Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Fremstilling av Culture Media, antibiotika, og 2- [2-nitro-4- (trifluormetyl) benzoyl] -1,3-cykloheksandion (NTBC)

  1. Gjør LB medium (1% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 0,25% NaCl i H2O) og aliquot til passende volum. Sterilisere av autoklav. Oppbevares i romtemperatur.
  2. Gjør 100 ml LB-agar (1% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 0,25% NaCl, 1,5% agar i H 2 O) i 250 ml kolber. Steril av autoklav og oppbevares ved romtemperatur. Kontroller at agar er smeltet før strømme inn plater.
    MERK: flasker inneholdende 100 ml LB-agar vil gi 4 plater. Mengden av LB agar kan endres for å tilsvare det antall plater som er nødvendig for analysen.
  3. Gjør PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH 2PO 4) 16. Sterilisere av autoklav eller filtrering og oppbevares ved romtemperatur.
  4. Forbered antibiotika lagerløsninger for gentamicin, kanamycin, end tobramycin.
    1. Forberede aktuelle antibiotika lager konsentrasjoner for P. aeruginosa-stammer inneholdende 100 mg / ml gentamicin, 30 mg / ml kanamycin og 10 mg / ml tobramycin. Oppløse antibiotika i vann, filter sterilisere (0,2 mm), og oppbevares ved 4 ° C. Alter antibiotika og konsentrasjoner, avhengig av bakterien studert.
  5. Klargjør NTBC stamløsninger. Oppløs 10 mg NTBC i 400 mL av DMSO. Dette gir en konsentrasjon av 75,9 mM NTBC. Butikk NTBC stamløsninger ved -20 ° C. Tine-oppløsninger ved romtemperatur etter behov.
    MERK: Ulike kilder til NTBC har forskjeller i oppløselighet. Bestem den aktuelle bilen som å oppløse NTBC basert på produsentens anbefalinger og justere Step 1,5 tilsvarende.

2. NTBC Titreringene av bakteriestammer

  1. Sett opp over natten kulturer av stammene som skal testes. Tilsett 2 ml LB-næringsløsning til 16 x 150 mm testrørs (ett per belastning) og vaksinere med en isolert koloni fra hver stamme. Inkuber over natten ved 37 ° C med lufting på en vevskultur rotator i en luftinkubator.
  2. Dagen etter, forberede titreringer av NTBC i LB buljong. Bruke en initial område fra 0 til 900 pM NTBC siden forskjellige stammer har forskjeller i følsomhet for NTBC.
    1. Tilsett 1 ml LB-næringsløsning til fire til fem reagensglass (16 x 150 mm) pr belastning.
    2. Tilsett NTBC løsning (75,9 mM) til reagensrørene (16 x 150 mm) i et område av konsentrasjoner. Se tabell 1 for NTBC konsentrasjoner og tilsvarende lagerbeholdningen for å legge til 1 ml LB buljong.
  3. Mål OD 600 av de over natten kulturer. Vask kulturer før du tar OD 600 målinger for å eliminere pyomelanin stede i mediene.
    1. Vask kulturene ved sentrifugering av 1 ml av kulturen i en mikrosentrifuge ved 16 000 xg i 2 min. Fjern supernatanten og eventuelle løst pelleterte celler meden mikropipette og resuspender den faste cellepelleten i 1 ml LB.
  4. Vaksinere titrering rør på OD 600 0,05. Beregne mengden vasket kultur for å inokulere rørene.
    MERK: Bruk vasket kulturer for vaksiner siden pyomelanin bør ikke være til stede.
  5. Inkuber titrering rør for omtrent 24 timer ved 37 ° C med lufting ved hjelp av en vevskultur rotator i en luftinkubator.
  6. Fotografere titrering rør og sammenligne pigment produksjon innen og mellom stammene å bestemme mengden av NTBC å bruke for MIC og oksidativt stress analyser. Bruk OD 600 avlesninger for å bestemme mengden av pyomelanin i cellefrie kultur supernatant, og for å bestemme celletetthet.
    MERK: OD 600 forhold på pyomelanin i kultur supernatanten til celler som kan beregnes å kvantifisere forskjeller i pyomelanin produksjon etter behandling med NTBC.

3. Antibiotika Minimum Inhibitory konsentrasjon (MIC) analyse i 96-brønners plater

  1. Sett opp over natten kulturer av stammene som skulle testes i LB med og uten NTBC.
    MERK: Denne protokollen er beskrevet ved hjelp av representative nivå på 300 mikrometer NTBC. Den passende grad av NTBC som skal anvendes, bestemmes i trinn 2,6.
    1. Tilsett 300 mikrometer NTBC til 2 ml LB. Legge til et tilsvarende volum av bærer (DMSO) i 2 ml LB for ikke NTBC tilstand.
    2. Bruke sterile tannpirkere, vaksinere rør med én isolert koloni av bakterier. Det vil være en kultur med NTBC og en kultur uten NTBC for hver stamme. Inkuber over natten ved 37 ° C med lufting ved hjelp av en vevskultur rotator i en luftinkubator.
  2. Dagen etter, gjør LB + NTBC og LB + DMSO mester løsninger for å sette opp MIC analysen. Legg NTBC ved en konsentrasjon på 600 uM, da dette vil bli fortynnet to ganger ved inokulum ble tilsatt, hvilket ga en sluttkonsentrasjon på 300 uM.
    1. For å teste én antibiotic for én stamme, tilsett 600 mikrometer NTBC til 2 ml LB og bland til å gjøre NTBC foroppløsningen. Legge til et tilsvarende volum av bærer (DMSO) i 2 ml LB og bland for å gjøre den ikke NTBC foroppløsningen. Bruk disse løsningene for å skape antibiotikalagerløsninger så vel som for å sette opp fortynningsserier i 96-brønners plater.
      MERK: foroppløsningen formuleringer vil gi ekstra løsning å gjøre rede for pipettering feil. Stamløsninger kan skaleres opp eller ned etter behov, avhengig av antallet av antibiotika og testede stammer.
  3. Forbered antibiotika løsninger i LB + NTBC eller LB + DMSO mester løsninger.
    MERK: antibiotika konsentrasjonen i disse løsningene skal være dobbelt slutt ønsket konsentrasjon. Nok Oppløsningen bør gjøres for å overføre 100 ul til fire brønner i en 96-brønns plate.
    1. Forbered gentamicin +/- NTBC stamløsning på 64 mikrogram / ml. For å gjøre denne løsningen, tilsett 0,288 mL av gentamicin lager (100 mg / ml) til 450ul LB + NTBC eller LB + DMSO mester løsning.
      MERK: Den maksimale konsentrasjonen av gentamicin for P. aeruginosa PAO1 er 32 ug / ml.
    2. Gjør kanamycin +/- NTBC stamløsning på 256 mikrogram / ml. For å gjøre denne løsningen, tilsett 3,84 mL av kanamycin lager (30 mg / ml) til 450 mL LB + NTBC eller LB + DMSO mester løsninger.
      MERK: Den maksimale konsentrasjonen av kanamycin for P. aeruginosa PAO1 er 128 ug / ml.
    3. Forbered tobramycin +/- NTBC stamløsning på 8 mg / ml. For å gjøre denne løsningen, tilsett 0,36 mL av tobramycin lager (10 mg / ml) til 450 mL LB + NTBC eller LB + DMSO mester løsninger.
      MERK: For P. aeruginosa PAO1, den maksimale konsentrasjonen av tobramycin er 4 ug / ml.
      MERK: antibiotika og konsentrasjoner kan justeres for bakterier som skal testes.
  4. Tilsett 100 ul av hver 2x antibiotisk løsning til fire brønner i en 96-brønns plate. Plassere disse løsningene i rad A. For example, gentamicin bør plasseres i A1 til A4, bør kanamycin plasseres i A5 gjennom A8, og tobramycin bør plasseres i A9 gjennom A12. Se figur 1A et diagram av en 96-brønners plate-oppstilling.
    MERK: Flere antibiotika kan testes i en plate, men bare en stamme bør testes per plate for å eliminere muligheten for kryssforurensning fra andre stammer.
  5. Tilsett 50 mL av LB + LB + NTBC eller DMSO foroppløsning i rader B til H i ​​96-brønns plate. Sikre at en plate er LB + NTBC og én plate er LB + DMSO. Se figur 1A.
    1. Bruk LB + NTBC for antibiotika i LB + NTBC. Bruk LB + DMSO for antibiotika i LB + DMSO.
  6. Ved hjelp av en mikropipette utføre to gangers serielle fortynninger av antibiotika ved å overføre 50 ul av oppløsningen fra rad til rad A B. blande løsningen, endrer pipettespisser, og overføre 50 ul av oppløsningen fra rad til rad B til C. Gjenta den remaining rader. Etter fortynning rad G, fjerne 50 mL av løsningen fra den raden og kast. Bruk rad H som ingen antibiotika kontroll for bakterievekst. Se figur 1B.
    MERK: Hver brønn i rader fra A til G inneholder nå 50 ul av antibiotika i LB + NTBC eller LB + DMSO på 2X den endelige ønskede konsentrasjon. Row H inneholder LB + NTBC eller LB + DMSO uten antibiotika.
  7. Mål OD 600 av de over natten kulturer. Vask alle kulturer før du tar OD 600 målinger for å eliminere pyomelanin stede i mediene.
    1. Vask kulturene ved sentrifugering av 1 ml av kulturen i en mikrosentrifuge ved 16 000 xg i 2 min. Fjern supernatanten med en mikropipette og cellepelleten suspenderes i 1 ml LB.
  8. Fortynne natten kulturer til 2.75x10 5 CFU / ml i LB.
    MERK: Anta at en OD 600 enhet tilsvarer 1x10 9 CFU / ml for P. aeruginosa. OD for CFU / ml konverter kan være different i andre bakterier.
  9. Tilsett 50 pl av den fortynnede bakteriekultur til den aktuelle brønnen.
    MERK: Kulturer dyrket i NTBC bør tilsettes til brønnene inneholdende NTBC og kulturene dyrket i DMSO bør tilsettes til brønnene inneholdende DMSO. Se figur 1B.
    1. Legg bakterier til tre brønner for hver stamme og antibiotisk konsentrasjon. Tilsett 50 pl av LB til den fjerde brønnen for å virke som en kontroll for bakteriell forurensning. Se figur 1B.
    2. Bruke en flerkanals mikropipette for å inokulere brønnene. Sikre at pipette tips er nær bunnen av brønnene når du legger inoculum å hindre forurensning av nærliggende brønner.
      MERK: Legge bakteriekultur til brønnene vil utvanne antibiotika og NTBC konsentrasjoner to fold.
  10. Dekk til 96-brønners plater med parafilm og inkuberes ca. 24 timer ved 37 ° C. Inkuber 96-brønners plater statisk, i en luftinkubator.
  11. Undersøkeplater for bakterievekst i brønnene. MIC er den laveste konsentrasjon av antibiotikumet hvor ingen bakterievekst er sett for alle tre replikater av hver stamme.
    1. Visuelt undersøke plate for vekst eller lese med en plateleser sett til OD 600.

4. Spot Plate-analysen for oksidativt stress Response

  1. Sett opp over natten kulturer av stammene som skulle testes i LB med og uten NTBC som beskrevet i trinn 3.1.
  2. Neste dag, forberede LB agar plater som inneholder H 2 O 2 som en oksidativ stressfaktor. Et utvalg av H 2 O 2 konsentrasjoner fra 0 til 1 mm er et godt utgangspunkt.
    1. Smelt LB agar kolber. Kule media til omtrent 50 ° C ved romtemperatur.
    2. Legg H 2 O 2 direkte til det avkjølte mediet ved de ønskede konsentrasjoner. Swirl kolber å blande. Se tabell 2 for konsentrasjoner av H to O toog mengder konsentrert H 2 O 2 å legge til. Disse verdiene er basert på 100 ml LB-agar.
    3. Hell platene umiddelbart etter tilsetning av H 2 O 2 og flamme på overflaten for å fjerne bobler. Utbyttet er 4 plater per 100 ml LB agar. Marker platene med H 2 O 2 konsentrasjon.
    4. Plasser platene avdekket i en biologisk flyt hette med viften kjører i 30 minutter for å fjerne overflødig fuktighet fra platene.
      MERK: Bruk platene samme dag de er forberedt. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i inkonsistente data.
      MERK: å hindre oksidasjon belastninger som paraquat kan benyttes i stedet for H 2 O 2 i denne analysen. Konsentrasjonene brukes til andre oksidative stressfaktorer kan være annerledes enn de som brukes for H 2 O 2.
  3. Vask og måle OD 600 av over natt kulturene som beskrevet i trinn 3.7.
  4. Normalisere OD 600 av hele natten cultures til den laveste verdien for settet av stammer som blir testet. P. aeruginosa har generelt en OD 600 på ca 2,5 da dyrket over natten i LB + NTBC eller LB + DMSO.
    1. Bestemme volumet av kulturen for å fortynne kulturen til den laveste OD 600 i et totalt volum på 1 ml. For eksempel, hvis en kultur har en OD 600 av tre, og den laveste OD 600 for settet av stammer er 2,5, utfør følgende beregning: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml kultur vil bli plassert i et mikrosentrifugerør.
    2. Beregne mengden av LB + NTBC (300 pM) eller LB + DMSO nødvendig for å bringe volumet til 1 ml kultur. For eksempel i trinn 4.4.1, mengden av LB + LB + NTBC eller DMSO tilsatt til kulturen vil være 0,167 ml (1 ml total volum - 0,833 ml kultur). Gjør stamløsninger av LB + LB + NTBC og DMSO til bruk for disse fortynningene basert på volumet som er nødvendig for å fortynne alle stammer.
    3. Bland kultur og LB + NTBC eller LB + DMSO ved virvling.
  5. For å opprettholde kulturer i en konstant konsentrasjon av NTBC eller DMSO, utføre ti gangers serielle fortynninger av de normaliserte natt kulturer i PBS + NTBC eller PBS + DMSO.
    1. Gjør stamløsninger av PBS + NTBC og PBS + DMSO. For ett sett av fortynninger for en belastning, bland 300 uM NTBC eller et tilsvarende volum av DMSO med PBS for å gi et totalt volum på 720 ul. Skalere disse bestandene opp eller ned avhengig av hvor mange stammer er testet.
    2. Etiketten mikrofugerør for 10 -1 gjennom 10 -7 seriefortynninger. Legg 90 mL PBS + NTBC eller PBS + DMSO til hensiktsmessige rør. Bruke PBS + NTBC for stammene dyrket i LB + NTBC og bruke PBS + DMSO for stammene dyrket i LB + DMSO.
    3. Tilsett 10 pl av kulturen til den passende 10 -1 fortynning tube. Bland ved virvling og overfør 10 pl av 10 -1 fortynning til 10 -2 fortynning tube. Gjenta til alle fortynninger har vært gjengivelseRMED. Endre pipettespisser mellom fortynninger.
  6. Spot 5 mL av 10 -3 gjennom 10 -7 fortynninger på LB + H 2 O 2 plater i to eksemplarer for hver stamme. Bruk en pipette tips hvis plassene er belagt fra de fleste fortynne til minst fortynnet (10 -7 til 10 -3). Ikke tips eller vippe platen til væsken har tørket inn i platen.
  7. Platene inkuberes i 24-48 timer ved 37 ° C (luftinkubator), avhengig av belastningen.
    MERK: P. aeruginosa PAO1 vil ha gode store kolonier på LB etter 24 timers inkubasjon. Ruge stammer før de har kolonier omtrent samme størrelse som PAO1.
  8. Fotografere platene med en CCD-kamera over en transluminator. Eventuelt, redigere bilder for kontrast og beskjære til samme størrelse. Telle antall kolonier i hvert sted å oppfatte endringer i følsomhet for oksidativt stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC titreringer

De NTBC titreringer ble brukt for å avgjøre om NTBC var i stand til å redusere pyomelanin produksjon i P. aeruginosa, og også identifisere konsentrasjonen av NTBC som eliminerer eller reduserer pyomelanin produksjon for bruk i ytterligere analyser. Det kan forekomme variasjoner i nivåene av pyomelanin produsert i forskjellige gjennomkjøringer, men de generelle tendenser forblir konstant. Den NTBC titrering analysen kan også bli modifisert for å teste andre forbindelser som kan påvirke pigmentproduksjon i andre bakterier. Dette vil bare fungere, men hvis det er en fenotypisk endring som kan visuelt fastsettes eller kvantifiseres.

Behandling av pyomelanin produserende stammer av P. aeruginosa med NTBC resulterte i en doseavhengig reduksjon i pigmentproduksjon 12. Figur 2 viser at forskjellige stammer av P. aeruginosa har forskjeller i følsomhet for NTBC, som indikert ved nivåer PyOmelanin produksjonen. Høyere konsentrasjoner av NTBC var nødvendig for å redusere pyomelanin produksjon i klinisk isolat PA1111 17 (oppnådd fra Dara Frank) sammenliknet med laboratorie påkjenning hmga :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutant bibliotek). Stammer som ikke produserer pyomelanin [PAO1 (oppnådd fra Carrie Harwood) og HPD :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutant bibliotek)] viste ingen endring i pigmentering med NTBC behandling. Vi besluttet å bruke 300 mM NTBC for våre analyser fordi pyomelanin produksjonen ble betydelig redusert i laboratoriet stammen hmga :: tn hjelp av den konsentrasjon (300 uM for å sammenligne 0 uM NTBC). Alle stammer brukt i denne studien ble lagret ved -80 ° C i 15% glycerol.

Antibiotika MIC

Antibiotika MIC kan testes ved hjelp av flere forskjellige metoder. Mikrotiterplaten metoden beskrevet her det mulig å bruker å teste et utvalg av antibiotikakonsentrasjoner og bruke et minimum av ressurser. Resultatene er lett replikeres, og analysen kan bli modifisert for å gi rom for forskjeller i følsomhet antibiotikum av organismen som skal undersøkes. Noe variasjon kan sees mellom uavhengige forsøk, men trender er ganske konsekvent. Tekniske replikater skal fremvise det samme MIC.

Tabell 3 viser resultatene for ulike P. aeruginosa-stammer ble behandlet med og uten NTBC og forskjellige aminoglykosidantibiotika. Tre uavhengige kolonier ble testet i triplikat å følge metoden beskrevet. MIC ble registrert som den laveste konsentrasjon av antibiotika som hemmet bakterievekst i alle tre tekniske replikater. NTBC behandling hadde ingen effekt på aminoglykosid- MIC for stammene som ble testet.

Oksidativt stress sted plate assay

Spot plate analysen for testing oksidativt stress gir reproducible resultater ved å bruke lavere nivåer av H 2 O 2 enn de som anvendes i andre analyser. Platen uten H 2 O 2 er en styreplate for å bestemme nøyaktigheten av fortynningsserier for hver stamme, samt bestemme kolonistørrelse og antall kolonier på hvert sted, uten å utsette cellene for oksidativt stress. I en riktig fortynning serie, bør det endelige sted har svært få kolonier, mens den første sted vil ha en lettelse antall kolonier på H 2 O 2 frie medier. Det bør være en ti ganger forskjell i antall kolonier på hvert sted innenfor en fortynningsserie. For alle stammer som ble testet, bør tilsvarende antall kolonier bli sett i samme fortynning i H 2 O 2 fri styreplate.

Som ulike bakteriestammer kan ha ulike overfølsomhet for oksidativt stress, en rekke H 2 O 2 konsentrasjoner bør testes. Økende konsentrasjoner av H 2 O 2 O 2 induserte oksidativt stress. Vekst kjennetegn ved forskjellige bakteriestammer kan sammenlignes for å bestemme sensitiviteten til oksidativt stress under et bestemt H 2 O 2-konsentrasjon. Analysen kan bli endret for å bestemme effektene av en spesiell forbindelse eller reagens, slik som NTBC, på en enkelt bakteriestamme når bakteriene er utsatt for oksidativt stress. Kolonier kan også telles for å bestemme den prosentvise reduksjon i bakteriekolonidannende enheter mellom forskjellige eksperimentelle betingelser.

Figur 3 viser en flekk plateanalyse av pyomelanin og ikke-pyomelanin produserende stammer av P. aeruginosa behandlet med og uten NTBC og utsatt for H 2 O 2 induserte oksidativt stress. Det er en klar difference i følsomheten for oksidativt stress når pyomelanin produserende bakterier er behandlet med NTBC, og også mellom bakteriene som ikke produserer pyomelanin forhold til de som ikke produserer pigment. Stammer som ikke produserer pyomelanin, enten naturlig eller på grunn av NTBC behandling, var mer følsomme for oksidativt stress enn stammer som produserte pyomelanin.

Figur 1
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av antibiotikum MIC-analyse 96-brønners plate-oppstilling (A) 100 ul av 2 x antibiotika av høyeste utgangskonsentrasjon er i rad A. rader B til H er fylt med 50 ul av enten LB + LB + eller NTBC DMSO uten antibiotika. (B) To gangers seriefortynninger utføres i rekker A til G, noe som resulterer i 50 ul fortynnet antibiotikum i hver brønn ved 2 x den ønskede sluttkonsentrasjon. Rad H er en kontrollbrønn for bacterial vekst uten antibiotika. 50 pl LB eller inokulum tilsettes til passende brønner, fortynning av antibiotika to ganger til sluttkonsentrasjonen. LB tjener som en kontroll for bakteriell forurensning i antibiotika. Gm, gentamicin; Km, kanamycin; Tob, tobramycin.

Figur 2
Figur 2: NTBC titreringer av pyomelanin produsenter og ikke-produsenter av P. aeruginosa. NTBC redusert pyomelanin produksjon i en doseavhengig måte i laboratorie- og kliniske pyomelanin produsentene, men hadde ingen virkning på pigmentproduksjon i stammer som ikke produserer pyomelanin. Modifisert fra referanse 12.

Figur 3
Figur 3: Spot plate analysen for oksidativt stress respons Bakteriestammer var fortynnet.d til den samme OD 600, serie- fortynnet 10 ganger, og flekket på LB-plater inneholdende forskjellige konsentrasjoner av H 2 O 2. De 0 mM H to O to plate Resultatene viste at alle stammene ble fortynnet på riktig måte, som indikert av et tilsvarende antall kolonier på hver av stedene for den samme fortynning til forskjellige stammer. Platene inneholdende H 2 O 2 viser at stammene var mer følsomme for oksidativt stress som konsentrasjonen av H 2 O 2 øket. Dette indikeres ved redusert kimtall i flekker i forhold til no H to O to tilstand, så vel som en reduksjon i kolonistørrelse. Modifisert fra referanse 12.

Sluttkonsentrasjon av NTBC (pM) Volum av NTBC (75,9 mm) for å legge til (ul)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2.64
300 3,95
600 7,91
900 11.86

Tabell 1: NTBC konsentrasjoner for å sette opp titreringer i LB. Denne tabellen gir ulike NTBC konsentrasjoner og tilsvarende mengde NTBC lager for å legge til en ml LB.

Sluttkonsentrasjonen av H 2 O 2 (mM) Mengde 9,79 MH 2 O 2 (30% vekt) for å legge til (ul)
0 0
0.2 2,04
0.4 4,09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

Tabell 2:. Konsentrasjonene av H 2 O 2 for å legge til LB-agar for oksidativt stress sted plateanalyse Tabellen gir diverse H 2 O 2 konsentrasjoner og den tilsvarende mengde konsentrert H to O to lager for å legge til 100 ml LB-agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmga :: tn - NTBC hmga :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicin 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0.5 0.5 0.5 0.5 0,25 0,25 0.5 0.5

Tabell 3: Antibiotikum MIC-resultatene Tre uavhengige kolonier ble testet i triplikat for hver stra.i. Re-trykt med tillatelse fra referanse 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics