Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

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Curry, F. R., Clark, J. F., Adamson, R. H. Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery. J. Vis. Exp. (103), e53210, doi:10.3791/53210 (2015).

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Abstract

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse.

Introduction

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, en microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para estos flujos y las propiedades de permeabilidad de la pared vascular pueden ser directamente evaluado. Además, mediante el control de la composición del líquido que rodea al de los microvasos en el tejido (perfundido y superperfundido), la regulación de la permeabilidad microvascular y el intercambio se puede investigar al permitir que las células endoteliales que forman la pared de los microvasos de estar expuestos a una variedad de correocondiciones Xperimental (agonistas, condiciones de perfusión modificados, indicadores fluorescentes para medir la composición intracelular y la señalización) durante períodos medidos con precisión de tiempo (seg a hr). Además, las evaluaciones ultraestructurales o citoquímicos de estructuras moleculares celulares clave que regulan la barrera se pueden investigar en los mismos microvasos en el que se mide directamente la permeabilidad. El enfoque de esta manera forma un puente entre la investigación de los mecanismos celulares y moleculares para modificar la función de barrera endotelial en cultivos de monocapas de células endoteliales y la investigación en microvasos intactos. Ver las siguientes revisiones para evaluación adicional 1-6.

Una limitación de microperfusión es que sólo se puede utilizar en lechos microvasculares que son delgadas, transparentes y tienen una integridad estructural suficiente para permitir la canulación con una micropipeta de vidrio. Mientras que las primeras investigaciones utilizan microvasos rana en el mesenterio y delgado cutánea angina de muscle 7,8, con mucho, la preparación más comúnmente utilizado en los modelos de mamíferos es el mesenterio de rata 9-15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en los cambios agudos en la permeabilidad vascular estudiado durante períodos de 1-4 horas, pero las investigaciones más recientes se han extendido a las mediciones en los buques individuales de 24-72 hr después de una perfusión inicial 12,16. La tecnología CRISPR recientemente desarrollado, que promete hacer modelos de ratas modificadas genéticamente más disponibles para el estudio de la regulación de la permeabilidad vascular 17 debería permitir a los métodos descritos en esta comunicación que se aplicarán en los microvasos venulares del mesenterio en estos importantes nuevos modelos de rata.

El método requiere un microscopio invertido equipado con una platina del microscopio a la medida lo suficientemente grande como para contener tanto la preparación de los animales y al menos tres micromanipuladores utilizado para microherramientas posición cerca de la embarcación perfundido y para alinear una micropipeta perfusión con el buquelumen. Por ejemplo, una plataforma personalizada para una platina del microscopio xy (alrededor de 90 × 60 cm) puede fabricarse a partir de una placa de acero 1 cm de espesor con un revestimiento a prueba de herrumbre. La etapa está unido a una tabla de índices de ingeniería o dos diapositivas en cola de milano montados en ángulos rectos y apoyadas sobre pilares de teflón o transferencias de bolas para el movimiento en el plano horizontal. Una plataforma típica (véase la figura 2) tiene mucho en común con el equipo de microscopio y microposicionamiento utilizado para una serie de experimentos microcirculación intravital como los que para medir el flujo único de los vasos sanguíneos y el hematocrito, el suministro de oxígeno local microvasos sanguíneos perfundidos, la regulación de liso vascular el tono muscular y la acumulación microvascular local de los trazadores fluorescentes inyectados en toda la circulación. 18-26

El aspecto fundamental de la técnica es la medición del flujo de volumen (v J) a través de un área de superficie definida (S) de la pared de los microvasos. Para llevar a caboesto a través de la técnica de Landis modificado descrito en el presente documento un sencillo microscopio invertido es adecuada. Una cámara de video pequeña está montado en el puerto de imagen y la señal de vídeo, con una base de tiempo de descuento, se visualiza en un monitor de video y grabado, ya sea en forma digital en un ordenador o como una señal digital o analógica en una grabadora de vídeo. Una vez que el microvasos se canula la porción de la microvasos visible a la cámara se puede cambiar moviendo el escenario y manipuladores como una unidad sin alterar la canulación.

Medición de los flujos de transvascular también se puede combinar con las investigaciones más detalladas utilizando un microscopio de fluorescencia sofisticado con filtros adecuados tales como equipos de perforación utilizados para las mediciones de permeabilidad soluto, monitoreo relación fluorescente de calcio citoplasmático u otros mecanismos celulares, y de formación de imágenes confocal 6,12,13, 27. Una ventaja clave de todos los enfoques microperfusión es la capacidad de tomar medidas repetidas, en el mismo buque, En la variación controlada de fuerza motriz, como presiones hidrostáticas y oncóticos o cambio inducido en las respuestas de los buques a las condiciones inflamatorias. El diseño más común es una comparación emparejada de la conductividad hidráulica medida (L p) en el mismo recipiente con el recipiente primero perfundido a través de una micropipeta llena de un líquido de perfusión de control y la suspensión de glóbulos rojos para establecer un estado permeabilidad línea de base, a continuación, con una segunda pipeta con el agente de prueba añadido al perfundido. Múltiples canulaciones son posibles con el ciclo se repite después de la reperfusión con la pipeta de control.

El presente protocolo demuestra la canulación y microperfusión de un vaso venular en mesenterio de rata para grabar flujos de agua a través de la pared de microvasos y medir la L p de la pared del vaso, un índice útil de la permeabilidad de la vía común para el agua y solutos a través de la intacto barrera endotelial. El procedimiento se denomina techniq Landis modificadoue porque el principio Landis original de utilizar el movimiento relativo de los glóbulos rojos como una medida de intercambio de fluido transvascular después de la perfusión está bloqueado se conserva 28, pero la gama de condiciones experimentales (por ejemplo, las diferencias de la presión oncótica hidrostáticas y de albúmina a través de la pared de los microvasos) disponible después microperfusión es mucho mayor que en la sangre perfundida microvasos uncannulated 8,29.

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Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.

1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores

  1. Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de que el cono es consistente con las dimensiones de la figura 1. Utilice las dos mitades para micropipetas, inmovilización y bloqueadores.
    1. Bisel las micropipetas utilizando una muela de aire impulsado 30 con 0,5 micras papel abrasivo bañado con agua. Ajuste el ángulo del soporte de micropipeta de modo que es de aproximadamente 30 grados desde la horizontal.
    2. Lave y seque las micropipetas mediante succión para extraer la acetona limpia a través de la punta y el eje. Inspeccione las micropipetas (Figura 1A), utilizando un pequeño microscopio vertical con 4 × 40 × y objetivos equipados con un soporte micropipeta pinza y una retícula ocular.
    3. Seleccione micropipetas con abertura de la punta de aproximadamente 50 micras de largo con un bisel cuya longitud / anchura relación es de entre 3.1 y 3.5 y con un punto fuertemente cónica que ayuda a penetrar en las fibras de colágeno difíciles en el mesenterio.
    4. Guarde 15-20 micropipetas de ligeramente diferentes tamaños en una caja libre de polvo.
  2. Hacer inmovilización utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar de vidrio tirado brevemente cerca de una microllama para formar un extremo romo (Figura 1B). Guarde varios en una caja libre de polvo.
  3. Hacer microoccluders utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar tirado bajo un microllama y suavemente doblar (usando un adaptador de la tubería, por ejemplo., 23G) la punta fina (unos 4 mm desde la punta) para hacer un ángulo de cerca de 120 grados en el eje (

2. Preparación y Cirugía Animal

  1. Anestesiar macho (350 a 450 g) o ratas hembra Sprague-Dawley (de 200-300 g) con pentobarbital sódico (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) a través de inyección subcutánea; proteger el mesenterio al no utilizar la inyección intraperitoneal.
  2. A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y los protocolos experimentales, mantener la anestesia mediante inyecciones suplementarias (30 mg / kg) según sea necesario. Determinar profundidad de la anestesia por pellizco dedo del pie o del reflejo corneal. Después de la terminación del procedimiento experimental, la eutanasia a la rata a través de sobredosis de pentobarbital o inyección intracardiaca de cloruro de potasio saturado bajo anestesia.

3. Preparar Soluciones y eritrocitos para su uso como marcadores de flujo

  1. Prepare la solución de los mamíferos de Ringer para superperfundido y la solución de perfusión de control (típicamente ácido mamíferos solución de Ringer que contiene 10 mg / ml grasoalbúmina libre de suero bovino, BSA).
    1. Perfundido Filtrar por 0,2 micras filtros de jeringa para eliminar las partículas diminutas que podrían bloquear la punta de la micropipeta; filtrarse en pequeño recipiente limpio.
  2. Preparar los eritrocitos mediante la elaboración de aproximadamente 0,2 ml de sangre de la vena de la cola de la rata anestesiada en una aguja 20G en una pequeña jeringa que contiene 0,05 ml de heparina (1.000 U / ml) y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene aproximadamente 14 ml solución de mamífero solución de Ringer .
    1. Centrífuga para empacar suavemente las células rojas (sobre un máximo de 200 × g durante 7 min). Dibuja el sobrenadante y volver a suspender las células rojas en la solución de Ringer.
    2. Después de la centrifugación y eliminación del sobrenadante tres veces salen de los glóbulos rojos concentrados en la parte inferior del tubo para su uso posterior. Tenga en cuenta que este procedimiento reduce las plaquetas en los perfundidos finales a menos de 0,1% de los niveles normales 31.

4. Disponer de Tejidos en el AnimalBandeja

  1. Afeitarse el abdomen de la rata anestesiada desde abajo del ombligo al apéndice xifoides. Asegúrese de que el área afeitada se extiende alrededor de la parte derecha (por rata colocada en el lado derecho) para que el pelo no se forma una mecha para dibujar el superperfundido fuera del tejido también. Eliminar pelos cortados con una gasa humedecida o tejido.
    1. Mantenga la piel con un objeto contundente fórceps dentadas y hacer una incisión en la línea central (2-3 cm de largo) a través de la piel con unas tijeras resistentes. El uso de un bien (iris) tijeras hacen una incisión similar a través de la línea alba, el levantamiento de la pared abdominal con pinzas dentadas para evitar daños en el intestino.
    2. Con el animal en su lado de la bandeja de animal, tire suavemente de la tripa de la cavidad abdominal con bastoncillos de algodón (palo de madera) empapados en solución de Ringer y pinzas dentadas contundentes. Organizar el intestino en el tejido bien para que el mesenterio se monta sobre el pilar para ver a través del microscopio con cuidado de no tocar el mesenterio (potedañar ntially microvasos), ya sea con fórceps o algodón.
      Nota: La bandeja de animales (Figura 2A) puede construirse a partir de plexiglás y requiere un tejido bien (alrededor de 3 mm de profundidad), un pilar ópticamente claro (por ejemplo, cuarzo pulido alrededor de 2 cm de diámetro y 5 mm de altura.), Y una almohadilla de calentamiento ajustada para mantener la temperatura del animal. El espesor de la columna no debe exceder la distancia de trabajo del objetivo.
  2. Coloque la bandeja de animal en la platina del microscopio de manera que el mesenterio es visible a través de los oculares.
  3. Coloque una línea de goteo por gravedad a superfuse continuamente el mesenterio con solución de mamíferos de Ringer mantenida a 35-37 ° C. Utilice compresas de gasa para mantener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de solución de Ringer de la superficie. Ajustar el flujo y aspirar el efluente para mantener un espesor superperfundido consistente.
  4. Identificar objetivo microvasos venulares, que sonsegmentos no ramificados aguas abajo del flujo convergente, una o dos ramas distales a los verdaderos capilares. Encontrar un buque no ramificado (idealmente, de 600 a 1.000 m de longitud) con el flujo de sangre a paso ligero y libre de células blancas que se pegan en la pared del vaso.
  5. Coloque la prueba de microvasos en el centro del campo del microscopio y mover el retenedor en su posición cerca del sitio de canulación elegido.

5. Llene Micropipeta y el monte en el soporte

  1. Justo antes de la canulación, suspender las células rojas de la perfusión. Añadir 7 l de concentrado de hematíes a 0,5 ml de perfusión en un tubo de ensayo de borosilicato limpio. Nota: hematocritos de 1-3% pueden ser utilizados, pero hematocrito consistente dará lugar a concentraciones de perfundido consistente de cualquier sustancias liberadas de las células rojas.
  2. Coloque una jeringa de 1 ml con un adaptador de tubería de 23G y PE 50 tubos (5-15 cm de longitud). Dibuje el / mezcla de glóbulos rojos perfundido en la jeringa. Invertir la jeringa para mezclar y expulsar todas las burbujas de la tubería yadaptador. Para aumentar la eficiencia, la tubería en forma de varias jeringas antes del inicio del experimento y mantenerlos en una caja libre de polvo o bolsa de plástico.
  3. Llene la micropipeta por el avance de la tubería en el extremo grande de la micropipeta hasta que hace tope con la región cónica. Aplicar un empujón rápido suave en el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta. Nota: Un pequeño arroyo o de gotas deben ser visibles en la punta a la evidencia de llenado completo.
  4. Retirar el tubo mientras empuja suavemente el émbolo para llenar la parte más ancha del eje micropipeta. Retire las pequeñas burbujas en el gran eje con un movimiento rápido con cuidado el eje micropipeta. Nota: Un procedimiento similar se ha ilustrado 32.
  5. Coloque la micropipeta en un soporte de pipetas con un puerto lateral que permite una conexión de fluido continuo a un manómetro de agua. Asegúrese de que el titular, que se adjunta a una unidad hidráulica utilizada para controlar muy bien el avance de la micropipeta, se encuentra en un ligero ángulo (15 a 25 °)a la horizontal de modo que el borde de la conicidad micropipeta no golpea el intestino o en la bandeja.
  6. Monte la unidad hidráulica en un micromanipulador móvil, que tiene x, y, z y unidades para permitir estrecha alineación con el recipiente de ensayo (Figura 2).
  7. Ajustar la presión hidrostática aplicada al fluido en la micropipeta utilizando una jeringa o pera de goma lleno de agua para cambiar la altura de líquido en la columna de agua del manómetro a aproximadamente 40 cmH 2 O por encima del mesenterio.
  8. Canular la microvasos tan pronto como sea posible después de llenar la pipeta; células rojos se asientan en la parte inferior de la pipeta, de modo que después de aproximadamente 40 min muy pocas células rojas fluirá al interior del recipiente.

6. Microcannulation y microvascular Medición de Presión

  1. Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presionar suavemente el limitador sobre el tejido cerca de la microvasos aplicar fuerza suficiente para agarrar el tejido. Dibujar elretenedor de la espalda, estirando ligeramente el tejido en línea con el de los microvasos de manera que las tensiones en las fibras de colágeno mesentéricos están alineados con el recipiente.
    1. Alinear la micropipeta con el buque y lo baja a la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canulación elegido y lo baja sobre el tejido de modo que obstruye parcialmente el flujo dentro del vaso, pero no ocluir la misma.
  2. Canular la embarcación por la conducción de la punta de la pipeta lentamente en la luz del vaso utilizando el accionamiento hidráulico. Tenga cuidado de no empujar a través de la parte inferior del recipiente.
    Nota: Como la micropipeta entra en el lumen, el perfundido se lava rápidamente la sangre en el recipiente fuera del lumen y perfundido fluye libremente en circulación distal del animal para la prueba de los microvasos, desplazando parte de la perfusión normal de la sangre en los vasos aguas abajo.
  3. Bajar la presión de perfusión mediante el ajuste del manómetro hasta que la sangre (como se indicapor las células rojas de los animales) se dibuja de nuevo en el segmento de perfusión; esto determina la presión de equilibrio en el que las células rojas oscilan suavemente en la luz del vaso y mide la presión hidrostática de microvasos (P c) en el extremo distal del segmento de microvasos. Mantener la perfusión buque en todas las presiones por encima de esta presión de equilibrio.

7. Microocclusion y Recolección de Datos

  1. Paso opcional: Antes de utilizar el micro-oclusor para bloquear el recipiente, pulse en el tejido en una zona no utilizada del mesenterio lejos de cualquier recipiente de modo que la punta se acumula una fina almohadilla de tejido que protege el recipiente experimental durante micro repetida oclusiones.
  2. Coloque el bloqueador por encima del recipiente de perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio.
  3. Registre la siguiente con el vídeo y el audio.
    1. Verbalmente registrar la ubicación del sitio de bloque y el borde inferior de la pantalla como se ve en la retícula ocular.
    2. Con la puntadel bloqueador colocado justo encima de la de los microvasos, utilice el control z fina de la micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que se ocluye el flujo en el vaso. Tenga en cuenta la presión del manómetro (Pc) en audio. Aplicar la oclusión normalmente para 3.10 segundos, y luego suelte, la restauración de la perfusión libre. Mueva el sitio de bloque hasta la embarcación hacia la punta de la pipeta en 5-10 micras pasos basados ​​en tiempo (> 5 min después del bloque inicial en un sitio), número de oclusiones (3-5), para evitar daños en la pared del vaso en el sitio de bloque .

8. Análisis de datos y medición de Lp (Agua Permeabilidad)

  1. Durante la reproducción de vídeo, determinar la distancia inicial (ℓ 0) a partir de una célula roja marcador para el sitio de la oclusión mediante el uso de una imagen de un micrómetro de platina y las posiciones conocidas en las imágenes. Determinar la velocidad inicial (dl / dt) de la célula marcador de su posición en varios marcos durante el 3-10 seg de las imágenes grabadas. Disuadirmina el radio del vaso (r) a partir de las imágenes tomadas durante la oclusión (Figura 3).
  2. Calcular J v / S para cada oclusión como (dl / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular L p a una presión constante como (J v / S) dividida por la presión de conducción (presión de microvasos - efectiva la presión osmótica coloidal; ver Discusión).

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Representative Results

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. 33 La magnitud de L p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se expone a la bradiquinina agente inflamatorio (Bk) utilizando un segundo micropipeta que contiene 10 nM Bk. La bradiquinina provocó un aumento transitorio en L p que regresó hacia el valor control sobre la posterior 10-15 min. El recipiente se volvió a perfundido con perfundido de control durante 30 min a volver a establecer una línea de base estable. Cuando el microvasos fue perfundido usando cuarta micropipeta con la misma concentración de Bk, así como 1 mM esfingosina-1-fosfato (S1P) en el perfundido, la respuesta a Bk fue significativamente atenuada. El grado deatenuación cuando Bk y S1P fueron perfundidos al mismo tiempo, se encontró que era similar al medido en otros experimentos en los que se añadió S1P al perfundido hasta 20 min antes de la exposición a Bk. Estos resultados demuestran el poder de ser capaz de realizar múltiples mediciones de L p en un solo recipiente, y muestran que la acción de un agente tal como S1P para estabilizar la pared del vaso en presencia de un agente inflamatorio se puede resolver a períodos de tiempo en del orden de unos pocos segundos. En recipientes separados se llevaron a cabo estudios de control con un protocolo similar en ausencia de S1P para demostrar que la atenuación de la respuesta Bk no se debió a la anafilaxia.

Para algunos diseños experimentales es importante para estimar tanto el coeficiente de reflexión de solutos para una macromolécula (σ) y la L p. Esto se logra mejor mediante la medición de J v en múltiples presiones sobre cada uno de los microvasos individual. La Figura 5 muestra un experimento in el que tanto L p y la presión oncótica efectiva de 5% de albúmina en el perfundido (π = albúmina de 27 cmH 2 O a 37 ° C) se estimaron en condiciones cuando no había albúmina en el tejido que rodea el microvasos rata. En estos experimentos J v / S se midió a tres presiones diferentes. La L p es la pendiente de la relación entre J v / S y la presión, y el intercepto en el eje de presión es la diferencia de presión oncótica efectiva a través de la pared del vaso (σΔπ).

Figura 1
Figura 1. Microtools para perfusión de microvasos individuales. (A) Una micropipeta para la canalización de microvasos de ratas con una punta biselada. (B) un limitador para la celebración de tejido mesenterio estable cerca del sitio de canulación. (C) Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. plataforma intravital para microperfusión. (A) Descripción general de la bandeja animal con micromanipuladores y microherramientas orientados sobre los pilares de vidrio. (B) Etapa grande del metal montada en la mesa de ingeniería y cojinetes de apoyo. (C) anestesiados rata con microherramientas en posición para microperfusión de microvasos. (D) Vista cercana del mesenterio durante un experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figu re.

Figura 3
Figura 3. Medición de la tasa de filtración por unidad de área utilizando la técnica de Landis modificado. Este esquema muestra un único microvasos canulada con una micropipeta y una varilla de oclusión colocado sobre el recipiente. Inmediatamente después de la oclusión de la microvasos, la distancia (ℓ 0) entre el marcador RBC que viaja en la línea central del microvasos ocluido y el sitio de la oclusión se registra de manera que la trayectoria de células puede ser seguido durante 5-10 segundos después de la oclusión. La posición inicial (ℓ 0) y la velocidad inicial (dl / dt) de la célula se utilizan para calcular la tasa media de filtración por unidad de área de la pared de microvasos entre la célula marcador y el sitio de la oclusión. El microoccluder se eleva entonces, y la perfusión libre estableció antes de realizar mediciones adicionales.com / files / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Los datos representativos muestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P) la inhibición actúa muy rápido bradiquinina (Bk; 10 nM). Provocó un aumento transitorio en los microvasos L p. S1P aplica como concurrente con la prueba de segundo bradicinina (BK) inhibe la aguda Bk respuesta relativa a la primera Bk. Estos datos demuestran que el tiempo de exposición a un agente de ensayo puede ser modificado para evaluar la cinética de la activación de una respuesta inhibitoria. Específicamente, S1P concurrente sólo se aplicaba con Bk inhibió fuertemente la respuesta Bk. S1P fue de 1 M y Bk fue 10 nM. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 5. Medición de J v / S en múltiples presiones permite tanto L p y la presión oncótica eficaz a medir. El flujo de filtración, J v / S, se midió en este recipiente a diversas presiones hidrostáticas de microvasos durante la perfusión con BSA (50 mg ml - 1; π = 27 cmH 2 O), mientras que el mesenterio fue bañado con solución de Ringer libre de proteínas. La pendiente de la relación entre J v / S y la presión es la L p y el intercepto en el eje de presión indica la diferencia de presión oncótica efectiva a través de la pared del vaso. En este experimento, la Lp fue de 1,2 × 10 -7 (cm s-1 cm H2O -1) y el σΔπ fue de 24 cmH 2 O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los detalles de los cálculos PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de marcador en el lumen como la columna de líquido entre una célula roja marcador y el lugar de la oclusión acorta como se muestra en Figura 3. Dependiendo de la complejidad y la duración del protocolo experimental de un buque no ramificado se necesita 600 a 1000 micras de longitud.

Cuando el buque no está ocluida y la presión del manómetro está impulsando el flujo a través de la microvasos, la caída de presión a través de la punta de la pipeta es grande, por lo que la presión microvascular durante la perfusión libre es por lo general sólo unapocos cmH 2 0 por encima de la presión aguas abajo. En contraste, durante una oclusión de la caída de presión a través de la pipeta es muy pequeña debido al fluido que entra lentamente la luz del vaso para reemplazar el filtrado de fluido a través de la pared del vaso. Así, durante la oclusión de la presión hidrostática en la luz del vaso (P c) es igual a la fijada por el manómetro. La presión oncótica en el tejido mesentérica es insignificante, por lo que inmediatamente después de la oclusión, movimientos fluidos transvascular de células marcador rojo se miden donde se sabe que la presión hidrostática y la presión oncótica en la luz del vaso es igual a la fijada en el perfundido. Con mediciones sucesivas de L p, la eslora del buque se pierde cada vez que el sitio de bloque se avanza. Además, los sucesivos recanulación reduce la eslora del buque disponible.

El flujo de fluido transvascular por unidad de área de la pared del vaso (J v / S) se estima a partir la tasa que una longitud medida de la columna de agua en el microVlumen Essel entre una célula roja marcador y el sitio de la oclusión sea acorta (filtración neta) o alarga (reabsorción neta). La suposición es que las células rojas neutralmente boyantes se desplazan a lo largo de la línea central de la luz del vaso se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la velocidad media de la columna de agua que rodea la célula (la relación de la velocidad de glóbulos rojos en el sentido de la velocidad del agua es cerca de 1,8 para un micras 6 de glóbulos rojos en un recipiente de 30 m de diámetro). De este modo 8,14 si la velocidad de una célula marcador (en m / seg) hacia el bloqueador es V m / seg sobre el primero 2-5 seg después de la oclusión, y el radio del vaso es r, el volumen de fluido filtrado a través de la pared de microvasos que entre los glóbulos rojos y el sitio de la oclusión (J v) es πr 2 V 3 m / seg suponiendo que el microvasos es cilíndrica. Además el área de un microvasos cilíndrica (S) entre esa célula marcador y el sitio de la oclusión es 2πrℓ, donde ℓ es la distancia inicial entre la célula marcadoray el sitio de la oclusión. Así, el flujo transvascular inicial promedio por unidad de área (J v / S) a la presión fijada por el manómetro de agua Vr / (2ℓ).

La estimación simple de recipiente de L p se hace si la presión oncótica del perfundido se ha establecido bajo en relación con la presión de los microvasos (típicamente 3,6 cmH 2 O, la presión oncótica de la albúmina de suero bovino a una concentración de 10 mg / ml y un capilar presión superior a 30 cmH 2 O). L p se calcula como (J v / S) / (P c -3) cm / seg / cm H 2 O porque el coeficiente de reflexión de albúmina (albúmina σ) en el estado de control se encuentra cerca de 0,9. Con este enfoque rápidos cambios en L p con una resolución temporal del orden de 1 min se puede medir mediante el establecimiento de la libre circulación entre las medidas sucesivas de J v / S a presión constante como se muestra en los resultados representativos en la figura 4. El enfoque ig anteriorNores pequeños cambios en la presión oncótica de la albúmina que caen a menos del 1 cmH 2 O cuando el coeficiente de reflexión cae por debajo de 0,5, pero el error en la estimación de L p sigue siendo menos de 5% cuando P c es mayor que 30 cmH 2 O .

Cuando se requiere una medición precisa tanto de L p y coeficiente de reflexión, J v S se mide a una serie de presiones de microvasos por debajo de la presión oncótica efectiva esperada de la macromolécula de prueba /. La pendiente de la relación entre J v / S y las medidas de presión de L p y el intercepto en el eje de presión cuando el flujo neto es cero medidas σπ (Figura 5). La demostración de que Jv está linealmente relacionada con la presión es también una validación importante del uso de las mediciones de presión individuales utilizando el protocolo simple descrito anteriormente (Figura 4) cuando la diferencia de presión oncótica es baja en relación con la prensa hidrostáticaUre.

Las posibles fuentes de error. Hay varios problemas que ponen en peligro una medición precisa. El fracaso para ocluir adecuadamente el buque o daño a la pared del vaso en los resultados del sitio de oclusión en fuga de líquido más allá del sitio de la oclusión, y el movimiento de las células marcadoras hacia el lugar de la oclusión más rápida que debido al intercambio transvascular. Mientras que las células de marcador normalmente se mueven lentamente hacia el lugar de la oclusión, pero no llegan a ella, una fuga se indica si las células marcadoras rastrear todo el camino hasta el oclusor. Por otro lado, el fracaso para sellar la pipeta en el lumen de microvasos en el sitio de canulación resulta en la subestimación de J v / S. Fuga de líquido de la pipeta a la superperfundido o a la luz del vaso aguas arriba del sitio de canulación provoca una caída de presión significativa a través de la punta de pipeta. Se detecta una fuga Tal cuando las células del flujo punta de la micropipeta a una velocidad superior a los de la lu recipiente corriente abajolos hombres del vaso ocluido. Reposicionamiento cuidadosa de la micropipeta normalmente sella una fuga de este tipo. Una cuestión diferente surge si el L p de la pared del vaso no es uniforme, por lo general tiene con uno o más sitios de daño o inflamación localizada. Células marcador de la pista al sitio si la mayor parte del flujo transvascular se concentra allí. Movimiento de las células rojas todavía mide el flujo transvascular, pero la medida J v / S no es representativa de la mayor parte del área de la pared dentro del segmento de prueba.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes. Los dos métodos más comúnmente utilizado para investigar la regulación de la permeabilidad endotelial barrera y el intercambio transvascular son (1) in vitro medición de intercambio a través de monocapas de células endoteliales cultivadas y (2) la medición de la acumulación de trazador en una muestra de tejido después de que el trazador se inyecta por vía intravenosa en el animal entero. Experimentos en cultivos de monocapas de células endoteliales son favored porque las funciones celulares pueden ser modificados de manera más directa y hay suficiente material celular disponible para evaluación detallada de los acontecimientos moleculares en las células endoteliales. Sin embargo en la mayoría de las condiciones de cultivo de las células endoteliales no suelen forman la barrera representante de la permeabilidad vascular in vivo. La técnica Landis modificado descrito anteriormente ha demostrado ser una técnica robusta y fiable para investigar la regulación de la función de barrera endotelial en microvasos venulares intactas. En las manos de un investigador experimentado emparejado mediciones de permeabilidad en condiciones de control y de prueba, donde algunos de los enfoques utilizados en el cultivo de células (por ejemplo, las imágenes de los componentes celulares, la modificación de las vías de señalización) se pueden aplicar. La importancia de experimentos en los microvasos intactos se ha demostrado mostrando diferencias significativas entre los mecanismos que regulan la permeabilidad de la barrera en microve perfundido individualmentessels y los que a menudo describen en monocapas endoteliales cultivadas. Los ejemplos incluyen las respuestas de corte, la exposición de la trombina, y la contribución de los mecanismos contráctiles a la formación de brecha inflamatoria 2-6,9,16. Las mediciones de la acumulación del trazador en un lecho vascular intacta preserva la función más normal fisiológica pero la investigación directa de los cambios reales en la permeabilidad vascular se ve comprometida debido a la acumulación de trazador puede aumentar como resultado de aumento de la perfusión (aumento del área de superficie para el intercambio) con o sin un aumento en el permeabilidad de la pared. Por lo tanto la medida de un aumento de la permeabilidad puede ser sobreestimado cuando la vasodilatación aumenta el número de vasos perfundidos y la acumulación de ese modo total de soluto es mayor que debido al aumento en la permeabilidad vascular solo 34.

Las aplicaciones futuras. La gama de opciones para modificar la estructura y la función celular en las mismas condiciones como permeabilidad de indivasos indivi- se mide directamente durante microperfusión se espera que aumente. Además se espera que la aplicación de los métodos en el mesenterio de ratas genéticamente modificado puede resolver un problema a largo plazo que ha existido para los ratones modificados genéticamente. Específicamente, cuando se dispusiera de ratones modificados genéticamente se esperaba que microperfusión podría extenderse a investigar microvasos en sus vasos mesentéricos. Mientras que algunos experimentos microperfusión se han completado en microvasos de mesenterio del ratón 35, los ratones generalmente tienen menos microvasos en su tejido mesentérico que las ratas, y estos vasos son a menudo corta y muy ramificado, en oposición a (> 500 m) vasos rectos más largos más adecuados que se puede encontrar en ratas. Así experimentos para investigar la modulación de intercambio transvascular en ratones genéticamente se han basado en ensayos tales como el Miles 34 o los experimentos con trazadores técnicamente exigentes, pero más confiables que midencambios tanto vascular y extravascular acumulación de fluorescencia de sondas de prueba radiomarcados 36.

Las modificaciones del método. En los protocolos anteriores, cambios en la composición perfundido requiere cambio de micropipetas. Un enfoque alternativo es para volver a llenar la micropipeta in situ utilizando un aparato de rellenado. Este procedimiento ha sido realizado como se describe en detalle 37. La limitación es que el tiempo para cambiar la composición de la perfundido en la pipeta no es tan rápido como logrado mediante la sustitución de la pipeta, pero el procedimiento es especialmente útil si es necesario para perfundir un microvasos durante largos períodos de tiempo.

Lo mismo microperfusión acercado puede ampliarse para medir coeficientes de permeabilidad de la etiqueta fluorescente soluto 31,38-40. En este caso la micropipeta cañón solo es reemplazado por un doble cañón (theta) de la pipeta 41 y el recipiente se perfundealternativamente con el soluto fluorescente prueba para medir la acumulación de tejido en relación con el lumen de contenido, y el mismo perfundido sin el soluto fluorescente para borrar el tejido y permitir la medición repetida de la acumulación de soluto. Cuando las mediciones de los flujos de agua transvascular se van a combinar con las mediciones de soluto coeficiente de permeabilidad utilizando solutos de ensayo marcados con fluorescencia, los indicadores fluorescentes de composición intracelular o formación de imágenes confocal de los componentes celulares, se requiere un controlado por ordenador más sofisticado microscopio de fluorescencia. Desde estas investigaciones por lo general requieren lentes con mayor aumento y distancia de trabajo mucho más corto, el pilar de cuarzo se utiliza para mantener el mesenterio se sustituye por un cubreobjetos de vidrio pegada a un soporte de plexiglás dentro del tejido bien en la bandeja del microscopio. La mayor disponibilidad de impresoras 3-D, permitirá la fabricación de alta precisión de bandejas personalizadas, que cumplen con la tolerancia estrecha requerido para posicionar mayor diametelentes de r con corta distancia de trabajo en relación con los microvasos seleccionados.

La disponibilidad de microvasos utilizables en el mesenterio varía con la edad, el género, y la tensión. Por lo tanto, las opciones de cepa de rata y el uso de hombre o mujer dependerá de las preguntas específicas están abordando. Para muchos de nuestros estudios recientes hemos utilizado ratas Sprague-Dawley que están aclimatados en nuestra instalación de animales al menos una semana antes de su uso en alrededor de la edad de 3-4 meses y en ese momento nos encontramos por lo general tienen largas microvasos mesentéricos rectas disponibles. Por el contrario, nuestros colegas han utilizado con éxito ratas hembra Sprague-Dawley de 2-3 meses de edad 13.

El papel de las células rojas. La función principal de los glóbulos rojos, como se describe más arriba era para rastrear transvascular movimiento del agua asumiendo la célula actuó como inerte, forma neutral boyantes indicadores de flujos de agua después de que se ocluyen los microvasos. Además de este papel fundamental,Ahora se reconoce que las células rojas contribuyen a la estabilidad de la barrera mediante el suministro de S1P al perfundido cuando albúmina en la actualidad 31,42,43. Hay varias implicaciones importantes de estas observaciones. En ausencia de glóbulos rojos o con el uso de marcadores de flujo inerte alternos es probable que sea menos estable la permeabilidad de línea de base. Se recomienda que las mediciones de S1P se deben hacer en todos los perfundidos utilizados en experimentos microperfusión.

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Acknowledgments

Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL44485 y HL28607.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Olympus CK-40 try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Leica DMIL try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example Nikon Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel welding shop this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides Velmex AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example Pulnix TM-7CN (no longer available) no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3) Prior/Stoelting (no longer available) look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way FHC 50-12-1C need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive  FHC 50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way Siskiyou Corporation MX610 (1-way) or MX630 (3-way) great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders Siskiyou Corporation MXC-2.5, MXB etc.
pin vise Starrett 162C to hold restrainer
pipette holder World Prescision Instruments MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall Quartz Scientific Inc. custom  (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well NuSil MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W Cole Parmer EW-03125-20 heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC Cole Parmer EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out Cole Parmer EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller Sutter Instrument Company P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing Sutter Instrument Company B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II RX Honing Machine Corporation MAC-10700 Rx System II Machine alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
   with ceramic sharpening disc RX Honing Machine Corporation use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um 3M part no. 051144 80827 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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