भूतल फैल रहा है और खमीर गुणसूत्रों के immunostaining

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Grubb, J., Brown, M. S., Bishop, D. K. Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes. J. Vis. Exp. (102), e53081, doi:10.3791/53081 (2015).

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Abstract

Introduction

नवोदित खमीर के गुणसूत्र समारोह को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन का अध्ययन सहित जैविक प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करता है। आनुवंशिक आणविक, और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए नवोदित खमीर के जाने-माने लाभ कर रहे हैं हालांकि, सेल के नाभिक में प्रोटीन के वितरण के कोशिकाविज्ञान पढ़ाई अपने छोटे आकार से जटिल है। ठेठ खमीर नाभिक दृश्य प्रकाश के बारे में केवल 5 बार संकल्प सीमा है जो कम से कम एक माइक्रोन, की एक व्यास है। इस प्रकार, पारंपरिक immunostaining से या ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है कि परमाणु प्रोटीन के वितरण के बारे में जानकारी की मात्रा सीमित है। प्रोटीन की subnuclear वितरण निस्र्पक के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रसार गुणसूत्र सतह है। यह दृष्टिकोण, कोशिका दीवार को हटाने सेल और परमाणु झिल्ली, और एक में खलल न डालें शामिलllowing के नाभिक की अघुलनशील सामग्री को एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह पर व्यवस्थित करने के लिए। ये अघुलनशील घटक परमाणु मैट्रिक्स और गुणसूत्रों में शामिल हैं। क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन पता लगाने की क्षमता को बढ़ाता है जो घुलनशील परमाणु सामग्री को हटाने की अनुमति के अलावा, इस तरह के प्रसार के नाभिक के चारों ओर 3 माइक्रोन से 5 का व्यास है कि (द्विगुणित meiotic नाभिक के लिए) गुणसूत्रों की पर्याप्त decompression में विधि परिणामों के प्रसार के गुणसूत्र और 2 द्विगुणित mitotic नाभिक के लिए माइक्रोन से 3। इस decompression के बरकरार नाभिक में हल करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल या असंभव है कि परमाणु बुनियाद का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

प्रसार गुणसूत्र के लिए एक स्पष्ट कमी के प्रसार की प्रक्रिया के हित की संरचना को बाधित आंशिक रूप से या पूरी तरह से हो सकता है कि संभावना है। विशेष चिंता का एक विशेष गुणसूत्र बाध्य प्रोटीन के प्रसार की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में खो दिया जा सकता है। इस संभावित जटिलता Shouडेटा की व्याख्या जब एलडी ध्यान में रखा जाना। प्रसार की प्रक्रिया के प्रति संवेदनशील है कि एक प्रोटीन का एक उदाहरण बीटा ट्यूबिलिन है। कुछ शर्तों के तहत, मुख्य रूप से ट्यूबिलिन के शामिल है जो धुरी, 3 प्रसार के दौरान संरक्षित है। धुरी के दृश्य अक्सर ब्याज के नाभिक चरण के लिए उपयोगी है। हालांकि, ट्यूबिलिन visualizing एक उच्च एकाग्रता लगानेवाला के साथ उपचार की आवश्यकता है; स्पिंडल नीचे वर्णित मानक शर्तों के तहत खो रहे हैं। यह उदाहरण एक पहले से uncharacterized प्रोटीन के वितरण का विश्लेषण, यह प्रोटीन ऐसी विभिन्नता के लिए कितना संवेदनशील निर्धारित करने के लिए लगानेवाला की एकाग्रता भिन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है, कि दिखाता है। गुणसूत्र संरचना पर प्रसार की स्थितियों के प्रभाव के बारे में चिंता के बावजूद, प्रसार विधि की उपयोगिता और शक्ति कई संदर्भों में प्रदर्शन किया और mitotic के लक्षण वर्णन और, विशेष रूप से meiotic कोशिकाओं 4-7 में व्यापक उपयोगिता है किया गया है।

Twओ प्रसार के तरीकों को बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। ड्रेसर और गिरौक्स 8 द्वारा विकसित की इन विधियों का पहला, डिटर्जेंट के उपयोग से बचा जाता है और डीएनए विशिष्ट डाई DAPI के लिए दाग जब अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित गुणसूत्र आकृति विज्ञान लग गए हैं कि प्रसार की तैयारी प्राप्ति कर सकते हैं। हालांकि, इस पद्धति सही करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है और एक स्लाइड में से एक क्षेत्र अन्य क्षेत्रों की तुलना में है जब फैल नाभिक की गुणवत्ता में नाटकीय रूप से बदलता रहता है। यह समस्या डाटा अधिग्रहण पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक स्लाइड से कई अचयनित नाभिक इमेजिंग शामिल है कि मात्रात्मक दृष्टिकोण जटिल हो सकता है। Loidl और क्लेन 1 द्वारा विकसित की विधि प्रसार दूसरा गुणसूत्र, सेल और एक साबुन के घोल से पदोन्नत क्रोमेटिन decompression के साथ, paraformaldehyde के द्वारा निर्धारण संतुलन शामिल है। ठीक से प्रदर्शन करते हैं, तो इस विधि ड्रेसर और गिरौक्स विधि की तुलना में कम क्षेत्र के लिए-क्षेत्र बदलाव के साथ बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है। इस प्रस्तुति में एक modifie पर केंद्रितक्योंकि अपनी विश्वसनीयता और सादगी की Loidl और क्लेन की विधि के डी संस्करण,।

क्रोमोजोम प्रसार जटिल या समय लेने वाली नहीं है; अप करने के लिए 100 स्लाइड्स एक ही दिन में immunostaining के लिए तैयार किया जा सकता। इसके अलावा, प्रसार की तैयारी से पहले immunostaining के लिए साल के लिए ठंडे बस्ते में संग्रहित किया जा सकता है, और इस प्रकार प्रयोगशालाओं नई जैविक सवाल उठता है या नई धुंधला अभिकर्मकों उपलब्ध हो जाते हैं जब इस्तेमाल किया जा सकता है कि जमी गुणसूत्र फैलता का भंडार विकसित कर सकते हैं।

गुणसूत्र के प्रसार विधि सबसे आम तौर पर immunostaining और widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में उपयोग किया है, लेकिन यह इस तरह प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) माइक्रोस्कोपी के रूप में सुपर संकल्प प्रकाश सूक्ष्म तरीकों के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए भी संभव है।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल के कुछ चरणों के नीचे एक साफ धूआं हुड में काम करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, विधि spheroplasting नजर रखने के लिए एक 10X लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य से लैस एक खमीर tetrad विच्छेदन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है। माइक्रोस्कोप समय से आगे हुड में स्थापित किया जाना चाहिए। दायरे से micromanipulator के हाथ और प्लेट धारक निकालें और दूर कार्य क्षेत्र से एक सुरक्षित जगह में इन वस्तुओं की जगह है।

स्फेरोप्लास्ट की 1. तैयारी

  1. वांछित शर्तों के तहत खमीर के लिए आगे बढ़ें। OD600 1.4 = 5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल में प्रत्येक नमूने के बारे में 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं, उदाहरण के लिए एक संस्कृति के 4 मिलीलीटर का प्रयोग करें। नमूनों की तत्काल प्रसंस्करण कुछ मामलों में बेहतर हो सकता है, सबसे अनुप्रयोगों के लिए, सेल aliquots के संसाधित किया जा रहा से पहले करने के लिए 8 घंटे के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है।
  2. गोली कोशिकाओं के लिए 3 मिनट के लिए 5 (2345 आरपीएम / 857.5 XG) की स्थापना पर एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। गोली से कोशिकाओं को कम करने के लिए नहीं मध्यम देखभाल छानना। धीरे 1 मिलीलीटर ZK बफर में कोशिकाओं resuspend और फिर 40 μl 1 एम dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ें। कोमल मिश्रण के साथ 2 मिनट सेते हैं। गोली कोशिकाओं के रूप में पहले (1.2 चरण देखें)।
  3. 1 मिलीलीटर ZK बफर में Resuspend छर्रों। अच्छी तरह से मिश्रित किया गया है कि zymolyase 100T के हौसले से तैयार समाधान के 5 μl जोड़ें। सेल की दीवार को हटाने और स्फेरोप्लास्ट का उत्पादन करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. Spheroplasting पूरा हो गया है, तो यह निर्धारित करने के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर सेल निलंबन की एक 10 μl छोटी बूंद परख। एक coverslip बिना विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे देखा प्रकोष्ठों। प्रकोष्ठों फूला हुआ और दौर के बजाय थोड़ा आयताकार प्रकट करना चाहिए और पानी के 20 μl के अलावा निम्नलिखित lyse चाहिए। कोशिकाओं lyse करने में विफल रहते हैं तो पानी प्रेरित सेल आसानी से मनाया जाता है जब तक हर 10 मिनट, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना लौटने और फिर से परख। गोली कोशिकाओं के रूप में पहले (1.2 चरण देखें)।
  5. धीरे resuspend और सेल गोली मैं धोनेएन 2.5 मिलीलीटर ठंड एमईएस / सोर्बिटोल बफर। गोली कोशिकाओं के रूप में पहले (1.2 चरण देखें)। धीरे 300-400 μl ठंड एमईएस / सोर्बिटोल बफर में सेल गोली resuspend। प्रकोष्ठों कई घंटे के लिए इस स्तर पर बर्फ पर रखा जा सकता है।

फैल 2. क्रोमोजोम

नोट: क्रोमोसोम-फैल या तो स्लाइड या किया जाएगा जिस पर कांच की सतहों coverslips-चाहिए समय से आगे तैयार किया। प्रत्येक स्लाइड या coverslip के पानी में डूबे हुए किया जाना चाहिए, तो EtOH, तो सूखे की अनुमति दी है, और लेंस कागज के साथ पॉलिश। गुणसूत्रों coverslips पर फैल जाएगा, तो coverslip के सेलो टेप या रबर सीमेंट के साथ एक स्लाइड से चिपका किया जाना चाहिए। अन्यथा उल्लेख किया है, जब तक कि प्रोटोकॉल के बाकी या तो एक स्लाइड या coverslip पर प्रसार का वर्णन करेंगे

  1. एक साफ स्लाइड की सतह पर एक P20 pipettor, pipet का सेल निलंबन के 20 μl का उपयोग करना।
  2. एक P200 pipettor का उपयोग, 3% पीएफए ​​/ sucrose के समाधान के 40 μl जोड़ने और धीरे solutio के मिश्रणSchlieren लाइनों गायब हो जाते हैं जब तक हाथ के साथ स्लाइड "घूमता" द्वारा एन। खुर्दबीन के नीचे स्लाइड प्लेस और कोशिकाओं को ध्यान में हैं कि इस बात की पुष्टि। पीएफए ​​समाधान का उपयोग करने के दिन पर धूआं हुड में हौसले से तैयार किया जाना चाहिए।
    नोट: ब्याज की प्रोटीन पहले से विधि द्वारा जांच नहीं की गई है, यह प्रोटीन की अवधारण निर्धारण शर्तों के प्रति संवेदनशील है, तो यह निर्धारित करने के लिए 2 और 4% पीएफए ​​होते हैं कि समाधान का उपयोग अतिरिक्त स्लाइड तैयार करने के लिए सलाह दी जाती है। एक 4% पीएफए ​​/ sucrose के समाधान यह जुड़े ट्यूबिलिन सूक्ष्मनलिकाएं कल्पना करने के लिए वांछनीय है जहां मामलों में इस्तेमाल किया जाता है। उच्च लगानेवाला एकाग्रता का नुकसान गुणसूत्रों हो जाएगा "underspread," 2% पीएफए ​​भी "underspread" गुणसूत्रों उपज के लिए जाता है।
  3. एक P200 pipettor का उपयोग, पूरी तरह से संभव के रूप में समाधान मिश्रण के रूप में करने से पहले चक्कर आने, एक टाइमर शुरू, 1% Lipsol के 80 μl जोड़ें। Lipsol उपलब्ध नहीं है, तो 80 μl 1% NP40 या 80 μl DH 2 ओ हो सकता है(चित्रा 2 प्रतिनिधि परिणाम देखें) प्रतिस्थापित।
  4. स्लाइड हर 15 सेकंड ज़ुल्फ़ ध्यान से और धीरे कोशिकाओं को देखो। कोशिकाओं का लगभग 80% lysed कर दिया है, तुरंत माइक्रोस्कोप से स्लाइड हटाने, टाइमर बंद पीएफए ​​/ sucrose के समाधान के 80 μl जोड़ें, और चक्कर आने के मिश्रण करने के लिए (गायब हो गए)। Lysis टाइमर शुरू करने के बाद बीच 30 और 90 सेकंड से हो जाना चाहिए।
    नोट: कई स्लाइड ही समय के बारे में सेल दिखाने के लिए, एक अंततः स्लाइड के शेष के लिए सूक्ष्म निगरानी न आना और केवल ध्यान से lipsol और लगानेवाला के अंतिम विभाज्य के अलावा के अलावा बीच की अवधि के समय कर सकते हैं। एक ही नमूना से कई स्लाइड तैयार करते समय बहरहाल, यह छोटा रास्ता केवल विश्वसनीय है। अलग स्लाइड्स अलग अलग समय पर उठाए गए नमूनों से या विभिन्न संस्कृतियों से तैयार कर रहे हैं जब यह microscopically प्रत्येक नमूने की सेल की निगरानी के लिए सबसे अच्छा है।
  5. एक साफ सपाट सतह पर स्लाइड प्लेस और पूरे unfrosted surfac भर में तरल फैल"पोखर" का meniscus के नीचे लेकिन यानी स्लाइड ही है, की सतह से ऊपर आयोजित एक साफ, डिस्पोजेबल चराई pipet के पक्ष का उपयोग स्लाइड के ई। pipet के साथ स्लाइड की सतह "घूस" नहीं है। नमूने के प्रदूषण से बचने के लिए विभिन्न स्लाइड्स पर pipet का पुन: उपयोग न करें।
  6. धूआं हुड में रातोंरात शुष्क करने के लिए स्लाइड छोड़ दें। अघुलनशील परमाणु के घटकों स्लाइड सतह पर बसा है और इसे करने के लिए बाध्य होगा। बड़े प्रयोगों के लिए, सुखाने कदम के लिए अंतरिक्ष के इस्तेमाल की योजना बना महत्वपूर्ण है।
  7. एक बार सूखे, इष्टतम परिणामों के एक ही दिन में immunostaining के चरण के लिए प्रगति के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। हालांकि, सूखे sucrose के समाधान के नमूनों की ठंड की अनुमति देता है कि एक "शहद" में फैल गुणसूत्रों embeds: स्लाइड एक प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स को हस्तांतरित और साल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

3. Immunostaining

  1. 30 सेकंड के लिए 0.2% फोटो फ़्लो में डुबकी स्लाइड। शहद निकालने के लिए। पर झुक स्लाइड्सएक किनारे, किनारे एक कागज तौलिया पर आराम के साथ अवशिष्ट फोटो फ़्लो दूर करने के लिए।
  2. 5 मिनट के लिए 1x टीबीएस में डुबकी स्लाइड्स धोने के लिए। एक छोर पर स्लाइड झुकाव से अतिरिक्त तरल निकालें, लेकिन उन्हें बाहर सूखा नहीं है।
  3. की ओर उठ, pipet 300 μl टीबीएस / बीएसए स्लाइड के unfrosted हिस्से भर में स्लाइड पर पाले स्लाइड निर्धारित करना।
  4. 15 मिनट के लिए आरटी पर एक नम कक्ष में सेते हैं। (संतृप्त कागज तौलिये के साथ एक छिद्रित धातु की थाली या प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स के नीचे पानी संतृप्त कागज तौलिये के साथ लाइन में खड़ा बड़े प्लास्टिक कंटेनर)।
  5. एक कागज तौलिया पर स्लाइड की एक छोटी किनारे आराम और (जैसे कि एक टेस्ट ट्यूब रैक के रूप में) एक उपयुक्त समर्थन के खिलाफ स्लाइड झुकाव द्वारा स्लाइड्स नाली। सतह सुखाने के लिए अनुमति न दें।
  6. तुरंत प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित कमजोर पड़ने से युक्त टीबीएस / बीएसए बफर के 80 μl लागू होते हैं। एंटीबॉडी सीमित है, तो 40 μl और एक 22 x 22 मिमी coverslip का उपयोग। कच्चे तेल खरगोश सीरम के लिए, यह आम तौर पर एक 1/50 और 1/500 कमजोर पड़ने के बीच है।
    ध्यान दें:नई एंटीबॉडी की तैयारी के लिए अनुमापन प्रदर्शन करते हैं। पृष्ठभूमि के ऊपर उच्च संकेत है कि पैदावार सबसे पतला तैयारी चुना जाता है। पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के साथ दाग होना चाहिए पृष्ठभूमि धुंधला के स्तर को नियंत्रित करने के लिए, नाभिक उचित विलोपन उत्परिवर्ती तनाव और / या डुप्लिकेट स्लाइड से तैयार किया जाना चाहिए।
  7. बुलबुले से बचने के स्लाइड पर एक पॉलिश 22 x 50 मिमी coverslip जगह। एक छोटी किनारे के पास पदों पर लंबी बढ़त के साथ अंगूठे और तर्जनी के बीच coverslip धारण करके यह मत करो। एक 30 डिग्री के कोण रिश्तेदार पर coverslip होल्डिंग यह सिर्फ "पोखर" स्लाइड के पाले क्षेत्र के सबसे करीब की बढ़त के अंदर स्लाइड पर टिकी हुई है, जब तक उंगलियों से कम बढ़त सब से अधिक दूर उतारा है, स्लाइड करने के लिए। फिर धीरे धीरे स्लाइड स्पर्श बेंच पकड़े उंगलियों जब तक एक निर्बाध गति में coverslip के निचले हिस्से, और उसके बाद जारी। यह भूमि एक बार coverslip की स्थिति को समायोजित करने का प्रयास न करें।
    नोट: गुणसूत्र फैलता पर तैयार किए गए हैंचिपका coverslips (बजाय सीधे पर स्लाइड की सतह), इस नमूने coverslip के धुंधला और वाशिंग कदम भर में स्लाइड से चिपका रहेगा। एक अतिरिक्त coverslip के धुंधला हो तो त्याग के दौरान समान रूप से एंटीबॉडी समाधान वितरित करने के लिए नमूना coverslip के शीर्ष पर रखा जाएगा।
  8. एक मोहरबंद नम कक्ष में जगह स्लाइड और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  9. एक गिलास स्लाइड धुंधला रैक करने के पाले में बढ़त स्थानांतरण स्लाइड होल्डिंग और टीबीएस युक्त एक धुंधला जार में डूब।
  10. धीरे coverslip के दूर करने के लिए ऊपर और नीचे स्लाइड डुबकी। ऐसा करने के लिए बहुत अधिक बल का उपयोग करने के लिए नहीं की कोशिश करें। टीबीएस में जलमग्न से 10 मिनट 2x स्लाइड धो लें। रैक से स्लाइड्स निकालें और कागज तौलिया किनारे छू द्वारा अतिरिक्त तरल निकास। सतह सूखी मत देना।
  11. मातहत प्रकाश के तहत काम करते हुए, तुरंत 80 μl टीबीएस / बीएसए fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (या एक 22 x 22 मिमी coverslip के साथ 40 μl) के एक 1 / 1,000 गुना कमजोर पड़ने से युक्त जोड़ें। विज्ञापनऔर इससे पहले के रूप में डी coverslip के अंधेरे में नम कक्ष में 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  12. पहले के रूप में coverslips निकालें स्लाइड्स नाली, और अंधेरे में 1 से 2 घंटे के लिए शुष्क हवा की सतह अनुमति देते हैं। पहले के रूप में कागज तौलिए पर झुक स्लाइड।
    नोट: प्रसार एक मुहिम शुरू की coverslip पर प्रदर्शन किया गया था, तो सूखने से पहले स्लाइड से coverslip के अलग। पिछले चरण में स्लाइड के लिए के रूप में वर्णित Coverslips तो सूख रहे हैं।
  13. मातहत प्रकाश के तहत काम करते हुए, DAPI (तीन 10 μl बूंदों) युक्त मध्यम बढ़ते के बारे में 30 μl जोड़ने और फिर ध्यान से एक coverslip कम है। फैलता coverslips पर कर रहे हैं, एक साफ स्लाइड पर बढ़ते मध्यम की बूंदों जगह है और स्लाइड पर, नीचे coverslip के गुणसूत्र ओर कम है।
  14. फिर भी वश में प्रकाश के तहत, व्यवस्थित और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील करने के लिए coverslip के लिए 2 मिनट इंतज़ार करो। एक फ्लैट स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स रखें।
    नोट: STED माइक्रोस्कोपी के लिए, लम्बा गोल्ड के साथ माउंट। लम्बा सोने के 30 μl का प्रयोग करेंऔर DAPI के बिना रात भर इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं। नेल पॉलिश के साथ सील अनावश्यक है।
  15. एक 40 या 100X उद्देश्य DAPI के लिए ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयुक्त सेट एक फिल्टर का उपयोग करने के साथ widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा देखें स्लाइड। वैकल्पिक रूप से कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड की दुकान। स्थिर नहीं रहो।

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Representative Results

प्रसार नाभिक की शक्ल में गंभीर रूप से गुणसूत्र निर्धारण और डे-संघनन के बीच संतुलन पर निर्भर करता है। अभिकर्मकों ठीक से संतुलित कर रहे हैं यहां तक ​​कि जब गुणसूत्र डे-संघनन की डिग्री में भिन्नता और / या अलग स्लाइड्स के बीच एक ही स्लाइड के विभिन्न क्षेत्रों में हो सकता है। छवियों व्याख्या कर रहे हैं इससे पहले इस प्रकार, एक स्लाइड का एक दिया क्षेत्र में फैलता की गुणवत्ता का आकलन किया जाना चाहिए।

"overspreading" और "underspreading" के प्रभाव meiotic पुनर्संयोजन प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर यह साफ किया जा सकता है। चित्रा 1 में, meiotic नाभिक DAPI के साथ डीएनए के लिए दाग दो यूकेरियोटिक कतरा विनिमय प्रोटीन Rad51 और Dmc1 और काउंटर के लिए immunostained दोहरा रहे हैं। बेहतर फैल नाभिक के दो उदाहरण चित्रा 1 ए में दिखाया जाता है। चित्रा 1 बी एक underspread नाभिक और दो ​​overspread नाभिक की चित्रा 1C उदाहरणों में से एक उदाहरण दिखाता है। ध्यान देंRad51 और Dmc1 के कम foci ठीक से नाभिक प्रसार करने के लिए की तुलना में अधिक है और underspread नाभिक दोनों में मनाया जाता है। नमूना पर्याप्त फ्लैट नहीं है क्योंकि underspread नाभिक के मामले में, कुछ foci ध्यान से बाहर हैं। इसके अलावा, मिलान एक्सेसिबिलिटी सभी foci पता लगाने के लिए विफलता के लिए योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रसार के छोटे व्यास निकट दूरी संरचनाओं का संकल्प रोकना कर सकते हैं। Overspread नाभिक के मामले में, प्रोटीन, क्योंकि अपर्याप्त निर्धारण और / या अत्यधिक डिटर्जेंट उपचार की हानि हो सकती है।

मानक विधि के बदलाव Lipsol के उपयोग से बचने कर सकते हैं। Loidl एट अल द्वारा वर्णित प्रसार विधि के मूल संस्करण। Lipsol, एक औचित्य प्रयोगशाला कांच के बने पदार्थ डिटर्जेंट 1 का उपयोग करता है। इस डिटर्जेंट वर्तमान में गुणसूत्र कई प्रयोगशालाओं में फैलाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, मूल निर्माण नहीं रह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और वर्तमान में उस नाम के तहत बेचा उत्पाद फिर से तैयार किया गया है। एफurthermore, Lipsol के लिए मूल सूत्र (फ्रांज क्लेन, व्यक्तिगत संचार) भी उपलब्ध नहीं है। इस समस्या को दूर करने के प्रयास में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और रासायनिक परिभाषित डिटर्जेंट NP40 Lipsol के स्थान पर प्रयोग किया गया था, जिसमें किए गए प्रयोगों; मानक प्रोटोकॉल के इस संशोधन meiotic नाभिक Rad51 और Zip1, synaptonemal जटिल (2A चित्रा) के मध्य क्षेत्र के एक घटक के लिए दाग रहे थे फैल गया, जिसमें एक प्रयोग के लिए संतोषजनक परिणाम देने के लिए पाया गया था। दिलचस्प है, DH 2 0 का एक ही मात्रा के साथ Lipsol समाधान की जगह भी संतोषजनक परिणाम (चित्रा 2 बी) मिले। इन निष्कर्षों से ऊपर वर्णित प्रसार विधि Lipsol बिना सफलतापूर्वक नियोजित किया जा सकता संकेत मिलता है कि हालांकि, यह कुछ पहले से वर्णित परिणामों Lipsol के उपयोग पर निर्भर करती है और NP40 या एच 2 0 अपनी जगह में प्रयोग किया जाता है अगर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं होगा कि संभव है। प्रसार विधि मील सीखना एक व्यक्तिght यथोचित Lipsol के स्थान पर NP40 और / या एच 2 ओ का उपयोग करके शुरू करने के लिए चुनते हैं। कठिनाइयों का सामना कर रहे हैं कि घटना में, अन्वेषक यह बंद किया गया था इससे पहले अभिकर्मक का एक भंडार प्राप्त है कि एक प्रयोगशाला से Lipsol के एक विभाज्य अनुरोध कर सकते हैं; Lipsol सस्ती थी और एक आदेश सकता न्यूनतम राशि स्लाइड्स के लाखों उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त था।

प्रसार विधि सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तरीकों के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है। synaptonemal परिसर में एक तत्व के लिए बाध्य प्रत्येक लूप के आधार के साथ, पाश सरणियों का एक सेट में बहन क्रोमेटिडों की एक जोड़ी का आयोजन करता है, जिनमें से प्रत्येक दो रैखिक अक्षीय / पार्श्व तत्व होते हैं। Pachytene गुणसूत्रों synaptonemal परिसर के मध्य क्षेत्र है कि फार्म प्रोटीन से 100 एनएम की दूरी पर समानांतर में आयोजित पार्श्व तत्वों के जोड़े synapsed है। ये बनती पार्श्व तत्वों पारंपरिक widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा हल नहीं किया जा सकता है, लेकिन सुपर resolu द्वारा हल किया जा सकता हैtion के तरीकों। चित्रा 3 में, एक pachytene नाभिक है कि यह आंकड़ा 2 में प्रयोग के लिए इस्तेमाल Zip1 प्रोटीन के लिए एक ही एंटीबॉडी के साथ दाग है दिखाया गया है। नमूना भी Red1 प्रोटीन, अक्षीय / पार्श्व तत्वों का एक घटक के लिए सना हुआ था। परिणाम Zip1 एंटीबॉडी लम्बी अल्फा पेचदार पार्श्व तत्व बाध्यकारी क्षेत्रों के बीच निहित है कि डोमेन-कुंडल coiled बजाय, Zip1 के पार्श्व तत्व बाध्यकारी क्षेत्र को पहचानता है कि पता चलता है। इस प्रकार, इस Zip1 एंटीबॉडी के साथ मनाया धुंधला पैटर्न बनती पार्श्व तत्वों की समानांतर पथ का पता चलता है। पार्श्व तत्वों के साथ Red1 foci के वितरण Zip1 foci की तुलना में अपेक्षाकृत विरल है, लेकिन डबल धुंधला विधि Red1 foci आम तौर पर Zip1 foci द्वारा परिभाषित रेखीय पथ के पास झूठ है कि पता चलता है। इन निष्कर्षों को एक ही प्रसार विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जिसमें पिछले काम के साथ संगत कर रहे हैं; synaptonemal कंप्यूटर अनुप्रयोग की त्रिपक्षीय संरचनालेक्स के प्रसार की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। 3 चित्र में दिखाया छवि STED माइक्रोस्कोपी 9 द्वारा तैयार की गई थी।

चित्र 1
चित्रा 1: प्रसार नाभिक के उदाहरण Dmc1 (हरा), Rad51 (लाल), और डीएनए के लिए दाग meiotic नाभिक (DAPI, नीला)।। बार = 1 माइक्रोन। (ए) के बेहतर फैल नाभिक के 2 उदाहरण हैं। (बी) के एक underspread नाभिक का एक उदाहरण है। (सी) overspread नाभिक के दो उदाहरण हैं। बाईं तरफ उदाहरण केवल ऊपरी भाग overspread है जिसमें एक नाभिक है।

चित्र 2
चित्रा 2: Lipsol के उपयोग के बिना तैयार meiotic नाभिक चरणों से meiotic नाभिक Rad51 (लाल) के लिए दाग संकेत बिखरा हुआ है।Zip1 (हरा), और डीएनए (DAPI, नीला)। Pachynema को leptonema से कोशिकाओं को संक्रमण के रूप में होता है कि गुणसूत्र संघनन काफी हद तक संरक्षित रखा जाता है कि ध्यान दें।

चित्र तीन
चित्रा 3: STED माइक्रोस्कोपी के माध्यम से synaptonemal परिसर का दृश्य Zip1 (हरा) और Red1 (लाल) के लिए दाग एक pachytene नाभिक।। डेटा एक मापा STED पीएसएफ के साथ रिचर्डसन-लुसी मॉडल का उपयोग कर 100 पुनरावृत्तियों को चलाने के लिए DeconvolutionLab ImageJ प्लगइन 10 का उपयोग कर प्रोसेस किया गया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymolyase US Biological  Z1004 Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol  L.I.P. Ltd  no longer commercially available Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40 USB 19628 Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20 Sigma P2287
Slides Corning 2948-75x25
Standard coverslip Fisher 12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips Fisher 12-542-B
Photo-Flo 200 solution Kodak P-7417 Prepare 0.2% (v/v) solution in water. 
TBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA Sigma A2153 Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit Invitrogen A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI Vector
Laboratories
H-1200
ProLong Gold Invitrogen P36930
Plastic slide box Fisher 03-448-1 Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box Fisher 12-587-10 Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar Fisher 08-816 Use as a wash basin for slides. 

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References

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