den återstående delen av röret på is till brunn # 2 av mikrotiterplatta. Återuppta programmet. Denrobot utsäde de återstående 144 brunnar i 384-brunnar och paus.
    7. Blanda innehållet i rören "pre-mix för cellinje" och "cellinje" och överföra innehållet till brunn nr 3 av mikrotiterplattan. Fortsätt programmet. Roboten kommer att ympa de återstående 64 brunnar i 384-brunnsplatta.
    8. Placera 384-brunnars platta i centrifug under 10 minuter vid 500 x g och 4 ° C. Överföringsplatta till inkubator (5% CO2, 37 ° C) under 1 h för kollagen-polymerisation.
    9. Ladda andra skriptfilen "media_layer.PGM". Placera 120 mikroliter pipettspets box, en reagensbehållare med 31 ml RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS, 10% patientplasma och en% P / S och 384-brunnsplatta med celler till stationerna A, B och E, respektive. Kör programmet. Roboten kommer att överföra 81 | il medium till varje brunn. När du är klar, överföra 384-brunnar till inkubatorn och tillåta stroma att följa substratet O / N.
  2. 4. Läkemedels Upprättande och Neddrogningen av plattor (med hjälp av en manuell flerkanals pipetten)

    1. Förbered en mall liknande fig 3 för att underlätta processen att lägga läkemedel till brunnar och minska risken för förväxling.
    2. Bered, i ett 96-brunnsplatta, till en serieutspädning av vart och ett av läkemedlen skulle testas i plattan, till exempel, för fem koncentrationer med användning av en 3-faldig utspädning:
      1. Lägg 120 pl av läkemedel vid 10x den önskade koncentrationen i den högsta koncentrationen bra. Använd till exempel 500 iM melfalan om den högsta koncentrationen av cellerna kommer att exponeras i plattan kommer att vara 50 iM.
      2. Lägg 80 | il tillväxtmedia (RPMI kompletterat med 10% FBS, 10% patienten härledda plasma och 1% penicillin / streptomycin (P / S)) för de fyra efterföljande brunnarna.
      3. Överför 40 ul från den första brunnen till den andra och blanda, till en total volym av 120 pl på 1/3 av den första brunnen läkemedelskoncentration, eller 167 | iM.
      4. Upprepa steg 4.2.3 till de återstående brunnarna (t.ex. överföra 40 fil från andra till tredje, blanda, sedan överföra 40 fil från tredje till fjärde, etc.).
    3. Överför 8 il från varje läkemedel som innehåller väl till motsvarande brunn i cellplattan. Varje läkemedel innehåller också bör ha tillräcklig volym för 10 brunnar i cellplattan. I exemplet i fig 3, är varje läkemedelskoncentration sättes till sex olika brunnar, med undantag för den högsta koncentrationen, vilket tillsätts till 8 brunnar.
    4. Lägg 8 | il tillväxtmedia (RPMI kompletterat med 10% FBS, 10% patienten härledda plasma och en% P / S) till kontrollbrunnarna.
    5. Placera celler i mikroskop så snart redo och slå på bänk inkubation.

    5. Drug Upprättande och Neddrogningen av plattor (med hjälp av en Robotic pipetten)

    1. Hämta skriptfiler för robot pipett från http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
    2. Ladda manuset "media_layer_DRUGPLATE.PGM" i robot pipett användargränssnitt. Placera en 120 mikroliter pipettspets låda, behållare med 21 ml RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS, 10% patientplasma och en% P / S och en tom 384-brunnars platta i stationerna A, B och E, respektive. Kör programmet, kommer robot pipett tillsätt 30 pl av media till alla brunnar i 384-brunnar.
    3. Efter mallen från Supple Figur 2 lägg 200 | il av läkemedlet vid 20x maximal koncentration i varje brunn på en mikrotiterplatta. Denna inställning rymmer upp till 31 droger. Till kontrollbrunnen (CTRL), tillsätt RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS, 10% patientplasma och en% P / S.
    4. Placera en 120 mikroliter pipettspets rutan mikrotiterplatta med droger vid 20X koncentration, och 384 brunnar med media (från steg 5,1) i stationerna A, B och C, respektive. Ladda programmet "drug_plate.PGM". Robot pipett kommer att skapa en serieutspädningav 1: 3, efter den rumsliga fördelning i Supple Figur 1.
    5. Placera en 120 mikroliter pipettspets rutan, den 384-brunnar med läkemedelsspädning (från steg 5.3) och 384-brunnsplatta med celler (från steg 3.1.9) i stationerna A, B och C, respektive. Ladda och kör programmet "drug_add.PGM". Robot pipett kommer att överföra 8 pl läkemedel från varje brunn i läkemedelsplattan till sin motpart i cellplattan. När du är klar, överföra cellplattan till inkubatorn av den digitala mikroskop så snart som möjligt.

    6. Imaging av celler i Plate

    Obs! Proceduren nedan gäller Evos Auto FL mikroskop, men kan lätt anpassas till andra motordrivna scen mikroskop med bänk inkubation eller inkubator inbäddade mikroskop.

    1. Rengör insidan av bänk inkubator med en etanol-våtservett och försiktigt bort locket på plattan medan placera locket på incubator.
    2. Följ programvara steg för att lägga fyrarna. Detta är den term som används för att hänvisa till landmärken för regioner av intresse, som skall avbildas successivt under försöket (se program manual för mer information).
    3. Använd en 5x eller 10x förstoring mål. Kontrollera att fokus är liknande figur 2: MM celler visas som ljusa skivor omgivna av en mörk ring och BMSCs eller HUVEC är knappt synliga. Vissa primära MM celler är mycket små och därmed en finjustering kan krävas för att hitta den optimala fokus.
    4. Justera förvärvs intervallet mellan 10-30 minuter och löptid för åtminstone 96 timmar. Även längre intervall mellan förvärv är acceptabla, kan intervaller på 45 minuter eller mer påtagligt minska precisionen i mätningen av lönsamheten.
    5. Konfigurera programvaran så att bilderna av varje brunn lagras i separata filer som heter Beacon-1, Beacon-2, etc. Om robot pipett användes, ställ fyrarna i den ordning som visas iKompletterande Figur 3.
    6. Se till att det finns tillräckligt med vatten i inkubatorn luftfuktare och gas, så att cellerna kommer att vara under optimala förhållanden.
    7. Efter avslutad experimentet, kopiera mappar som innehåller bilderna till datorn som kommer att köra analysen.

    7. Kvantifiering av läkemedelskänslighet

    Anmärkning: Följande instruktioner styra användningen av bildanalys med användning av ett datorkluster, eftersom analysen av en platta med flera brunnar i en persondator är extremt tidskrävande.

    1. Hämta ImageJ programvara från NIH: s webbplats: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Ladda ner manus och plugins på http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
    3. Följ instruktionerna i http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf att köra digital bildanalys programvara. Resultatet bör bli ett kalkylblad som heter Results.csv innehåller mätningarna lönsamhets med jämna mellanrum för EACh brunn i plattan under hela experimentet (dvs., 96 h).
    4. Om du använder en manuell flerkanals pipett, utföra följande steg.
      1. Ladda ner filen http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt och ändra det för att matcha layouten av plattan som definieras i steg 3,1 (t.ex. Figur 3).
      2. Ladda ner mjukvaran http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar och köra det genom att använda filer som skapats i steg 5.3 och 5.4 som ingångsparameter. Resultatet blir ett mappnamn rapport innehåller flera kalkylblad, varje grupp resultaten för ett visst läkemedel.
      3. Kopiera och klistra in innehållet i kalkylmall http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
        Obs: Resultatet bör vara grafer såsom den som visas i figur 4, som representerar den chemosensitivity av provet till olika läkemedel som en funktion av läkemedelskoncentration och exponeringstid.
      4. </ Ol>
      5. Om du använder en robot pipett, utföra följande steg.
        1. Hämta mallfiler från Download skriptfiler för robot pipett från http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Mall Files.zip och extrahera filerna i en katalog.
        2. Ändra filen DrugList.csv enligt listan av narkotika och högsta läkemedelskoncentrationen i plattan med celler. Följa uppbyggnaden i Supple Figur 2.
        3. Kör programmet BuildExperimentalDesign.java passerar som parameter den mapp som innehåller de filer som extraheras i steg 7.5.1 och filerna Results.csv från steg 7.3. Resultatet bör vara två mappar namn MM1_S och PtSample. Den första innehåller en beskrivning av brunnarna (läkemedel och koncentrationer) för cellinjen positiva kontrollen. Den andra innehåller samma information, men om den del av plattan ympades med patientceller.
        4. Kopiera filen Results.csv i var och en av de kataloger som skapats i steg 7.5.3. Hämtaprogramvaran http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar och köra det genom att använda filer som skapats i steg 7.5.3 för båda mapparna. Resultatet blir ett mappnamn rapport i var och en av de mappar som skapats i 7.5.3. Rapporten mappen innehåller flera kalkylblad, varje grupp resultaten för ett visst läkemedel.
        5. Kör programmet BuildGraphPadFile.java och passera som parameter den mapp som innehåller de filer som extraheras i steg 7.5.1 och filerna Results.csv från steg 7.3. Resultatet kommer att bli en GraphPad fil som innehåller de dos-svarskurvor för var och en av 31 droger och normaliserade av styrningen. Varje diagram kommer att innehålla fem läkemedelskoncentrationer för de primära MM celler och en koncentration till den positiva cellinje kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flödet av experimentet beskrivs kortfattat i figur 1 Om alla åtgärder slutförts, bilderna som erhållits genom mikroskopet ska motsvara Figur 2:. Levande MM celler bör tydligt ses som ljusa diskar och BMSCs eller HUVECs bör vara knappt synlig och väl fördelad i bakgrunden. Såsom framgår av fig 2A, MM-celler varierar i storlek från en patient till en annan, men i allmänhet är de mindre än cellinjer. Eftersom de praktiskt taget inte replikera ex vivo under intervallet av experimentet (96 h) De kan ympas vid högre koncentrationer (1 till 3.000.000 celler / ml). Stroma bör vara knappt mätbar, som BMSC hålla sig till botten av brunnen och stretch, presenterar en låg profil. Den humana myelomcellinjen H929 är betydligt större än patientgenererade MM-celler (Figur 2B), och replikerar inom 24 timmar. För att undvika trängsel på bilden, är MM cellinjer seded en lägre densiteter, 0,3 miljoner / ml. Figurerna 2C och 2D representera patienthärledda MM-celler och humana myelomcellinjer H929, respektive, samodlade med HUVEC-celler. HUVECs först hålla sig till botten av brunnen och sedan börja kontakta varandra och bildar nätverk, som senare blir tjockare och med lumen.

Figur 4 exemplifierar vad som kan förväntas från de bearbetade video genereras av bildanalys algoritm, visar upptäckt levande MM celler pseudo-färgade i grönt (figur 4A) med ingen eller mycket liten grön signal i BMSCs och HUVEC vid slutet av experimentet i den högsta läkemedelskoncentrationen, när alla MM-celler är döda (Figur 4B). Programvaran ska aggregera resultaten från olika brunnar och bygga ett diagram som visar gradvis förlust av livskraft med exponeringstid vid olika läkemedelskoncentrationer (Figur 4C). Kurvan av dosrespons avkontroll-cellinje (t.ex. H929 eller MM1.S) bör vara densamma som för tidigare experiment; betydande avvikelser kan tyda på problem med stamlösningen av läkemedel som används i experimentet.

Det är viktigt att noggrant följa alla brunnar ympade innan avbildningsprocessen, som artefakter kan vilseleda bildanalys programvara och leda till felaktiga resultat. Exempelvis visar fig 5A ett resultat av en överdriven densitet av BMSCs i brunnen eller för mycket tid som gått mellan trypsinering och ympning, vilket leder till dessa celler som bildar klumpar. Figur 5B visar "kolonier" av MM-celler. Om cellinjer såddes med höga densiteter, kommer de att bilda kolonier som de replikeras och detta minskar noggrannheten i digital bildanalys algoritmen eftersom det blir allt svårare att urskilja en cell från den andra. Fig 5C är ett exempel på den motsatta, där för få MM-celler såddes. Thans ofta inträffar när antalet MM celler erhållna från benmärgsaspirat är under 500 tusen, och den "döda volymen" vänster i röret innan resuspension blir jämförbar med den volym av media som krävs för att återsuspendera MM-celler i höga densiteter . För att lösa detta problem, bestämma dödvolymen för röret som används och inkludera det i utspädnings beräkningarna. Figur 5D är ett exempel på skev fokalplanet. Lägg märke till hur MM celler på övre vänstra är ljusa och de i det nedre högra är mörkt. Detta orsakas av am ojämnt placerade platta eller felaktigt placerade mål. Detta kommer att leda till MM-celler i olika delar av bilden som ska räknas på olika sätt. Skala barer (nere till höger på varje bild) representerar 500 nm.

Figur 1
Figur 1. Protokoll övergripande beskrivning. (A) Under ett ben Marrow biopsi en extra tub av aspirera erhålls för protokollet. (B) multipelt myelom (MM) celler är magnetiskt separeras från andra celler i aspirera. (C) Tre rör, innehållande MM celler (MM), icke-MM-celler och plasma, respektive, erhålls från separationsprocessen. (D) Benmärgs mesenchymala stamceller (BMSCs) från tidigare aspirat är samodlade med färskt erhållna MM celler och återsuspenderades i extracellulär matris (kollagen eller basalmembranmatrisen). (E) Plattan centrifugerades ned för att säkerställa att så många MM som möjligt befinner sig i samma fokalplan och BMSC är redo att vidhäfta till botten av brunnen. Plattan placeras i inkubator tills matrisen polymeriserar. (F) Varje brunn är fylld med en blandning av odlingsmedia och patienten härledda plasma. Plattan placerades i en inkubator O / N. (G) Läkemedel sätts till varje brunn och plattan placeras i ett mikroskoputrustad med en digital kamera, motoriserade steget och bänk inkubator, och avbildas med jämna mellanrum under en period av 96 timmar. (H) Bildfilerna för varje brunn analyseras med hjälp av en algoritm som segment lever MM celler baserat på membranrörelse (levande celler pseudo färgade i grönt) och skapar ett kalkylblad med förändringar i cellularitet för varje brunn för varje tidpunkt. Skalstreck (nere till höger) representerar 500 ^ m. (I) ett program grupper brunnarna genom droger och koncentrationer och skapar ett kalkylblad med kurvor av dos-respons normaliserad så att de första åtgärderna är 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Pre-läkemedel förväntas utseende brunnar. (A) MM-celler samodlade med stroma. (B) Den humana myelomcellinjen H929 samodlade med stroma. (C) Patient härrör MM celler i samodling med HUVEC. (D) human myelom-cellinje H929 i samodling med HUVEC-celler. Skala barer (nere till höger på varje figur) representerar 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Rekommenderat geografiska fördelningen av brunnar i en 384-brunnar. Varje 384-brunnar kan bära 3 patientprover med 7 olika läkemedel, eller en patientprovet testas med 21 läkemedel. Wells i ljusgrön, ljusblå och solbränna, innehålla MM celler från tre olika patienter. Rx1, Rx2, etc., representerar olika droger, var och en vid fem olika concentra och i två exemplar. Fyra brunnar användes som kontroller för varje patient (36-39 för patienten 1, 126-129 för patienten 2 och 200-203 för patienten 3). Wells i orange innehåller cellinjer på högsta läkemedelskoncentrationen av varje läkemedel i två exemplar. Brunnar i gult är cellinje kontroller (inget läkemedel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Exempel på digital bildanalys och dos-respons diagram. (A) MM celler i samodling med BMSCs, inbäddade i kollagen I, utsatt för en koncentration av 50 nM carfilzomib. Bildanalys algoritm detekterar levande celler och pseudo färger dem i grönt. (B) bilder förvärvas med jämna mellanrum under hela experimentet. I denna concentratipå av läkemedel, nästan alla celler är döda vid slutet av 96 timmar. (C) Diagrammet visar förändringar i antalet livskraftiga celler för fem olika koncentrationer av carfilzomib längs ett intervall på 96 timmar, normaliserad för tid = 0 timmar som 100%. Den humana myelomcellinjen MM1.S användes som kontroll för läkemedlets effektivitet. Skala barer (längst ned till höger A och B) representerar 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Vanliga fel när sådd eller bildplatta. (A) stromaceller "trassliga". (B) "kolonier" av MM-celler. (C) För få MM-celler. (D) Skev fokalplan. Skala barer (nere till höger på varje bild) representerar 500 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1 sup
Kompletterande Figur 1. Optimal geografiska fördelningen av brunnar i 384-brunnar med hjälp av en robot pipett. I denna konfiguration 31 olika läkemedel kan testas på 5 olika koncentrationer och 2 replikat (grön). Dessutom kan positiva kontroller med en cellinje användas för att säkerställa läkemedlets potens (rosa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Sup
Kompletterande Figur 2. Rumslig fördelning av läkemedel "master plate". Robot pipett kommer att använda denna platta där varje brunn innehåller en av de 31 läkemedel vid 20x koncentration, för att skapa läkemedelsutspädningsplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Sup
Kompletterande Figur 3. Numreringen av brunnar som ska användas vid framställning av en platta med en robot pipett. Programvaran som beskrivs i protokollet kräver denna numrering av brunnarna för att adekvat kartlägga brunnarna till droger och koncentrationer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Kompletterande Figur 4. Jämförelse mellan mikroflödes slide (Khin et al., 2014) och nuvarande protokollet. Dosrespons av H929 multipelt myelom cellinje mätt under 24 timmar i det tidigare systemet (överst till vänster bortezomib, mitt vänstra melfalan) och i det nuvarande systemet ( övre högra bortezomib och mitten till höger melfalan). För jämförelseändamål, LD50 vid 24 timmar för båda plattformarna var 3,9 nM och 4,1 nM för bortezomib, och 6,4 | iM och 14.65 pm för melfalan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammanfattningsvis är detta en kraftfull och hög genomströmning metod för att kvantifiera chemosensitivity av primära MM celler och ex vivo farmakodynamik av läkemedel i en rekonstruktion av benmärgen. De kritiska steg inom detta protokoll är korrekt sådd av brunnarna och tillräcklig fokusering (se figur 2 för förväntade resultat): se till att MM och stromaceller är jämnt fördelade, att stromaceller är anhängare till botten av brunnen, att alla MM celler är i samma fokalplanet, och att MM celler har aspekt av en ljus skiva omgiven av en mörk ring.

Vid felaktig sådd (se figur 5), inte fortsätta med experimentet, utan frö en andra platta. Om problemet upptäcks låg eller hög MM eller stroma celldensitet, kontrollera cellkoncentrationen i röret innan sådd och resuspendera med jämna mellanrum under sådd processen att säkerställa en jämn fördelning av celleri media. Användningen av en flerkanalig pipett med repeaterfunktion eller fjärrstyrt dispensern kan avsevärt minska detta problem. Andelen cell / matris till media (01:10) som används i denna analys försökt maximera antalet brunnar som kan sådda och därmed förhållanden studeras. Men för att studera lösliga faktorer som produceras eller konsumeras av cancerceller eller stroma, rekommenderas att en del av cell / matris media vara 1: 1.

Som närvarande genomförs, kvantifierar detta system endast icke-vidhäftande celler. För att kvantifiera förändringar i cellularitet av stroma programvaran skulle behöva modifieras och anpassas till de morfologiska egenskaperna hos stroma. Detta skulle vara en användbar funktion för att studera effekten av cancerceller eller läkemedel i stroma utrymmet. Det här beskrivna systemet är inte heller kvantifiera cellularitet vidhäftande cancerceller, särskilt om de kombineras med vidhäftande stroma. Lösningen skulle vara ändringar i den digitala image analys algoritm för att skilja cancer från stroma baserad på morfologiska egenskaper, eller att i förväg inkubera antingen befolkning med ett fluorescerande färgämne som kan användas för att identifiera celler från antingen befolkningen.

Betydelsen av detta protokoll jämfört med tidigare metoder är förmågan hos bedöma läkemedelssvar av primära cancerceller i en ex vivo rekonstruktion av benmärgsmikro på ett icke-förstörande sätt, så att sekventiella mätningar kan göras, vilket ger mycket mer detaljerad informationen av farmakodynamiken, snarare än vid fasta tidpunkter. En av begränsningarna i vår tidigare analys 6 var linjär gradient som genereras av läkemedelsdiffusion, som endast tillät bedömning av läkemedelskänslighet inom ett linjärt fönster av koncentrationer. Den nuvarande analysen möjliggör bedömning av livskraften över någon intervall av läkemedelskoncentrationer, eftersom varje brunn är en separat enhet. Båda analyserna emellertid generera likvärdiga resultat (

Bland de många framtida tillämpningar av denna metod, är vår grupp fokuserar på att använda matematiska modeller för att extrapolera den farmakodynamik uppgifter som lämnats av dessa analyser i kliniskt svar. För att uppnå detta mål föreslår vi att passa datapunkter erhållna (Figur 4C) för varje läkemedel till ett system med differentialekvationer, som beskriver dynamiken i läkemedelsinducerad celldöd. Sedan, genom att till dessa matematiska modeller de kända farmakokinetiska egenskaperna av varje läkemedel i en klinisk kur, skulle det vara möjligt att uppskatta det faktiska svaret hos patienten 6. Genom att automatisera sådd och drugging användning av ett robotsystem, skulle det vara möjligt att testa inte bara standard för hand droger, utan också över hundra experimentella läkemedel per prov (i en 1536-brunnsplatta). Detta skulle öppna möjligheten för in silico kliniska prövningar, där hundratals experimentella läkemedel skulle kunna testas ikohorter av patientprover, vilket skapar överlevnadskurvorna för virtuella kliniska prövningar 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna forskning har finansierats av staten Floridas Bankhead-Coley Team Science Grant (2BT03), National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) och Moffitt Cancer Center Team Science Grant. Detta arbete har stötts delvis av Translational Research Core Facility vid H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, en NCI utsedd Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). Tillgång till galvaniska element möjliggjordes genom Total Cancer Care Protokollet vid Moffitt Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics