إنتاج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي Ministrings

1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation
Published 2/29/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wong, S., Lam, P., Nafissi, N., Denniss, S., Slavcev, R. Production of Double-stranded DNA Ministrings. J. Vis. Exp. (108), e53177, doi:10.3791/53177 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بنينا الخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) DNA باسم الجينات التسليم بديل ناقلات غير الفيروسية المنتجة عبر منصة بسيطة في الجسم الحي. ministrings الحمض النووي تمتلك محة سلامة مشددة وأيضا كفاءة تسليم البضائع الحمض النووي للخلايا المستهدفة. ناقلات الحمض النووي التقليدية تحمل تسلسل الكائنات الحية بدائية غير مرغوب فيها، بما في ذلك الجينات للمضادات الحيوية المقاومة، زخارف الدليل السياسي الشامل، وأصول البكتيرية النسخ المتماثل، مما قد يؤدي إلى تحفيز استجابات المناعية المضيف. ويؤثر سلبا على التوافر الحيوي للناقلات الحمض النووي التقليدية أيضا نظرا للحجم الجزيئي. قد طبيعة دائرية لها أيضا نقلها التكامل الكروموسومات، مما يؤدي إلى الطفرات إقحامي.

يتم استئصال تسلسل البكتيرية من minivectors الحمض النووي، ولم يتبق سوى الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) وعناصر التعبير حقيقية النواة الضرورية. لدينا minivectors LCC الحمض النووي، أو ministrings الحمض النووي، وتخلو من متواليات البكتيرية المناعية. وبالتالي تحسين عشرالتوافر البيولوجي الاستخراجية والتعبير الحكومة الإسرائيلية. في حال والتكامل ناقلات في كروموسوم، فإن ministring LCC الحمض النووي يعطل قاتل الكروموسوم المضيفة، مما يزيل متحولة يحتمل أن تكون خطرة من السكان الخلايا المتكاثرة. ونتيجة لذلك، ministrings DNA تقديم فوائد الحمض النووي "minicircle" حين القضاء على إمكانية أحداث التكامل ناقلات غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع البلازميدات التقليدية والتي إسوي مغلقة تساهمي (CCC) نظرائهم دائرية، ministrings الحمض النووي تثبت التوافر البيولوجي المتفوق والكفاءة ترنسفكأيشن، وحركية هيولي - وبالتالي فإنها تتطلب كميات أقل من السطحي الموجبة لترنسفكأيشن فعالة من الخلايا المستهدفة.

لقد شيدت على بعد خطوة واحدة محرض في نظام الجسم الحي لإنتاج ministrings الحمض النووي في القولونية التي هي سهلة الاستخدام وسريعة، وقابلة للتطوير.

Introduction

والهدف هو انتاج كميات قابلة للخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) الحمض النووي باستخدام كفاءة بسيطة وعالية من خطوة واحدة في الجسم الحي DNA نظام الإنتاج ministring للحرارة محرض. توفير ministrings DNA استراتيجية آمنة وفعالة غير الفيروسية لإيصال الحمض النووي. فهي تجمع بين سلامة ناقلات LCC مع كفاءة minicircles الحمض النووي، وأيضا توفر بديلا آمنا للناقلات المشتقة من الفيروس دون المساس كفاءة ترنسفكأيشن.

من أجل نظام تسليم التحوير لتكون ناجحة، يجب على ناقلات الحمض النووي يدخل الخلية المضيفة الهدف والتعبير عن التحوير المشفرة (ق). وهناك العديد من الحواجز الخلوية التي يجب التغلب عليها في الممارسة العملية، لا سيما في أنظمة الثدييات. من أجل تجنب تدهور التي كتبها nucleases المصل وكشف المناعي عن طريق الجهاز الشبكي البطاني، يجب أن يكون ناقلات الحمض النووي الحيوية والمناعة متوافق مع النظام المستهدف. يتم هضم الحمض النووي دون وقاية بسرعة nucleases البلازماويتكون الغشاء البلازميد الحواجز البروتين الدهني كثيفة جدا ناقلات الحمض النووي يجب أن تكون قادرة على عبور بسرعة غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة. مرة واحدة في الخلية، ويجب أن ناقلات اجتياز السيتوبلازم وتمر عبر الغشاء النووي لدخول نواة للتعبير عن التحوير. وتركز تقنيات توصيل الجينات غير الفيروسية على تعزيز نسيجيا وخلية استهداف. ومع ذلك، فإن استخدام البلازميدات التقليدية مع هذه التقنيات يقلل من كفاءة ترنسفكأيشن بسبب وجود تسلسل البكتيرية المناعية، التي تسكت بسرعة التعبير الجيني 1،2. البلازميدات التقليدية عادة ما تحمل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية للصيانة في أنظمة بدائية النواة. ومع ذلك، هذه قد تنتج الآثار الضارة المحتملة في المضيف البشري أو نقلها مقاومة طبيعيا النباتات المضيفة عن طريق اثار نقل الجينات الأفقي. تحتوي على البلازميدات التقليدية أيضا ثنائي النوكليوتيد الدليل السياسي الشامل الزخارف والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابة يمونوستيمولاتوري غير المرغوب فيها، ويحتملخفض أو إسكات التعبير التحوير.

كما تتألف بشكل حصري من الكاسيت التعبير حقيقية النواة، minivectors الحمض النووي، مثل minicircles الحمض النووي هي البديل الأفضل لتوصيل الجينات كما أنها تظهر تحسين التوافر البيولوجي خارج الخلية والخلايا وتحسين التعبير الجيني نظرا لانخفاض حجمها وغياب عناصر بدائية يمونوستيمولاتوري 4. انخفاض حجم فارس متجه نحو أفضل فيما يتعلق مقاومة قوى القص المرتبطة في إدارة الجسم الحي إلى موقع الهدف 5. عدد نسخة أعلى من ناقلات لكل وحدة كتلة يتطلب أقل ترنسفكأيشن الكاشف، وبالتالي تقليل سمية. ومع ذلك، في حالة من التكامل ناقلات عشوائي في الكروموسوم المضيف، دائري تساهميا مغلقة (CCC) ناقلات، بما في ذلك minicircles الحمض النووي والبلازميدات التقليدية ونقلها استمرارية الجزيئية، وبالتالي قد تؤدي إلى الطفرات إقحامي، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة 7. أضيق الحدود ناقلات الجينات المحددة مناعيا (ذبابة) 8 وناقلات الصغيرة الخطي 9 (MiLV) هي ناقلات LCC الحمض النووي وضعت في المختبر. وقد عرضت ناقلات ذبابة تصل إلى 17 أضعاف تحسن التعبير التحوير في الجسم الحي مقارنة ب DNA البلازميد التقليدية ناقلات 11، وأظهرت نتائج واعدة في لقاح 10 و السرطان 8 العلاج الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لهيكل خالية من التواء من minivector LCC، مطلوب أقل كاشف ترنسفكأيشن بالمقارنة مع CCC supercoiled نظيره، وبالتالي تقليل سمية 7.

وقد أثبتت لنا تعزيز ناقلات LCC الحمض النووي، ministrings الحمض النووي، والكفاءة العالية والتعبير bioavaiتقلقل 7. وعلاوة على ذلك، يتم إنتاج ministrings الحمض النووي على المجراة نظام الإنتاج للحرارة محرض خطوة واحدة، وهو البديل المناسب وفعالة من حيث التكلفة لذبابة وMiLV LCC ناقلات، والتي تتطلب خطوات متعددة في المختبر. نظام الإنتاج ministring الحمض النووي ليكون أظهر هو عملية للحرارة محرض بسيطة أجريت في الجسم الحي، مما يجعلها على حد سواء فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير بسهولة. يستغل هذا النظام يرسينيا القولون عاثية المستمدة PY54 أبيب / بال protelomerase نظام إعادة التركيب 12 لفصل الحد الأدنى من حقيقيات النوى كاسيت التعبير من العمود الفقري البلازميد في بدائيات النواة. لقد المهندسة الإشريكية القولونية الخلايا (W3NN) للتعبير عن أبيب protelomerase تحت سيطرة للحرارة محرض الجراثيم λ المروج، CI [تس] 857 13. على التعبير، تل protelomerase يعمل على مواقع بال الهدف موجودة داخل مواقع تقع على البلازميد السلائف "سوبر تسلسل" (SS)لانتاج منتجات LCC، والتي من ministring الحمض النووي يمكن بعد ذلك تنقيته (الشكل 1). مواقع SS على DNA البلازميد ministring السلائف أيضا تشفير المواقع المستهدفة لrecombinases الأخرى بما في ذلك لجنة المساواة العرقية recombinase (السلمون المدخن)، TelN protelomerase (telRL) وFLP recombinase (FRT)، مما يسهل إنتاج LCC إسوي وminivectors CCC من البلازميد السلائف واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، ويحيط كل موقع SS على كلا الجانبين من SV40 محسن (SV40e) متواليات، التي تعمل على تحسين النبات النووي 14. لقد أثبتنا في أماكن أخرى أن إضافة المتعاقبة من SV40e يمنح تدريجيا الزيادة المقابلة في كفاءة ترنسفكأيشن 7. البلازميد السلائف (PDNA MiniString أو PDMS) يحتوي على polylinker (الشكل 1) لتسهيل إدخال أي الجين المطلوب من الاهتمام في الانصهار النسخي مع مراسل الفلورية الخضراء (GFP).

تكنولوجيا الحمض النووي minivector قدأن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، والتقييمات نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات "مصغرة" مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية منصة الإنتاج خطوة واحدة بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات، ويقدم صورة الأمان العالي.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافات

  1. لLB + الأمبير: إعداد 500 مل من لوريا، Bertani مرق (LB) تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. الملحق مع الأمبيسلين لتسفر عن تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  2. لمكافحة السل + الأمبير: الاستعداد لكبيرة (500 مل أو أكثر) مجلدا من ministring الإنتاج. إعداد 600 مل من معقم رائع مرق (السل) تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. الملحق مع الأمبيسلين لتسفر عن تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  3. للآجار LB + الأمبير: إعداد عقيمة لوحات أجار LB من خلال إعداد LB + الأمبير تستكمل مع 15 غرام / لتر من أجار. قسامة ما يقرب من 15-20 مل في أطباق بتري معقمة وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  4. إعداد لوحة مسحة من W3NN [PDMS] من تسليط الضوء على جو معقم و مطهر W3NN [PDMS] الخلايا على آجار LB + الأمبير. احتضان overni لوحةGHT عند 30 درجة مئوية، حتى المستعمرات واحد يمكن ملاحظتها. لا احتضان W3NN فوق هذا درجة الحرارة لتجنب derepressing التعبير protelomerase.
  5. نقل جو معقم و مطهر 5 مل من LB + الأمبير في أنبوب اختبار معقمة. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من W3NN [PDMS]، فحقن هذا الحجم مع مستعمرة واحدة من لوحة متتالية. احتضان بين عشية وضحاها الثقافة في 30 درجة مئوية في شاكر في 230-250 دورة في الدقيقة.

2. مرحلة النمو

  1. جو معقم و مطهر نقل 10 مل من LB + الأمبير إلى العقيمة 125 مل دورق مخروطي وتطعيم مع 100 ميكرولتر من ثقافة W3NN [PDMS] بين عشية وضحاها إلى استعداد LB + الأمبير، مما يجعل التخفيف 1: 100.
    1. لكميات أكبر، إضافة 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 50 مل من السل + الأمبير في 250 مل دورق مخروطي، بدلا من LB + الأمبير.
    2. بدلا من ذلك، كما استخدم ثقافة الثانية "تمثيلية" في الخطوة 2.2.
  2. احتضان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى طريق مسدودالبنية يصل المتوسط ​​إلى مرحلة سجل في وقت متأخر، والتي تحمل الكثافة الضوئية (OD) أو الامتصاصية: 600 = 0.8. بعد 1-2 ساعة، وينبغي أن تبدأ على المدى المتوسط ​​وتظهر عكر للعين المجردة.
    1. نقل جو معقم و مطهر 1 مل من ثقافة إلى كوفيت معمل نظيفة.
    2. قياس الامتصاصية خفيفة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية تجاه مع الطول الموجي لتعيين 600 نانومتر. استخدام 1 مل من وسائل الاعلام التي كانت تزرع الخلايا لتعيين فارغة (LB أو السل). اختياريا، استخدم الثقافة تمثيلية من الخطوة 2.1.3 لهذه الخطوة بدلا من ذلك.
    3. إذا كانت الثقافة لم تصل بعد إلى OD المناسب، والعودة إلى شاكر والتحقق مرة أخرى مرة واحدة كل نصف ساعة. تحقق من OD أكثر كثيرا ما تقترب من 600 0.8.
  3. وبمجرد أن الثقافة قد وصلت مرحلة سجل في وقت متأخر، وأشار أ 600 = 0.8، جو معقم و مطهر نقل الثقافة إلى العقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي الثقافة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة. تفقد لبيllet في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. صب طاف مسح في وعاء النفايات واقية مناسبة. لا تعكر صفو بيليه الخلية.
  6. كرر الخطوات من 2،4-2،5 حتى يتم جمع كل الخلايا.
  7. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر LB + الأمبير. نضح باستخدام micropipette أو استخدام خلاط دوامة. لزيادة الإنتاج ministring، وإعادة تعليق بيليه من 50 مل السل + ثقافة الأمبير إلى 1 مل من الطازجة وسائل الإعلام LB + الأمبير.

3. Ministring الإنتاج

  1. جو معقم و مطهر إضافة 20 مل من LB + الأمبير في 125 مل دورق مخروطي والحرارة إلى 42 درجة مئوية. لزيادة الإنتاج ministring، وإعداد 500 مل من LB + الأمبير، مسخن الى 42 درجة مئوية.
  2. نقل إعادة تعليق في المتوسط ​​مسخن.
  3. احتضان عند 42 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى مرحلة السجل الماضية، وأشار أ 600 = 1.0. لا تترك 20 مل من ثقافة في 42 درجة مئوية الماضي 1 ساعة.
  4. خفض درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وترك الثقافة لعديtional 90 دقيقة. 500 مل، وترك الثقافة لفترة تحريض إضافية من 90-120 دقيقة ولا يقلل من درجة الحرارة.
  5. خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وترك الثقافة اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة درجات الحرارة بالاستعداد إضافية من 2 ساعة. 500 مل، تمديد بالاستعداد درجة الحرارة إلى 4 ساعات أو طوال الليل.

4. حصاد Ministrings

  1. جو معقم و مطهر نقل الثقافة إلى العقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة وتفتيش لبيليه.
  2. صب طاف في حاوية نفايات بيولوجية المناسبة من دون إزعاج بيليه. كرر حتى تم جمع كل الخلايا.
  3. الإبقاء على بيليه لاستخراج البلازميد مع أي الاستخراج التجاري والذيفان الداخلي عدة إزالة أو تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية لمدة استخراج لاحق.

Representative Results

بعد استخراج الحمض النووي، والمتبقي البلازميد السلائف، LCC العمود الفقري في بدائيات النواة، وministring الحمض النووي سيتم استردادها. العائد البلازميد العام ونقاء يمكن تقييم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ويقدر النقاء باستخدام نسبة الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260 / A280) حيث نسبة 1،9-2،0 هو الأمثل. جميع منتجات شركة الطيران الاقتصادي ومجلس التعاون الجمركي يمكن فصلها عن طريق الكهربائي للهلام الاغاروز (AGE) (الشكل 2). AGE يتصور نتائج ministring الإنتاج بعد تحريض الحرارة، قبل ministring تنقية. ويمكن إجراء تقييم نوعي لإنتاج ministring في هذه المرحلة من خلال مقارنة كثافة الفرقة من ministring (2.4 كيلوبايت) إلى البلازميد الأم (5.6 كيلوبايت) (الشكل 2). Ministring الحمض النووي يمكن استردادها عبر بروتوكولات استخراج الهلام البلازميد القياسية التالية AGE الشكل 3 يلخص ministring كفاءة الإنتاج في ظل ظروف مختلفة من المرجح أن تحدث أثناء الحملجي من البروتوكول. تم تحديد Ministring كفاءة الإنتاج على أساس كثافة الفرقة الحمض النووي باستخدام برنامج التحليل الخاص بالشركة المصنعة. أي برنامج كثافة مماثلة يمكن استخدامها لتحليل نتائج العمر.

الشكل 1
الشكل 1: لمحة عامة عن ministring إنتاج (A) وناقلات الأم يحتوي على polylinker في الانصهار النسخي مع جين مراسل، تحكمه في مواقع SS اثنين. العمود الفقري بترميز بيتا لاكتاماز المقاومة الأمبيسلين ويحتوي أيضا على العديد من المواقع قطع فريدة من نوعها في العمود الفقري للفي المختبر الهضم. (ب) نظرة عامة على بروتوكول الرئيسي. الخطوات 2) مرحلة النمو و3) Ministring الإنتاج تتمثل في رسم تخطيطي لتوفير التخطيطي الشامل للخطوات المعنية، وتسليط الضوء على البساطة من البروتوكول. (C) Ministring الحث. الحث الحراري من تعطيل كاظمة حساس درجة الحرارة، مما يسمح للتعبير الهاتف تليها النشاط أبيب على مواقع قوات الأمن الخاصة في البلازميدات الأم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: Ministring الإنتاج بعد الانحرافات من البروتوكول. 1: التحكم 2: Uninduced، 3: متضخمة، 4: Overinduced، 5: إزالة المبكرة. ministring الحمض النووي هو حوالي 2.4 كيلوبايت، LCC العمود الفقري هو 3 كيلوبايت، وpNN9 البلازميد الأصل هو 5.6 كيلوبايت. كثافة عصابة من ministring والعمود الفقري LCC العصابات مع انخفاض الانحرافات من البروتوكول، مشيرا إلى انخفاض العائد ministring. من اليسار إلى اليمين: 1 كيلوبايت سلم من إنجلاند Biolabs الجديدة؛ السيطرة، بعد بروتوكول. Uninduced، لا upshift درجة الحرارة؛ متضخمة، ودرجة الحرارة upshift الزيتوز مرحلة ثابتة. Overinduced، تمديد درجة الحرارة upshift. إزالة في وقت مبكر، أي بالاستعداد درجة الحرارة. تم استخراج البلازميدات باستخدام أدوات أوميغا BIOTEK EZNA البلازميد البسيطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: آثار الانحراف عن بروتوكول بشأن ministring كفاءة الإنتاج (PE) نتائج هي متوسط ​​3 محاكمات. ويقدر PE من شدة الفرقة النسبية تقاس باستخدام AlphaImager HP بعد عمر. تحدث انحرافات في الخطوات التالية: مراقبة، بعد بروتوكول. Uninduced، لا upshift درجة الحرارة في الخطوة 2. بدأ متضخمة، ودرجة الحرارة upshift خلال مرحلة ثابتة في خطوة 1.6. Overinduced، مدد upshift درجة الحرارة في خطوة 2.3. إزالة وقت مبكر، وخلايا إزالة واستخراجدون بالاستعداد درجة الحرارة في خطوة 2.3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نحن هنا وصف نظام بسيط لإنتاج ministrings LCC الحمض النووي باستخدام بروتوكول للحرارة محرض خطوة واحدة، والذي لا يتطلب أي معدات خاصة ما عدا ذلك الذي يستخدم في نمو البكتيريا نموذجي والتلاعب. ministrings الحمض النووي هي خالية من التواء، مستقرة خطية أشرطة التعبير الحمض النووي، وتخلو من العناصر الوراثية بدائية النواة. أنها يمكن أن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، وكذلك في تقييم نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات "مصغرة" مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية خطوة واحدة في منصة إنتاج الجسم الحي بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات من دون الحاجة إلى عمليات مكلفة متعددة في المختبر.

هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان أفضل إنتاج ministring (الشكلان 2 و 3). الحث الحراري هو الخطوة الأكثر أهمية لministring الإنتاج. انعدام تام للministring الإنتاج على الأرجح بسبب عدم وجود تحريض الحرارة (خلايا الاحتفاظ بدرجة حرارة 30 درجة مئوية)، حيث قمع التعبير protelomerase يمنع تحويل البلازميد تمهيدا لministring LCC. بعد بروتوكول تحريض الحرارة، ونتوقع كفاءة إنتاج ما يقرب من 75٪. الحث الحراري هو الأمثل في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. على الرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في ministring PE عند استخدام الخلايا في مرحلة ثابتة ( "شديد النمو"، الشكل 3)، ونحن لم نلاحظ تقريبا انخفاضا بنسبة 50٪ في العائد البلازميد بشكل عام. سيعتمد العائد على بروتوكول استخراج البلازميد المستخدمة. لإنتاج ministring الأمثل، وتحريك الاستقراء الحرارة في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. سوف إنتاج ministring الفقراء من المرجح أن تكون نتيجة لupshift درجات الحرارة لفترات طويلة أو insufficieالإقليم الشمالي درجة الحرارة بالاستعداد. وتثبيط لفترات طويلة upshift درجة الحرارة لأن ذلك ينشط E. القولونية استجابة الصدمة الحرارية 15، والتي قد تمنع النشاط protelomerase وتتداخل مع استقرار البلازميد. لذلك، توقيت بالاستعداد درجة الحرارة هو خطوة حاسمة أخرى لإنتاج ministring كفاءة. بدون فترة حضانة إضافية عند 30 درجة مئوية، ووجد ministring كفاءة الإنتاج لتكون فقيرة جدا ( "إزالة المبكرة"، الشكل 3). ويمكن أن يعزى ذلك إلى مقدار الوقت اللازم للتعبير أبيب والنشاط. وتنشأ طليعة العاثية ترميز PY54 أبيب protelomerase يصيب عادة يرسينيا، التي تنمو على النحو الأمثل حوالي 28 درجة مئوية 12، مشيرا إلى أن 30 ° C قد يكون أيضا أكثر الأمثل للنشاط أبيب.

نظام الإنتاج الحمض النووي minivector يستخدم منصة في الجسم الحي لتوليد عالية الجودة بكتيريا minivectors الحمض النووي خالية من التسلسل. تعديلات على البروتوكول واسمحوا ليNCLUDE تغيير وسائط النمو لتحسين البلازميد وإنتاج البروتين من أجل تعزيز نمو الخلايا خلال مرحلة النمو (السل بدلا من LB)، أو زيادة ministring إنتاج وتحويل الكفاءة. لكميات أكبر ثقافة (200 مل وأكبر)، بالاستعداد درجة الحرارة والحضانة عند 30 درجة مئوية ويجوز تمديدها ليلة وضحاها دون تأثير سلبي شديد على ministring PE. لقد قمنا بإدراج التعديلات في بروتوكول لدينا 500 مل الثقافات كمثال على ذلك. تنقية ministrings الحمض النووي يمكن التعجيل من خلال المختبر في نوكلياز داخلية الهضم من العمود الفقري في بدائيات النواة. وهناك عدد من المواقع المستهدفة نوكلياز داخلية (على سبيل المثال، PI-SCEI، PvuI، SCAI) متاح في العمود الفقري في بدائيات النواة من البلازميد السلائف، والتي يمكن أن تقطع لفضح خطية مفتوحة تنتهي، والسماح لفي المختبر تدهور العمود الفقري في بدائيات النواة. عزل ministrings من الأنواع ناقلات أخرى يمكن أيضا أن يتحقق من خلال تبادل أنيون غشاء اللوني 16.

واحد الحد الحالي يرتبط مع نظام الإنتاج ناقلات LCC الحمض النووي هو الحاجة إلى تنقية ministring الحمض النووي من غيرها LCC ومجلس التعاون الجمركي المنتجات. على الرغم من أن تنقية بسهولة باستخدام أساليب البلازميد العزلة القياسية، يمكن للخطوة العزلة لا يزال وضع غير مؤات في إعداد نطاق واسع. فصل ministring يمكن أن يكون استخدام AGE إذا كان ministring والعمود الفقري في بدائيات النواة LCC متشابهة جدا في حجم تستغرق وقتا طويلا. بدلا من ذلك، يمكن أن توفر أنيون تبادل غشاء اللوني الفصل أفضل من ministrings من الأنواع ناقلات CCC 16. درجة الحرارة upshift يمكن أن يكون الحد محتمل آخر، لأن درجات الحرارة العالية أيضا تفعيل استجابة الصدمة الحرارية في E. القولونية، مما يؤثر سلبا على البروتين المؤتلف ينتج 17 وبالتالي خفض معدلات البلازميد إلى ministring التحويل. نفيدكم مكان آخر أمثل من منصة الإنتاج للتحايل و / أو تخفيف هذه الآثار من الصدمة الحرارية 18. نحنكما الأمثل حاليا طرق للقضاء أو الحد من التلوث LCC العمود الفقري في بدائيات النواة في الجسم الحي.

التكامل الكروموسومات من ministring LCC الحمض النووي يعطل كروموسوم المضيفة ويخضع الخلية إلى موت الخلايا المبرمج. وهذا لا يقلل الآثار السلبية المحتملة من الطفرات إقحامي مثل تكون الورم وإسكات الجينات المجاورة، وبالتالي تحسين سلامتها. تأثير مميت ويمكن أيضا أن تكون بمثابة وسيلة مثالية للطرق في ودراسات استبدال الجينات من دون آثار جانبية مصاحبة والضرر من التكامل. ويمكن تطبيق ناقلات الحمض النووي ministring من أجل نقل والتعبير عن جينات البروتينات العلاجية، RNA، والأجسام المضادة، أو المستضدات إلى هدف معين في الجسم الحي أو محل الأليل وظيفية شر أو غير. يسمح للخطوة واحدة للحرارة محرض في الجسم الحي نظام الإنتاج بسيط ناقلات الحمض النووي ministring إلى أن تنتج بسهولة لتطبيقات سريرية أو الصناعية.

Disclosures

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

الكتاب أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) لتمويل هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli W3NN Mediphage strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFP Mediphage parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244620
Fisher BioReagents Terrific Broth Fisher Scientific BP2468500
BD Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific 214010
Ampicilin MP Biomedicals LCC 2190147
Ultrapure Milipore Water Fisher Scientific  Z00Q0V0US Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System
Surgical Gloves VWR (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
30 ml KIMAX Test Tubes VWR 89001-448
Spectrophotometer Cuvette Sarstedt 67.74
Sterile 15 ml Falcon Tubes  BD Falcon 62406-200,
Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  FroggaBio 2930-S0
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml BD Falcon 13-675-20
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml BD Falcon 13-668-2 
Micropipettor (100-1,000 μl) FroggaBio C1000-1
Micropipettor (20-200 μl) FroggaBio C200-1
Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) VWR 89079-472 
Sterile Pipette Tips (1-200 μl) VWR 89079-460
Fisher Scientific Economy Burner Fisher Scientific 03-917Q
Incubator Shaker New Brunswick Scientific  M1352-00000
Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980125 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980250 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980500 Aldrich 
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 335901 Model: Genesys 10 Vis
Floor Centrifuge Beckman Coulter  369001 Model: Avanti J-E
Benchtop Centrifuge Beckman 362114 Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific  02-215-365
1 kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10, (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6, (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21, (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19, (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118, (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3, (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3, (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7, (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21, (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21, (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11, (1), 154 (2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272, (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9, (2), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats