Rensing av musehjerne Vessels

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I hjernen, det meste av det vaskulære systemet består av en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​som regulerer utveksling av molekyler og immunceller mellom hjerne og blod. Videre den enorme nevronale metabolske etterspørsel krever et øyeblikk til øyeblikk regulering av blodstrøm. Spesielt, avvik i denne forskriften er etiologiske kjennetegner de fleste hjerne patologi; inkludert glioblastom, hjerneslag, ødem, epilepsi, degenerative sykdommer (ex: Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom), hjernesvulster, samt inflammatoriske tilstander som multippel sklerose, meningitt og sepsis-indusert hjernen dysfunksjoner. Dermed forstå signal hendelser moduler den cerebrovaskulær fysiologi er en stor utfordring. Mye innsikt i cellulære og molekylære egenskapene til de ulike celletyper som komponerer cerebrovaskulær system kan oppnås av primær kultur eller celle sortering fra ferske dissosiert hjernevev. Derimot,egenskaper som celle polaritet, morfologi og inter relasjoner er ikke vedlikeholdes i slike preparater. Protokollen at vi beskriver her er laget for å rense hjernen fartøy fragmenter, samtidig opprettholde strukturell integritet. Vi viser at isolerte kar består av endotelceller forseglet med tett veikryss som er omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes, glatte muskelceller, så vel som de perivaskulære astrocytt endfeet membraner forbli festet til endotel-lag. Til slutt beskriver vi hvordan du utfører farging eksperimenter på renset hjernen fartøy.

Introduction

Riktig funksjon av sentralnervesystemet (CNS) krever en svært regulert ekstracellulært miljø, og dens metabolske krav er stor sammenlignet med andre organer 1. CNS er også meget følsom for et bredt spekter av kjemikalier, generelt ufarlig for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For å sikre korrekt funksjon, de fleste av CNS 'blodkar danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som kontrollerer strømmen av molekyler og ioner, samt passasje av immunceller mellom blod og hjerne, for derved å opprettholde riktig homeostase 2, men også å begrense inntrengning av terapeutiske legemidler, og dermed hindrer behandlinger nevrologiske lidelser 3. På cellenivå, er BBB i hovedsak består av omfattende tett veikryss mellom endotelceller, polarisert uttrykk for efflux transportører og en svært lav transcytose sats 4. Egenskapene og funksjonene til BBB er hovedsakelig forårsaket av neighboring celler 4. Spesielt pericytes spiller en viktig rolle ved indusering og vedlikehold av BBB 5,6. Å være kontraktile celler, pericytes også regulere blodstrøm 7 som gjør de glatte muskelcellene rundt store fartøy. Til slutt, astrocytter, de store glialceller i hjernen, sende store prosesser oppkalt endfeet rundt mesteparten av hjernen vaskulaturen 8 og modulere BBB integritet og immun quiescence 9, overføring av metabolittene til nerveceller 10, og indusere tett kopling mellom neuronal aktivitet og blodstrøm 11,12.

Muligheten til å studere de molekylære og cellulære egenskapene til cerebrovaskulær system er avgjørende for å karakterisere bedre sitt bidrag til hjernen fysiologi og patofysiologi. For å takle dette spørsmålet, har strategier for å isolere hjernens cerebrovaskulær system er utviklet, som gir mulighet for utarbeidelse av intakte hjerne fartøy fragmenter. Cerebral fartøy purification ble opprinnelig beskrevet ved hjelp av bovin hjerne 13 og forbedret og tilpasset til andre arter, særlig gnagere 14. I denne siste studien, ble bruken av filtre av varierende størrelse innført for å separere hjernen fartøy i fraksjoner anriket på fartøyer med forskjellige diametre. Interessant, i slike preparater, endotelceller holdt sine metabolske egenskaper 15, transporter funksjonalitet 16 og polarisering 17. Her beskriver vi i detalj denne protokollen og videre vise at isolerte kar beholde mesteparten av sin in situ strukturer. Endotelceller forbli koblet av tett veikryss og omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes og glatte muskelceller forbli festet til endotel-lag, samt perivaskulær astrocyttkulturer membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliale celler, nerveceller og oligodendrocytter elimineres. Til slutt beskriver vi en prosedyre for å utføre farging på isolerte hjernen fartøy. Inntil nå har de fleste av de molekylære og cellulære studier om cerebrovaskulær system har blitt utført på renset hjerne fartøyet cellene dissosiert ved celle-sortering ved hjelp av celle bestemte reporter musestammer eller farging baserte prosedyrer 18,19. Selv om disse teknikkene tillater isolering av nesten ren cerebrovaskulære cellepopulasjoner, isolerte celler helt mister sin morfologi in situ og interaksjoner, som i sin tur påvirker i stor grad deres molekylære og cellulære egenskaper. Protokollen er beskrevet her, noe som åpner for isolering av hele cerebrovaskulære fragmenter uten behov for spesifikke antistoffer eller transgene mus flekker, tilbyr et godt alternativ som den overordnede strukturen av isolerte cerebrale kar er bevart, og dermed minske konsekvenser for deres molekylære egenskaper. Isolerte kar kan deretter bli brukt for å studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som nylig beskrevet 20,21 22,23 protokoll er billig, lett å utføre og raskt tilpasningsdyktig i et hvilket som helst laboratorium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Solutions og Materials

  1. Forbered isolasjon skipsløsninger: B1, tilsett 1,5 ml HEPES 1M til 150 ml HBSS; B2, tilsett 3,6 g dekstran til 20 ml B1; B3, tilsett 1 g BSA til 100 ml av B1.
  2. Endre filterholderen ved å kutte bunnen av den øvre skru del.
  3. Forbered immunofarging løsninger: Fixation løsning, 4% Paraformaldehyde i PBS pH 7,4; Permeabilization / blokkeringsløsning, fortynn geiteserum til 5%, og Triton X100 til 0,25% i PBS pH 7,4.
    Merk: Fiksering er avhengig av typen av primære antistoffer anvendes.

2. Dissection

Merk: Sterile betingelser er ikke nødvendig, med mindre fartøyer benyttes for cellekultur formål.

  1. Forbered et 150 ml begerglass med 20 ml B1. Hold på is og dekk med parafilm for å unngå luftforurensningen.
  2. Dypt bedøve musen under en hette med en liten papirhåndkle dyppet i 1 ml ren Isofluran som er lagt into buret. Anestesi er bekreftet av en mangel på reaksjon på en tå klype. Drepe musen ved halshugging.
    MERK: Disse trinnene er utført i samsvar med nasjonale og institusjonelle bestemmelser.
  3. Valgfritt: Utfør intrakardiell perfusjon med 20 ml PBS 1x å eliminere blod innhold 24.
  4. Seksjon huden med en skalpell fra nakken til nesen og trekk den bort. Fjern alle forurensende hårene med PBS 1x.
  5. For å åpne skallen, først sette saks anteriorly til luktelappen, og åpner saksen til å sprekke skallen i to deler.
  6. Fjern forsiktig hjernen ved hjelp av en hjerne slikkepott. Dissekere ut årehinnen plexus fra sideventriklene som de ville forurense blodåre forberedelse 38.
    MERK: Valgfritt: Den endelige preparat vil inneholde parenkymceller og meninges fartøy. Hvis ikke ønskelig kan hjernehinnene trekkes av ved å følge prosedyren beskrevet av 38.
  7. Transfer hjernen i begerglasset som inneholdt B1 oppløsning på is. Opptil 8 hjerner kan behandles sammen.

3. hjernevev Homogenisering

  1. Ved hjelp av to skalpeller, manuelt og kraftig slå hjernen i B1 løsningen senere skaffe små biter på ca 2 mm.
  2. Homogenisere forberedelser med en automatisert Dounce homogenisator, utføre 20 slag på 400 rpm. Sikre at glassrøret holdes på is, og at den øvre del av douncer er i løsning når den beveger seg opp og ned, for derved å forhindre dannelse av luftlommer. Hvis flere prøver er forberedt, vaske douncer med ionisert vann mellom hver homogenisering.

4. Vessel Rensing

  1. Overfør homogenatet i et 50 ml plastrør og fortsette til sentrifugering ved 2000 g i 10 min ved 4 ° C. En stor hvit grensesnitt (for det meste myelin) vil danne på toppen av beholderen pellet (rød hvis ikke perfusjon ble utført).
  2. Kast supernatanten. Fartøyet pellet, og det hvite grensesnittet vil forbli festet sammen. Tilsett 20 ml iskald oppløsning B2 og riste røret manuelt og kraftig i 1 min.
  3. Fortsett til den andre sentrifugering ved 4400 g i 15 min ved 4 ° C. Myelin vil nå danne en tett hvitt lag på overflaten av supernatanten.
  4. Løsner myelin laget fra rørveggene nøye ved å holde røret og sakte dreie den for å tillate supernatanten å passere langs veggene. Kast myelin med supernatanten. Pelleten inneholdende fartøyene forblir festet i bunnen av røret.
  5. Blot innsiden av røret med et absorberende papir pakket rundt en 5 ml plast pipette og fjerne alle rester av væske, unngå å berøre fartøyet pellet. Hold røret opp-ned på et tørkepapir for å drenere eventuelle gjenværende væske.
  6. Suspendere pellet i 1 ml iskald B3 løsning ved å pipettere opp og ned med lav binding tips, keeping røret på is, og deretter legge ytterligere 5 ml B3 løsning. Sørg for at fartøy spres så mye som mulig og ikke danner aggregater.

5. Filtrering

  1. Forberede et beger på isen med 30 ml iskald B3 løsning. Dekk med parafilm for å unngå luftforurensningen.
  2. Plasser en 20 mikrometer maskefilter på en modifisert filterholderen på toppen av en becker kolbe og likevekt ved å bruke 10 ml iskald B3 løsning.
  3. Hell fartøyet preparatet på filteret og skyll fartøyene med 40 ml iskald løsning B3.
  4. Gjenopprette filteret med rene pinsett og umiddelbart dyppe den i begeret inneholder B3 løsning. Ta av fartøyer fra filteret ved å riste den forsiktig.
  5. Hell begerinnholdet i et 50 ml plastrør og sentrifuger ved 2000 g i 5 min ved 4 ° C.
  6. Merk: Alternativt kan hjernen skipenes suspensjon fra trinn 4.6 bli filtrert bort på en 100 mikrometer-mesh filter.I dette tilfellet er større fartøy fortrinnsvis holdes tilbake på filteret, mens gjennomstrømnings inneholder microvessels (hovedsakelig kapillærer), som deretter filtrert på en 20 um maskefilter som ovenfor.
  7. Resuspender pellet av mikrokar i 1 ml iskald løsning B3 og overføre den ved å pipettere den inn i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Sentrifuger ved 2000 g i 5 min ved 4 ° C.

6. Fiksering, Permeabilization og Blocking

  1. Overfør fartøy ved pipettering til 0,2 ml PCR-rør som inneholder PBS ved hjelp av en 1,0 ml lav binding tips. Vær forsiktig så du ikke berører de fartøyene som de kan forholde seg til den ytre delen av spissen. Utføre alle de følgende trinnene under en kikkert mikroskop.
  2. For hver av de følgende mellom endringer, la rørene på is inntil fartøyene har nådd bunnen, og pipetter ut det meste av væsker ved hjelp av lange og ting gel-lasting pipettespisser.
  3. Fjerne det meste av PBS og tilsett 200 ul av bindemiddel-løsning.Suspen fartøyene ved å riste forsiktig og inkuber i 20 min ved RT.
  4. Pipette ut fiksativ løsning og erstatte den med 200 ul 1x PBS (første vask), inkuberes i 5 min ved RT og gjenta dette trinnet 3 ganger. Hver gang, må du kontrollere at skip har riktig sunket til bunnen av rørene og pipette ut 1x PBS, som sikrer fartøyene ikke rørt.
  5. Etter den siste vaskingen, erstatte 1 x PBS ved permeabilization / blokkeringsløsning og inkuber 1 time ved RT, resuspendering fartøyene ved forsiktig risting fra tid til annen.

7. Farging

  1. Sett på permeabilization / blokkering løsning med blanding av primære antistoffer (se referanser til de antistoffer som brukes her og fortynninger i Materials mal tabell) utvannet i permeabilization / blokkering løsning, og inkuberes ved 4 ° CO / N.
  2. Etter 3 vaskinger i PBS ved romtemperatur, inkuberes fartøy med blandingen av sekundære antistoff fortynnet i PBS i 2 timerved RT.
  3. Merk: Vi anbefaler på det sterkeste å utføre atom farging med Hoechst (1: 2000) eller DAPI (1: 2000) for å skille fartøy fra mulig forurensende hår eller støv under mikroskopet.
  4. Etter 3 vaskinger i PBS, resuspender fartøyene i 50 ul PBS.

8. Montering og Observasjon

  1. Forbered en spiss med et silikonisert glasskapillar: klippe en P200 pipette tips å bruke en skalpell og justere kapillær inne. Den omtrentlige volum av kapillaren er 40 pl.
  2. Overføre skipene til et glass lysbilde med silikonisert glasskapillær og fjerne væsken forsiktig med et stykke tørkepapir.
  3. Påfør en eneste dråpe monteringsmedium på skipene og hold et dekkglass på 45º at rulle å spre seg langs kanten av slip. La gå av dekkglass og la medium for å spre sakte. La det tørke O / N på RT med beskyttelse mot lys. Fartøy kan observeres under et fluorescerendeent konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi en protokoll som åpner for mekanisk isolering av hjernekarene 14. Figur 1 oppsummerer hovedtrinnene i denne teknikk. Arkitekturen i hjernen fartøy er kompleks og inneholder flere celletyper, dvs. endotelceller forseglet av tett veikryss og omgitt av pericytes, glatte muskelceller og astrocyte fot prosesser 9. Således, etter isolering av hjernen fartøy ønsket vi å karakterisere strukturen av rensede skar ved farging som beskrevet i annen del av protokollen. Agrin, en komponent av endotelial basal lamina ble kontinuerlig og homogent merket på endoteloverflaten (figur 2A). Zona okkludens-en (ZO-1), en av komponentene i endoteliale tett veikryss ble immunfarget med ingen åpen diskontinuitet, hvilket antyder at endotelceller tett veikryss ble bevart (figur 2B). Den pericyte endothelial dekning, etiketted av NG2, dukket opp nesten kontinuerlig som tidligere beskrevet 25 (Figur 2C). Til slutt, glatt muskel aktin merking viste nærvær av en tett glatt muskelcelle lag på overflatene av større rensede fartøy (figur 2D). Disse resultatene viste at den totale in situ hjerne kar struktur ble konservert i de isolerte fragmenter fartøyet.

Astrocytter har blitt vist å sende store prosesser, eller 'endfeet' til overflaten av fartøyene, vindsperre nesten utelukkende det cerebrovaskulære system 8. Deres tett samspill med fartøyer og deres rolle i å opprettholde og regulere ulike cerebrovaskulære funksjoner, betegnet dem som en viktig del av neurovascular enheten 9. Vi analyserte videre astrocyte vaskulær dekning av isolert hjernen fartøy. Immunomerking av astrocytic mellomliggende filament GFAP, vanligvis til stede i hele astrocytt (figur 3A), was bare delvis tilstede på rensede fartøy som viser noen korte fibre på endoteloverflaten (figur 3B-C). I motsetning til dette ble Connexin 43, et gap junction protein høyanriket i perivaskulær astroglial membraner 26, sterkt detekteres ved overflaten av rensede store kar (figur 3D) og kapillærer (figur 3E). Tilsvarende immunomerking av aquaporin-4 (Aqp4), et medlem av familien vannkanalen i stor grad uttrykt ved nivået for astrocyttkulturer membraner som vender mot fartøyene 27, 26, som beskriver veggene av isolerte kar (figur 3F-G). Selv astrocytter ikke var co-renset med fartøy, forble deres perivaskulære endfeet membraner festet under den mekaniske prosedyren av hjernen fartøy isolasjon.

Til slutt, vi undersøkte mulig forurensning av våre forberedelser av andre nervecelletyper. Immunomerking av nevronale intermediate filamenter (NFM) (Hornung et al, 1999) viste tilstedeværelsen av få gjenværende fibre festet til fartøyene, noe som indikerer en mulig co-rensning av noen få neuronal klemmene (figur 4A-B). Mikroglia, merket av Iba1 (Figur 4C-D) og oligodendrocytter, merket av Olig2 (Figur 4E-F) ble ikke oppdaget i isolerte fartøy. Dermed nevroner, mikroglia og oligodendrocytter ble ikke co-renset med hjernen fartøy.

Til sammen indikerer disse resultatene på at den beskrevne protokollen tillater rensing av strukturelt konservert hjerne fartøyet fragmenter, hvorpå perivaskulær astrocytic membraner forblir festet.

Figur 1
Figur 1. Oversikt Scheme of the Brain Vessel Rensing Protocol. Er de viktigste trinnene presenteres. Denne skisse viser de tre mulige fartøyet fraksjoner som kan oppnås, avhengig av fi- lters brukt (20 eller 100 mikrometer-mesh). S1: microvessels og store fartøyer, S2: store fartøy og S3:. Microvessels Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Isolerte Vessels beholde de fleste av sine In Situ Structure. Confocal bildeprojeksjoner av immunostained isolert mus hjernen fartøy. (A) Basal lamina immunolabelled for Agrin (red). (B) endotelceller tett veikryss immunolabelled for Zonula okkludens (ZO-en ) (rød). (C) pericytes immunolabelled for NG2 (red). (D) Glatte muskelceller immunolabelled for glatt muskulatur Actin (SMA) (rød). Atomkjerner er farget med Hoechst (blå).pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. astrocytt Endfeet Membraner forbli festet til Purified Vessels. Confocal bildeprojeksjoner. (A) Bilde av en hjerne-delen viser en cortical fartøy immunostained for endothelial PECAM (hvit), astrocytic GFAP (rød) og Connexin 43 (Cx43) (grønn (B, C) ​​GFAP immunomerking (grønn) på overflaten av en isolert kapillær merket ved Isolectin b4 (hvit) (B) eller av et stort fartøy som er merket for Smooth Muscle Actin (SMA) (rød) (C)).. (C) er en Re-print med tillatelse fra 20 (D, E) Cx43 immunomerking (grønn) på overflaten av en isolert kapillær merket med Isolectin b4 (hvit) (D) eller av et stort fartøy merket for glatt muskulatur Actin (SMA) (rød) (F, G) aquaporin 4 (Aqp4) immunomerking (grønn) på overflaten av en isolert kapillær merket ved Isolectin b4 (hvit) (F), eller av et stort fartøy som er merket for Smooth Muscle Actin (SMA) (red) (G). Atomkjerner er farget med Hoechst (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:.. Nevroner, Microglia og Oligodendrocytter er ikke samarbeids renset med hjernen fartøy Confocal bildeprojeksjoner (A, B) neurofilament (NFM) farging på en 20 mikrometer tykk hippokampalt snitt (rød) (A) og renset hjernen fartøy ( B). (C, B) mikrogliaceller Iba1 farging på en 20 mikrometer tykk cortical skive (red) (C) og renset hjernen fartøy (D). (E, F) oligodendrocytt Olig2 farging på en 20 mikrometer tykk cortical skive (rødt) (E) og renset hjernen fartøy (F). Cellekjernene er farget av Hoechst (hvit ), endotelet ved Isolectine b4 (Ib4) (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blod-hjerne-barrieren regulerer passasjen av fysiologiske stoffer i og ut av CNS og beskytter den mot potensielt skadelige stoffer som er tilstede i blodet. Det er involvert i flere CNS sykdommer, inkludert nevrodegenerative sykdommer 2 og hjernesvulster 28. Den ekstremt lave permeabilitet av BBB hindrer også passasje av terapeutiske midler rettet mot nerveceller og utvikling av metoder har til hensikt å reversibelt åpne BBB uten noen skadelige konsekvenser for hjernen er et meget aktivt forskningsfelt 3. Mange forsøk har vært gjort for å utvikle modeller og verdifulle teknikker slik cellulære, molekylære og farmakologiske undersøkelser av BBB, og i særdeleshet, protokoller for å isolere fartøy fra gnagerhjerne. Første forsøk bare samlet microvessels fra mekanisk dissosiert hjernevev bruker variable pore størrelse maskene å forkaste forurensende hjernen parenkymceller 13, 29, 30, 31. Tetthetsgradient-sentrifugering ble senere innført knyttet til filtrering av hjernen fartøy på nylon nett eller glasskuler søyler 32, 33, 15. I disse prosedyrene, glass perle versus nylon mesh filtrering syntes å forbedre avlinger og høy-versus lav hastighet sentrifugering, microvessel renhet, selv om høyhastighetssentrifugering induserer også skjærspenning som påvirker genekspresjon 15, 32. Et ytterligere trinn med enzymatisk fordøyelse ble også innført i enkelte protokoller som følge av dissosiasjon trinn 34 med sikte på å løsne adherente neuroner og astrocytter å øke microvessel renhet 35. Imidlertid kan en overdreven pre-fordøyelse også forstyrre microcapillary integritet 36, 37. Mer nylig har immuno-laser capture microdissection (immuno-LCM) har vist seg å muliggjøre opphenting av fartøy eller til og med av distinkte cellepopulasjoner i vessels, for å se på endringer i BBB genekspresjon, selv om mengden av materialet oppnådd ved denne teknikk er svært begrenset 23.

Her presenterer vi en prosedyre for en mekanisk isolering av hjernen fartøy opprinnelig utarbeidet av Yousif et al 14. Det gir muligheten for å oppnå rene hjernen fartøy, og for å skille dem i henhold til deres diameter. Denne protokollen later ikke til å tillate rensing av hele hjernen vaskulær rommet, og vi ikke sammenligne sin effekt med de tidligere publiserte protokoller. Men gjør den generelle prosedyren svært enkel og billig fravær av gradient, bestemte kolonner og høyhastighets sentrifugeringstrinn. Viktigere, anbefaler vi på det sterkeste å fjerne årehinnen plexus som beskrevet av 38 før homogenisering av hjernen, som vi opplevde det som en mulig kilde til forurensning. Andre viktige anbefalinger er: 1) bruk av "low binding" plast material (særlig pipetter) siden fartøyene holder seg naturlig til ubehandlede plast. Utelate dette punktet vil resultere i tap av de fleste fartøyer; 2) forsiktig likevekt av nylon filtre før filtrering (trinn 5.2); 3) resuspensjon av pelleten i så mye buffer som mulig før filtrering for å øke renheten av prøven; 3) Om nødvendig, kan blodceller og proteiner fanget i rensede fartøy bli vasket ut ved intrakardial perfusjon med PBS før disseksjon hjerne; 4) Utbyttet av fartøyer rensede kan bli forbedret ved å gjenta separasjon fra myelin i dekstran to eller tre ganger (trinn 4.2) 39,40. For farging, anbefaler vi på det sterkeste: 1) å utføre en kjernefysisk merking for å skille fartøy fra forurensende hår og støv som antistoffer har stor uspesifikk affinitet; 2) for å unngå oppsamling av fartøyene ved sentrifugering før hvert medium endring siden det kan resultere i dannelse av en uløselig ball av materiale.

Rensing av intakte hjernen fartøy presentere store fordeler for å studere de molekylære egenskapene til BBB. Selv om det spesifikke eller anriket endotel- og pericyte gener og veier er identifisert ved transcriptomic og proteomic studier på enkeltcelletyper 18,19, er det velkjent at dissosiasjon og cellesorteringsteknikker føre til tap av celle polaritet og morfologi, så vel som forbindelsen mellom celletyper, noe som sterkt påvirker deres molekyl profiler. I denne sammenheng, å holde hele vaskulære rommet intakt, slik det er beskrevet her, med unntak av astrocytter, kan representere en stor fordel. Videre, sammenlignet med cellesortering, tillater rensing av hjernen fartøy krever ikke bruk av særskilte transgene rapportørmusestammer eller lange immunofarging baserte prosedyrer. En annen fordel ved bruk av hjernen fartøy er muligheten for å tilpasse renseprotokoll for andre arter som allerede er vist for murine14, Bovine13 så vel som hos mennesker 41,42. Til slutt vil en videreutvikling av den foreliggende teknikk er den in vitro-kultur av fartøyer hjerne fragmenter. Co-kultur av rensede fartøy med primær astrocytter nevroner og mikrogliaceller celler kan bidra til å montere neurovascular enheten på en nøyaktig måte enn komplekse tre-dimensjonale flercellede kultur systemer hvor cellene er først isoleres og renses før de blir satt sammen igjen 43. Dermed rensing av intakte hjernen fartøy kan være til stor hjelp for utvikling av hvilken som helst type av in vitro analyser for å studere BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av LABEX Hjerneklubben og ved ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose no plakk)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics