采用数字滴定PCR检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的BRAF V600E突变

本实验的总体目标是利用组织处理系统，从福尔马林固定石蜡包埋的参考标准细胞系中分离人类基因组DNA，随后采用数字液滴PCR（ddPCR）技术分析基因组DNA中的BRAF V600E突变。数字液滴PCR可帮助解答分子肿瘤学中的关键问题，例如检测RA序列突变的存在与否及其丰度，并在模板拷贝数较低的情况下实现核酸的精确定量。尽管本方法以标准细胞系进行演示，但也可应用于其他生物样本，只需确保针对目标DNA的提取条件进行优化即可。

该组织制备系统可在四小时内分离出多达48份无污染的人类基因组DNA样品，相较于其他手动操作方法具有明显优势。由于使用了磁珠，该系统的制备成本相对较高。然而，该方法更安全，且能产生高质量的产物。演示操作将由我们实验室的一名技术人员A和一名技术人员完成。

将使用组织制备系统（TPS）方案，在全自动DNA分离仪中进行DNA提取。首先打开仪器和计算机，启动运行控制软件，并将自动加载托盘插入TPS平台的加载区域。

接下来，按照本图所示，将试剂分别加入对应的槽中，并将四个样本放入样本载体架中。通过倒置3到5次，确保裂解缓冲液和洗涤缓冲液充分混匀，然后将其加入第4列相应的槽中。倒置混匀数次或轻微涡旋后，将洗脱缓冲液、磁珠和FFPE缓冲液加入第5列的小槽中，按指示位置留出两个槽为空。

将一个2毫升深孔板放置到板架上。在开始运行前，务必盖紧所有试管和试剂槽的盖子。确认液体废液瓶有足够的容量，并且固体废液瓶为空，且已用生物危害袋衬垫。

确认吸头弹出板位于废液组件中央。关闭前面板，启动软件，打开核酸提取主程序 ML starlet，执行 med 文件。

单击开始。仪器状态将从空闲变为运行中。输入本次运行的样本数量。

选择本次运行所需的移液方法。输入第一个高容量吸头的位置，并选择一个。如果所有托盘均已装满，则输入第一个标准容量吸头的位置，并选择一个。

如果所有托盘均已装满，仪器将自动执行后续步骤，无需用户干预。此处展示详细的实验流程，以避免污染。请遵循标准预防措施，例如佩戴手套并在洁净的PCR操作台中进行操作。

使用洁净的移液器和低蛋白结合度的离心管。在PCR条形管中配制反应混合液，将反应组分解冻并平衡至室温。用于数字液滴PCR或D-D-P-C-R分析的人基因组DNA样本，其最低浓度必须为3.3 纳克/微升。

配制PCR反应体系。将两份X-D-D-P-C-R预混液、20倍浓度的正向引物、反向引物和探针与每份纯化的DNA样本混合，并用蒸馏水定容至20微升。充分涡旋振荡混合液以确保均匀，短暂离心使管内液体全部沉降至管底，然后再进行分装。

按照制造商推荐的方案操作液滴生成仪。将试剂盒插入支架中，确保试剂盒上的缺口位于支架的左上方。向中间孔中加入 20 µL 含样品的反应混合液，向底部孔中加入 70 µL 生成油。

将垫圈固定在卡盒顶部。确保垫圈两端牢固地钩在支架的两侧，否则无法产生液滴生成所需的足够压力。

按下仪器顶部的绿色按钮，打开液滴生成器。当支架处于正确位置时，插入 cartridge。电源和支架指示灯均为绿色。

再次按下仪器顶部的按钮以关闭门并启动液滴生成。10秒后，液滴指示灯将闪烁绿色，表示液滴生成正在进行。当液滴生成完成后，三个指示灯均会变为稳定的绿色。

按下按钮打开门，从设备中取出支架。取下支架上的一次性垫圈并丢弃。请注意，芯片的上部孔中含有液滴，而中部和下部孔几乎为空，仅在液滴生成后残留少量油。

准备进行常规PCR扩增。按照仪器制造商的操作说明，将每个样品管中微滴从 cartridges 的顶部孔转移至推荐的96孔PCR板中的单个孔，每孔转移40微升，吸取微滴时应缓慢轻柔，以尽量减少转移过程中微滴的剪切。微滴转移完成后，必须立即密封PCR板，以防止蒸发。

将封板仪的温度设置为 180 摄氏度，时间设置为 5 秒。按箭头打开托盘门。将支撑块放置在托盘上，使 96 孔面朝上。

将 96 孔板放置在支撑块上，并确保所有板孔与支撑块盖对齐。使用一张箔膜密封 96 孔板，所用箔膜板密封条需与 PCR 板封膜仪及液滴读取仪中的针头兼容。当 96 孔板固定在支撑块上并用可固化箔膜密封后。

按下密封按钮。托盘将关闭并开始加热顶盖。密封完成后，门会自动打开。

从加热模块上取下反应板，然后移除加热模块。通过检查每个孔上方的凹陷处，确保反应板的所有孔均已密封。每个孔上方的铝箔密封情况应清晰可见。

密封后，将微孔板置于热循环仪中进行扩增。按照方案文本中详述的参数进行常规PCR扩增。待液滴中核酸靶标的PCR扩增完成后。

下一步是使用双色检测系统对每个液滴进行单独分析。通常，液滴读取仪会设置为检测FAM和VIC报告荧光染料。单击“冲洗系统”以启动液滴读取仪，并使其准备好进行D-D-P-C-R分析。

将反应板放入液滴读取仪中，点击开始。当液滴读取完成后，打开门并从仪器中取出板架。取出96孔板并弃置。

随后使用协议文本中所述的数据分析软件进行DNA突变谱分析。在此D-D-P-C-R分析中，研究了RAF V600E突变。荧光信号被检测并处理成二维散点图显示。

使用自定义软件绘制适当的门控区域，并统计每个门控区域内液滴的数量。所有样本中位于粉红色截断线以上的蓝色点所代表的液滴为阳性。在两个图中，突变型RAF V600E野生型bra液滴由绿色点表示。

底部的灰色点被视为荧光背景。随后根据检测到的野生型 bra 和 brav V600E 模板浓度的相对百分比计算出总的突变等位基因频率。一个学期。在此姿势下，个体分析可在四小时内完成。

其他样本，例如 A PPT 液体活检，可用于回答更多问题，如癌症进展监测，在其开发之后。该技术为分子肿瘤学领域的伴随诊断研究人员探索多种突变检测铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何操作组织处理系统及数字微滴 PCR-SA，以实现特定点位的 DNA 突变检测。