分析单个人类胚胎干细胞通过定量RT-PCR

该程序的总体目标是使用单细胞定量逆转录聚合酶链反应 （R-T-P-C-R） 分析单个人类胚胎干细胞的基因表达水平。这是通过首先使用荧光激活细胞分选将单个细胞分选到含有细胞裂解缓冲液的 96 孔板的每个孔中来实现的。第二步是逆转录 RNA，从单细胞裂解物中生成 CDNA。

接下来，CDNA 通过聚合酶链反应扩增。最后一步是对扩增的 CDNA 进行定量 R-T-P-C-R。最终，该测定可用于研究异质性群体（如人胚胎干细胞）中的基因表达。

该技术相对于现有的单细胞定量人工血管的主要优点是，这种方法、脑电图和传真纯化之前更稳健。OCT 四个 EGFP 人胚胎干细胞或 Hess 从 60 毫米培养皿中分离出来。取出所有培养基，加入 1 毫升 Accutane，并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。

用 1 毫升人 ES 培养基中和 Accutane，离心机使细胞沉淀，弃去上清液后，将细胞重悬于传真缓冲液中，并将浓度调整至每毫升 6 个细胞的 10 倍。接下来，将细胞样品穿过 35 微米的细胞过滤器盖管。在细胞分选前将试管储存在冰上。

通过制备含有 1 μL 单细胞 D Ns、1 和 9 μL 单细胞裂解液的预混液来开始此程序。对于每个孔，将 10 微升混合溶液转移到 96 孔 PCR 板的每个孔中，用于传真分析程序，细胞分选仪将单个 EGFP 阳性细胞分选到 96 孔 PCR 板的孔中，细胞分选后将样品孵育 5 分钟用于细胞裂解。要终止裂解反应，请加入 1 μL 终止液，并在室温下孵育 2 分钟。

要开始此过程，首先向 96 孔板的每个孔中加入 0.5 微升 20 微摩尔 SMAT 15 和 SMAA 引物的 Eloqua。将样品在 80 摄氏度下加热 5 分钟。然后加入 4 微升 5 x 缓冲液、2 微升 DTT、1 微升逆转录酶和 1 微升 D 和 tps。

对于每个孔，在热循环仪中进行逆转录。将热程序设置为 42 摄氏度 90 分钟，然后 85 摄氏度 5 分钟。要在逆转录完成后灭活逆转录酶，向每个 CDNA 样品中加入 4 微升 exo 试剂，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟以消化过量的寡核苷酸，然后在 80 摄氏度下孵育 15 分钟。

要灭活 exo 试剂，请用 SMAP 两个引物的两个纳摩尔制备 PCR 反应混合物。加入 10 μL PCR 反应混合物。到每个逆转录样本。

进行扩增，包括 20 个变性循环、跪下和延伸，扩增样品后在单独的板中进行两组定量 R-T-P-C-R 反应，以确认 R-T-P-C-R 结果到 2 个 96 孔板的每个孔中加入 10 微升 2 x cyber green。PCR 预混液：1 微升扩增的 CDNA、2 个引物和 7 微升水。将程序设置为 95 摄氏度 3 秒，然后是 60 摄氏度 30 秒。

对于 40 个循环，去除跪姿步骤以减少引物的错误。在这项研究中，将微克量的 Hess 总 RNA 稀释至纳克和皮克水平，以评估技术变异性，并使用 MR 检测低量总 RNA 的差异 G-A-P-D-H 基因的定量 R-T-P-C-R。混合外壳的 NA 从 10 纳克/微升连续稀释至 0.1 皮克/微升。每个点显示按传真排序的连续稀释 mRNA 和单细胞 mRNA 的 CT 值。

观察到每个样本与 QR TPCR 结果之间存在相关性，几个单细胞显示相似的 CT 值。使用传真从 OCT 4 EGFP 报告基因 HESC 线中分选和选择强 EEG FP 阳性细胞。结果显示，与阴性群体相比，EGFP 阳性群体约为 60%，以验证不同批次的逆转录和扩增反应之间的一致性。

将传真纯化的单细胞裂解物分成两半，并将方案应用于每半以进行批量比较。观察到每半单细胞裂解物的 OCT 4 CT 值之间存在显著相关性。单个外壳基因表达的热图显示 OCT 4 表达的一致和稳健水平，但另一个干细胞标记基因 NAN og 的不同水平综合我们的结果表明，这种单细胞基因表达测定可用于研究多能干细胞的群体异质性。

观看此视频后，您应该对如何正确执行单细胞转录组的 QITP 有很好的了解。