VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

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Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

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Abstract

La comprensione clonalità tumore è fondamentale per comprendere i meccanismi coinvolti nella tumorigenesi e la progressione della malattia. Inoltre, comprendere i cambiamenti composizione clonali che si verificano all'interno di un tumore in risposta a determinati microambiente o trattamenti possono portare alla progettazione di approcci più sofisticati ed efficaci per eliminare le cellule tumorali. Tuttavia, tumori clonali inseguimento sottopopolazioni è stato difficile a causa della mancanza di marcatori distinguibili. Per risolvere questo problema, un protocollo VDJ-ss è stato creato per tracciare i modelli di evoluzione clonali di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidiva sfruttando VDJ ricombinazione e mutazione somatica (SHM), due caratteristiche uniche di linfomi a cellule B.

In questo protocollo, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) librerie con potenziale di indicizzazione sono stati costruiti da amplificato immunoglobuline riarrangiato catena pesante (IgH) regione VDJ da coppie di diagnosi primaria e la recidiva DLBCL samples. In media più di mezzo milione di sequenze VDJ per campione sono stati ottenuti dopo il sequenziamento, che contengono sia VDJ riassetto e informazioni SHM. Inoltre, le condutture bioinformatica personalizzati sono stati sviluppati per utilizzare pienamente le informazioni di sequenza per la caratterizzazione di IgH-VDJ repertorio all'interno di questi campioni. Inoltre, il gasdotto permette la ricostruzione e confronto dell'architettura clonale dei tumori individuali, che consente l'esame della eterogeneità clonale nei tumori diagnosi e la deduzione di modelli di evoluzione clonali fra la diagnosi e le coppie di recidiva del tumore. Quando si applica questa analisi a diverse coppie di diagnosi-recidiva, abbiamo scoperto le prove chiave che più tumorali distintivo modelli evolutivi potrebbero portare a DLBCL ricaduta. Inoltre, questo approccio può essere esteso ad altri aspetti clinici, come l'identificazione della malattia minima residua, monitorare i progressi recidiva e la risposta al trattamento, e ricerca di repertorio immunitarioes in contesti non linfoma.

Introduction

Il cancro è una malattia clonale. Da trenta anni fa, quando Peter C. Nowell ha proposto il cancro clonale evoluzione del modello 1, molti studi hanno cercato di sezionare popolazioni clonali in campioni di tumore e ricostruire espansione ed evoluzione modelli clonali che sono alla base del processo di tumorigenesi 2. Recentemente, tutto il sequenziamento del genoma ha permesso agli investigatori di dare uno sguardo profondo alla eterogeneità clonale e l'evoluzione 3,4. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori trattabili in molti tipi cellulari, è difficile dedurre la precisa architettura clonale e percorso evolutivo. Fortunatamente c'è un marcatore clonalità naturale in cellule B mature da cui molti tumori maligni linfoidi, tra cui DLBCL, sono originari. In risposta alla stimolazione antigenica, ogni B-cella può formare una singola produttivo sequenza IgH VDJ unendo un V H (variabile), un D (diversità), e un J H (giunzione) segmento insieme da una grande piscina di questi segmenti. Durante questo process, piccole porzioni di sequenza originale possono essere cancellati e ulteriori nucleotidi non-templated possono essere aggiunti per creare un riarrangiamento VDJ unico. Questa riorganizzazione VDJ specifico può essere ereditata in tutta la progenie di questo B-cellule, quindi la codifica B-cellula matura individuale e la sua prole 5. Inoltre, SHM verifica sulle sequenze VDJ ricombinati nella reazione successiva centro germinativo (GC) per introdurre mutazioni aggiuntive per l'espansione del pool di anticorpi e la valorizzazione di anticorpi affinità 6. Pertanto, confrontando e contrastanti VDJ e SHM modelli di linfoma campioni che hanno subito questi processi, intra-tumorale eterogeneità potrebbe essere delineato e clonale percorso evolutivo della malattia può essere desunta.

In precedenza, VDJ riassetto e SHM potrebbero essere identificati mediante PCR amplificando le regioni ricombinati, clonazione dei prodotti di PCR, e successivamente sequenziamento Sanger per ottenere informazioni sulla sequenza. Questo mi avvicinos basso throughput e bassa resa, il recupero di solo una piccola parte di tutto il repertorio VDJ ricombinato, e ostacolando la caratterizzazione della rappresentazione complessiva della popolazione clonale in un dato campione. Un approccio modificato è stato creato mediante la generazione di NGS indicizzati librerie sequenziamento dai prodotti VDJ PCR e l'esecuzione di PE 2x150 bp sequenziamento di ottenere più di mezzo milione di sequenze VDJ ricombinate per campione. Inoltre, una pipeline personalizzata è stato sviluppato per eseguire il controllo di qualità (QC), allineare, filtro VDJ sequenziamento legge per identificare riarrangiamenti e SHMS di ogni lettura, ed eseguire analisi filogenetica sull'architettura clonale di ogni campione. Inoltre, è stato stabilito un nuovo approccio per caratterizzare ulteriormente i modelli di evoluzione clonali per i campioni raccolti a vari stadi della malattia.

Abbiamo applicato questa tecnica per i campioni dei pazienti DLBCL. DLBCL è una forma aggressiva di linfoma non-Hodgkin con frequenti recidive in un massimo di un thIRD dei pazienti 7. Ricadute DLBCL normalmente si verificano presto, entro 2 o 3 anni dalla diagnosi iniziale, anche se alcuni si verificano dopo 5 anni 8. La prognosi per i pazienti con recidiva è scarsa, con solo il 10% che raggiungeva 3 anni la sopravvivenza libera da progressione a causa di limitate opzioni di trattamento. Questa è la base per l'urgente necessità di nuovi approcci per il trattamento di DLBCL ricaduta 9,10. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati con DLBCL recidive sono ancora in gran parte sconosciute. In particolare, il ruolo di eterogeneità clonale al momento della diagnosi e l'evoluzione clonale durante lo sviluppo ricaduta DLBCL sono attualmente indefinita, il che rende difficile la definizione di un biomarcatore accurate e utili per prevedere le ricadute. Per rispondere a queste domande, abbiamo applicato il nostro approccio VDJ-sequenza su più coppie di corrispondenti primario diagnosi-recidiva coppie di campioni DLBCL. Due distinti scenari evolutivi clonali di ricaduta emerse dal confronto delle architetture clonali tra la diagnosi e la samp ricadutales che suggerisce molteplici meccanismi molecolari può essere coinvolta in DLBCL ricaduta.

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Protocol

1. VDJ Amplificazione

1.1) Estrazione del DNA da campioni tumorali

  1. Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di congelati PTOM incorporati tessuti normali e maligni.
    1. Digest 10-30 sezioni sottili di tessuto incorporato tagliato da un microtomo criostato in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) con Proteinasi K (0,5 mg / ml, concentrazione finale ) e 0,625% SDS in una provetta da centrifuga da 15 ml in un bagno d'acqua per una notte a 37 °.
    2. Aggiungere 1 ml di NaCl satura (5 M) alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi.
    3. Centrifugare a 1100 xg per 15 min a temperatura ambiente.
    4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere due volumi di 100% di etanolo.
    5. Miscelare invertendo la provetta 6-8 volte. Centrifugare a 5.000 xg per 60 min a 4 ° C per raccogliere il DNA precipitato.
    6. Lavare il pellet di DNA due volte con il 70% di etanolo. Centrifuge a 5.000 xg per 15 min ogni tempo per raccogliere il pellet.
    7. Sciogliere DNA in 100-400 microlitri tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore overnight stanza. La resa del DNA è 5 a 200 mg (concentrazione finale tra 50-500 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto
  2. Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di, incorporato (FFPE) tessuto normale o maligni paraffinato fissati in formalina.
    1. Incubare sezioni di paraffina in 1 ml due volte xilene a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a Sparaffinare. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Incubare sezioni in 1 ml di etanolo al 100% per due volte a temperatura ambiente, 10 min ogni volta per rimuovere residui xileni. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. La paraffina è completamente sciolto a questo punto e solo la sezione di tessuto è restanti.
    3. Asciugare sezioni in camera temperature per 10-15 minuti.
    4. Fare un / soluzione di 0,5 mg ml proteinasi K con 1x tampone PCR (diluito da 10x tampone PCR con acqua priva di nucleasi). Aggiungere la soluzione proteinasi K per i campioni in un volume finale di 50-100 microlitri e incubare una notte a 37 ° C.
    5. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti per inattivare proteinasi K.
      Nota: In questo passaggio, il DNA campione viene sciolto in tampone PCR e può essere utilizzato nei passaggi 1.2 e 1.3 direttamente. La resa del DNA è da 0,5 a 20 mg (concentrazione finale tra 10-200 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto.

1.2) valutazione della qualità del DNA

  1. Mescolare 0.25 microlitri DNA polimerasi Taq con 45 ml di master mix dal kit scala commerciale in un tubo di PCR.
  2. Aggiungere 5 microlitri DNA preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 nella provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte.
  3. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per7 min; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C.
  4. Preparare un gel di agarosio 2% in TBE (Tris / borato / EDTA).
  5. Mescolare 20 microlitri PCR con 4 ml 6x colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio 2%.
  6. Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di gel immaginare. Nota: i campioni che producono 5 prodotti PCR con dimensioni di 100, 200, 300, 400, e 600 bp sarà continuato a generare ampliconi VDJ.
    ATTENZIONE: etidio bromuro è un potente mutageno. Si prega di trattare con estrema cautela, indossando indumenti protettivi, cioè guanti, e smaltire in contenitori specifici per le linee guida dell'istituzione.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione quadro 1 (IgVHFR1)

  1. Mescolare 45 microlitri master mix dall'etichetta tuboEd come "Mix 2" di una somatica IGH ipermutazione test per il rilevamento del gel kit commerciale, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e il DNA del campione 5 ml preparata da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR.
  2. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C.
  3. Risolvere l'intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi.
  4. Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di imaging gel. Un amplicon monoclonale è previsto con la gamma di dimensioni di 310-380 bp.
  5. Accise la porzione gel contenente l'amplicone monoclonale tra 310-380 bp.
  6. Purificare DNA da gel asportato utilizzando un kit di Gel Extraction standard secondo il protocollo del produttore. Nota: per i campioni che i frammenti FR1 potrebbero essere ottenuti, non c'è bisogno di ampiamente IGVHFR2 e IgVHFR3.

1.3.2) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione Framework 2 (IgVHFR2)

  1. Mescolare 45 microlitri master mix dal tubo etichettato come "Tube B" di un gene IGH commerciale clonalità test per kit di rilevamento del gel, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e campione di DNA 5 microlitri preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR .
  2. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; quindi 72 ° C per 10 minuti e lasciare a 15 ° C.
  3. Risolvere l'intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi.
  4. Visualizza prodotto di PCR (s) di 0,5 mg / ml colorazione con etidio bromuro. Un amplicone monoclonale può essere osservato all'interno della gamma di dimensioni di 250-295 bp.
  5. Accise la porzione gel contenente l'amplicone monoclonale tra 250-295 bp.
  6. Purificare DNA da gel asportato utilizzando un estratto di normale Gelion Kit secondo il protocollo del produttore.

1.4) Ottimizzare VDJ PCR

  1. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR modificate per amplificare IgVHFR1 e IgVHFR2 usando DNA non ottimale: 95 ° C per 7 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 60 sec, 60 ° C per 60 sec e 72 ° C per 90 sec, estensione finale a 72 ° C per 10 min.

2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparazione e Sequencing

2.1) Biblioteca Preparazione

2.1.1) Fine-riparazione

  1. Trasferire VDJ prodotto di PCR da 1.3 in un tubo di PCR e aggiungere Risospensione tampone da campione di DNA kit di preparazione per portare il volume a 60 ml.
  2. Aggiungere 40 ml di Fine Riparazione Mix da campione di DNA Kit di preparazione e mescolare accuratamente.
  3. Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.
  4. Mescolare 136 ml sfere magnetiche e 24 microlitri PCR gacqua rade primo di una provetta da 1,5 ml, quindi trasferire l'intera reazione finale di riparazione da 2.1.1.3 nel tubo 1,5 ml e mescolare bene con la soluzione perline.
  5. Porre le provette su un supporto magnetico per 2 minuti per consentire la separazione delle sfere dalla soluzione. Aspirare il surnatante, e lavare le perline con l'80% fresco preparato EtOH due volte mentre il tubo è sul supporto magnetico.
  6. Aspirare la soluzione di etanolo completamente e consentire alle sfere di asciugare all'aria per 15 min a temperatura ambiente per 15 min.
  7. Prendete il tubo dal supporto e risospendere magnetici perle a 17,5 ml Resuspension Buffer.
  8. Porre le provette di nuovo sul supporto magnetico per 2 minuti a perline separati dal Resuspension Buffer. Rimuovere la Resuspension Buffer (prodotto finale di riparazione è risospeso nel buffer Resuspension ora) in una provetta PCR clean.

2.1.2) A-tailing

  1. Aggiungere 12,5 ml mix A-tailing nel tubo di PCR contenente prodotto end-riparazione e mescolare accuratamente. Incubare la provetta PCR a 37 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (37 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.

2.1.3) Adattatore legatura

  1. Aggiungere 2,5 microlitri Risospensione tampone, 2,5 microlitri legatura Mix, e 2,5 microlitri DNA adattatore Indice nella reazione A-tailing.
  2. Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minl in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.
  3. Aggiungere 5 ml di arresto legatura tampone in ogni reazione e mescolare accuratamente.
  4. Mescolare 42,5 ml ben mescolato sfere magnetiche per pulire la reazione seguente procedura 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Aggiungere 50 microlitri Risospensione tampone per eluire il prodotto adattatore ligato.
  5. Pulire il prodotto adattatore legatura per la seconda volta con 50 microlitri ben mescolato perline AMPure XP, ed eluire il prodotto in 25 microlitri Risospensione tampone in una provetta pulita PCR.

2.1.4) frammenti di DNA Amplify

  1. Aggiungere 5 microlitri PCR Primer Cocktail e 25 microlitri PCR Master Mix nella provetta PCR prodotto contenente adattatore-legatura e mescolare accuratamente.
  2. Eseguire amplificazione in un termociclatore pre-programmato con le seguenti condizioni: 98 ° C per 30 sec; 10 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; poi 72 ° C per 5 minuti e tenere a 10 ° C.
  3. Pulire la reazione con 50 sfere magnetiche microlitri ben mescolato, ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri Resuspension Buffer.

2.1.5) Biblioteca convalida

  1. Quantificare il prodotto finale con un fluorimetro utilizzando il protocollo del produttore. Concentrazione biblioteca finale è compresa tra 2,5 e 20 ng / ml.
  2. Valutare la qualità del prodotto finale utilizzando uno strumento di analisi con DNA chip alta sensibilità secondo il protocollo del produttore. Aspettatevi una singola banda con il formato previsto per entrambi IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Tidimensioni xpected del prodotto biblioteca è uguale alla dimensione del VDJ amplicone originale più le dimensioni degli adattatori (~ 125 bp).

2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing

  1. Calcolare la molarità di ciascuna frazione libreria utilizzando la seguente formula: nM = [(ng / 1000) / * 660 bp] x 10 9 dove ng è la concentrazione della biblioteca VDJ-PCR misurata nel passaggio 2.1.5.1 e bp è il picco dimensione della libreria VDJ-PCR misurata al punto 2.1.5.2.
  2. Diluire la libreria di 2 Nm (totale 10 ml) con acqua priva di DNasi.
  3. Combinare i 10 ml di 2 librerie nM insieme diluito in una provetta da 1,5 ml.
  4. Aggiungere un volume uguale di Phix controllo spike-in nel tubo 1,5 ml.
  5. Caricare la piscina a una concentrazione 07:00 su una cella a flusso.
  6. Sequenziare le librerie utilizzando un sequencer ciclo accoppiato-end 150 secondo il protocollo del produttore.

Analisi 3. Dati

Nota: Un summary degli script bioinformatica utilizzati in questa sezione si trova un file Codice supplementare.

3.1) Allineamento e QC

  1. Mappa accoppiato-end sequenziamento legge contro un IGH V umana, D e J regione del database scaricato dal sito IMGT 11 utilizzando un algoritmo esplosione nucleotide adattato in base al 'BLASTN' disponibile da NCBI con divario penale aperto di 2, divario penale estensione di 1, lunghezza della parola di 7, e la soglia e-valore di 10 -4. Eliminare la coppia lettura non mappare sia l'IGH V e una regione J.
  2. Contare le restanti coppie di lettura che hanno IGH V e J mappature per ottenere le frequenze di corrispondenza combinazioni VJ in tutti leggere coppie ottenuti dal sequenziamento corsa sul campione. Count una lettura coppia se è mappato sia l'IGH V e J gene, e quindi aggiungere il suo allele al conteggio corrispondente per la particolare combinazione VJ.
  3. Classificare i conteggi per ogni regione VDJ ricombinato ottenuto dalla 3.1.2 dall'altoest al più basso. La regione VDJ ha la più alta legge conteggio viene definito come combinazione riarrangiamento principale.
  4. Scartare sequenze allineate che coprono meno del 35% del dominio principale riarrangiamento identificato nel 3.1.3.

3.2) SHM profilo di identificazione

  1. Contare tutti i modelli SHM attraverso la legge dal punto 3.1.3. Definire ogni modello SHM come sottoclone.
  2. Contare il numero dei subcloni che sono corrispondenti a differenti modelli unici SHM, e il numero di letture che vengono mappati alle singole sottocloni.

3.3) Rappresentazione grafica dei risultati

  1. Eseguire l'analisi filogenetica sulle subcloni utilizzando i loro corrispondenti modelli SHM utilizzando un quartiere metodo dal pacchetto R "ape" giunzione secondo il protocollo del produttore. Calcolare una matrice di distanza dai singoli schieramenti distinti per ricreare la filogenesi subclone radicato alla sequenza germinale del VJ combinazione in questione per ogni set di campioni appaiati.
  2. Utilizzare la sequenza nucleotidica di ogni subclone come carattere vettoriale e calcolare la distanza approssimativa corda tra tutti i subcloni in maggiore riarrangiamento VJ sia per la diagnosi e campioni ricaduta corrispondenti utilizzando una misura di distanza Levenshtein dove matematicamente la distanza tra due allineamenti è dato da d x, y (i, j), dove d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 altrimenti, e poi riassumere questa funzione per tutta la lunghezza della stringa corrispondente al nucleotide sequenze ie j.
  3. Graficamente visualizzare la matrice risultante delle distanze e dei loro corrispondenti subclone conteggi subclone nei seguenti due modi:
    1. Utilizzare pacchetto R "massa", secondo il protocollo del produttore di applicare scaling multidimensionale alla matrice distanza subclone e generare un principio bidimensionale coordinate della mappa, che viene poi tracciata con il logaritmodi conteggi subclonal come il raggio del cerchio.
    2. Costruire un grafo non orientato in base alla distanza Levenshtein, dove i vertici corrispondono a ogni subclone distinta derivante dal maggiore riarrangiamento VJ.
      Nota: Se la distanza tra due cloni distinti è uguale a uno allora esiste un arco tra i due vertici. Se la distanza è maggiore di uno, allora vi è un fronte che li collega.
    3. Tracciare il grafico del 3.3.3.2 usando la funzione tkplot nel pacchetto R "IGRAPH" con il layout Kamada Kawai secondo il protocollo del produttore. Il raggio dei vertici è proporzionale alla radice al cubo del numero totale di cloni mappati ad esso e l'ombreggiatura utilizza un intervallo rosso e blu per indicare la proporzione di cloni che o appartengono alla diagnosi (blu) o recidiva (rosso) campioni .

3.4) eterogeneità (Entropy) Misura

  1. Esaminare i numeri e conteggi sottoclone delmodelli individuali di mutazione somatica che si verificano nella principale riarrangiamento VJ per ogni set di campioni appaiati.
  2. Calcolare l'entropia empirica e l'entropia empirica residuo corretto per il numero di cloni distinti in ciascun campione usando la stima entropia basato istogramma standard.

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Representative Results

La procedura complessiva di VDJ sequenziamento (VDJ-seq), compresa l'estrazione del DNA, ricombinato VDJ regione amplificazione e purificazione, la costruzione della libreria sequenziamento, legge elaborazione e analisi filogenetica, è rappresentato in figura 1. Ordinariamente 5-200 mg DNA può essere recuperato da sezioni di tessuto solido congelato o 0,5-20 mg DNA da sezioni di tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. A seconda della qualità, modello riarrangiamento e SHM grado di singoli campioni, una varietà di prodotti di PCR di VDJ diversi campioni può essere ottenuta (figura 2), compresa IGVHFR1 (310-380 bp), FR2 (250-295 bp), e FR3 (70-120 bp). I campioni da cui solo FR3 frammento può essere ottenuto da VDJ PCR sono stati esclusi dallo studio rimanente a causa della breve del prodotto che non fornisce sufficiente quantità di informazioni di sequenza per downstream scopo l'analisi dei dati. Solo i campioni di cui il prodotto più importante FR1 o FR2 PCR possono essere visualizzati su The gel di agarosio vengono elaborati per generare librerie di sequenziamento. La resa del prodotto principale PCR dopo purificazione gel varia da 10 a 50 ng in totale.

L'intero prodotto purificato PCR è stato utilizzato per la costruzione della libreria successiva per la libreria sequenziamento. Dopo Adattatore legatura, ogni campione ottiene il suo indice univoco. Durante l'amplificazione biblioteca, 10 cicli di PCR sono stati eseguiti che potrebbe produrre più di 30 ng come prodotti finali di libreria. La qualità biblioteca è stata letta da un Bioanalyzer. Come mostrato in Figura 3, vi è un unico prodotto nel campione libreria con uno spostamento di dimensioni ~ 125 bp formare il prodotto amplicone PCR VDJ originale indicante l'ulteriore dell'adattatore. Per ogni corsa di sequenziamento, 5-10 biblioteche sono stati riuniti insieme a 7 micron. Inoltre, a causa della elevata sequenza somiglianza tra i prodotti VDJ PCR, la piscina libreria è stato mescolato con il 50% Phix picco-in per garantire la complessità della corsa e corretta identificazione della baseaggiuntivo dopo ogni ciclo di sequenziamento. Frammenti di DNA sono stati sequenziati per biblioteca 150 bp su entrambe le estremità, che consente il recupero di una quantità sufficiente di informazioni di sequenza che attraversa VD e DJ giunzioni per i frammenti FR1 e modelli SHM mutazione per analisi filogenetica.

In precedenza, abbiamo effettuato VDJ sequenziamento su 32 campioni prelevati DLBCL al momento della diagnosi e la ricaduta da 14 pazienti (diversi pazienti avevano più campioni raccolti sia a diagnosi o fase recidiva) con la condizione descritta sopra 12. Effettuando l'analisi filogenetica dei profili SHM dei principali riarrangiamenti V H DJ H tra i campioni appaiati, un "Early-divergente" e una modalità "Late-divergente" dell'evoluzione clonale associato con DLBCL ricaduta sono stati identificati 12. Qui, lo stesso approccio è stato applicato a una diagnosi DLBCL recentemente raccolti e di coppia di ricaduta. Le regioni FR1 stati ottenuti in entrambi i campioni dopo PCR amplificazione. Un prodotto importante PCR con dimensioni intorno a 344 bp (misurata mediante Bioanalyzer) è stato ottenuto sia la diagnosi ed i campioni di ricaduta. Dopo il sequenziamento, per un totale di 0,70 milioni accoppiato-end legge sono stati ottenuti per il campione diagnosi e 0.73 milioni accoppiato-end legge per il campione ricaduta, che erano all'interno della gamma del numero di letture ottenute per campione nello studio precedente (0.38- 1.420.000, media 0,75 ± 0,26 milioni) 12. Dopo la mappatura abbinato-end legge contro di database IMGT, si legge che non hanno risultati in tutti e tre V, le regioni D e J sono stati scartati. V H DJ H accordo è stato assegnato a ogni lettura paired-end. Un totale di 0,64 milioni di euro e 0,67 milioni V H DJ H giunzioni sono stati identificati nei campioni di diagnosi e di ricaduta, rispettivamente, che rappresentano più del 90% tasso di allineamento. Contando quante volte ogni combinazione di V H DJ H è stato trovato in campioni individuali, 808 distinti V H </ sub> DJ H giunzioni sono stati trovati nel campione diagnosi e 581 distinti svincoli V H DJ H nel campione ricaduta. V H DJ H giunzione dominante in entrambi campione è IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2, confermando che sono in relazione clonale. Questo dominante V H DJ H bivio rappresentato il 97% dell'intero tracciato V H DJ H giunzione legge sia nel campione diagnosi e il campione ricaduta.

Per tracciare l'evoluzione clonale di questo caso ricaduta DLBCL, è stata effettuata l'analisi filogenetica dei profili SHM dei principali riarrangiamenti V H DJ H tra questa coppia di campioni di diagnosi e di ricaduta. Abbiamo osservato che il modello evoluzione clonale di questa coppia stava seguendo il percorso "Late-divergente" (Figura 4), ​​che i subcloni dalla diagnosi e recidiva tumori raggruppati insieme sullo stesso ramo dell'albero filogenetico, e dominantesottoclone diagnosi e le subcloni ricaduta dominanti condivise simile modello SHM con alcune ulteriori mutazioni intervenute nel subclone ricaduta. Questi risultati suggeriscono che potenzialmente c'era un subclone nel tumore diagnosi che era o chemio-resistenti o fuoriuscito dal trattamento, e quindi poi sviluppato nel tumore ricaduta.

Per caratterizzare ulteriormente e visualizzare architettura clonale di ogni campioni e modelli di evoluzione clonale durante il processo di ricaduta, sono state sviluppate due nuove analisi. In queste analisi, l'intero set di sottocloni dei principali riarrangiamento VJ in ciascun campione sono stati utilizzati per calcolare la distanza corda a coppie tra tutti sottocloni come definiti dalla loro modelli di SHM. Poi utilizzando scalatura multidimensionale (Figura 5A, 5B) o costruendo un grafo non orientato (Figura 5C, 5D) come descritto in Data Analysis, sono stati creati appezzamenti rappresentano la distribuzione e l'eterogeneità dei subcloni. Comeillustrata in figura 4, la trama MDS presenta molto meno diversità di sequenza tra le principali subcloni nei casi divergenti tardive (Figura 5A) rispetto a quella dei primi casi divergenti (Figura 5B). Inoltre, i sub-cloni del campione diagnosi e sub-cloni del campione ricaduta nel caso divergente anticipato separati completamente l'uno dall'altro, che indica l'assenza di somiglianza dei modelli SHM tra questi tumori anche se hanno lo stesso riarrangiamento VDJ . Analogamente, i grafici non orientati in (Figura 5C) e (Figura 5D) mostrano che la distribuzione dei conteggi subclone nel tardo caso divergente (Figura 5C) differisce dai primi divergente (Figura 5D). Quest'ultimo ha più prominenti ma geneticamente diverse grandi cloni dalla diagnosi alla recidiva. Inoltre, l'assenza di spigoli e subcloni piccole connessioni tra i principali diagnosi e recidiva cloni nelpresto caso divergente (Figura 5D), dimostrare la natura diversità di sequenza del primo caso di recidiva divergenti.

Figura 1
Figura 1:.. Passo dopo passo diagramma di flusso del metodo VDJ-ss è indicata la procedura generale di VDJ sequenziamento Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Immagini rappresentative di prodotti ampliconi VDJ PCR. Immagini gel che mostrano il rappresentante IgVH-FR1 (pannello di sinistra) e IgVH-FR2 (pannello di destra) prodotti di PCR di DNA estratto da campioni di linfoma del paziente. Un prodotto di PCR non poteva essere ottenuta in Esempio 5 probabilmente dovuto sia alla bassaqualità del DNA campione o SHM in siti primer che ha compromesso la reazione PCR. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. QC di VDJ dell'amplicone PCR e successivo sequenziamento biblioteca da Bioanalyzer Rappresentante Bioanalyzer tracce dello stesso amplicone VDJ prima della costruzione biblioteca (pannello superiore) e dopo la costruzione biblioteca (pannello inferiore). Nota il passaggio formato da 334 bp a 459 bp che indica l'aggiunta della scheda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Clonale analisi evoluzione di una coppia di DLBCL diagnosi e recidiva campioni. L'analisi filogenetica di un paio di esempio DLBCL diagnosi da recidive che mostra la modalità "Late-divergente" clonale evoluzione. I ticker colori rappresentano lo stato di mutazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 5
Figura 5: Nuovi metodi grafici di visualizzare i modelli di evoluzione clonali (A, B) trame scaling multidimensionale integrando profili SHM e conteggi subclone di coppia campione A che mostra la modalità di ricaduta tardo-divergente (A) e coppia di campione B che mostra la modalità recidive precoci divergente. (B). Il raggio dei cerchi indicano il conteggio di subclquelli corrispondenti ad un particolare profilo SHM e colori corrispondenti alla diagnosi (blu) campione o recidiva (rosso) campione. Gli assi X e Y rappresentano gli ultimi 2 componenti della MDA. (C, D) grafi non orientati di coppia campione A che mostra la modalità tardo-divergente recidiva (C) e una coppia di campione B che mostra la modalità recidive precoci-divergente (D). Bordi corrispondono a due profili SHM hanno una distanza stringa di un distacco lettera e si è laureato l'ombreggiatura (barra della scala colore) che indica la percentuale di sequenze mappatura per un particolare profilo di SHM corrispondente alla diagnosi (rosso) del campione o recidiva (giallo) del campione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

A causa del numero quasi illimitato di iterazioni di informazioni sequenza codificata da VDJ riarrangiamento e SHM al locus IGH delle cellule B umane, l'esame di tutto il repertorio IGH da high-throughput deep-sequenziamento ha dimostrato di essere un modo efficace e completo per delineare clonale e le popolazioni di cellule B sub-clonali. Inoltre, questa strategia può essere usato per studiare il percorso evoluzione clonale di sviluppo delle cellule B tumorali, remissione e ricaduta confrontando le architetture clonali e sub-clonali di campioni raccolti lungo varie fasi della malattia. Sebbene amplificazione di sequenze di DNA VDJ riarrangiati campione primario viene facilmente eseguita in un ambiente di laboratorio utilizzando primer disponibili in commercio, l'efficienza dell'amplificazione dipende in larga misura la qualità del DNA campione. In particolare, il DNA estratto da campioni FFPE presenta bassa efficienza di amplificazione, e spesso solo il piccolo frammento FR3 può essere amplificato con successo da questicampioni, che li rende inadatti per la successiva analisi. Dato che il nostro studio qui descritto è stato progettato per comprendere la clonalità di linfoma a cellule B, che è una malattia clonale con uno o più grandi cloni che domina l'intero tumore, abbiamo solo raccolto e sequenziato il principale prodotto VDJ-PCR. Per gli studi interessati catalogare l'intera cella B popolazione clonale di, per esempio, sangue periferico, una porzione maggiore del gel che contiene più prodotti VDJ-PCR (bande multiple o una macchia sul gel) può essere asportato e sequenziato. Tuttavia, è importante sottolineare che non è possibile catturare l'intero repertorio IGH riarrangiato perché alcuni SHM può verificare dove porta primers e compromettere l'amplificazione di questi VDJs. Inoltre, è stato introdotto di recente, un test commerciale giunto direttamente amplificazione IGH riassetto e MiSeq sequenziamento. Questo test semplifica processo di preparazione del campione. Tuttavia, dato che non tutti i campioni tumorali potrebbero generiTé il frammento FR1, si consiglia ancora compreso il passo elettroforesi su gel di controllare il prodotto della reazione di PCR prima di mettere in comune i campioni per il sequenziamento.

Sequencing 150 bp di entrambe le estremità del frammento VDJ (totale di informazioni di sequenza 300 bp) ha i seguenti vantaggi: 1) 300 bp di sequenza può coprire la maggior parte della FR1 e l'intero frammento FR2, forniscono ampie informazioni di sequenza per identificare VDJ riarrangiamento e somatiche iper-mutazioni; 2) La piattaforma fornisce il sequenziamento veloce tempo di ritorno che completa l'intero 300 cicli di VDJ-sequencing sotto 48 ore; 3) Ogni periodo permette il multiplexing fino a 12 campioni e raggiunge ancora circa un milione paired-end legge per uscita di esempio. Perché l'alta somiglianza sequenza tra cloni che portano lo stesso riarrangiamento VDJ, soprattutto in B campioni linfoma delle cellule, è fondamentale a picco in 20-50% Phix durante la corsa di sequenziamento per consentire definire con precisione la base chiama matrice. Recentemente, il MiSeqsoftware è stato aggiornato per rispondere a questa domanda. Si raccomanda di utilizzare il meno 5% Phix picco-a basso sequenziamento biblioteca complessità. Tuttavia, la nostra struttura di sequenziamento ha sperimentato la concentrazione incoerente del picco in DNA di controllo Phix fornito dal produttore che avrebbe compromesso l'esito di basso sequenziamento complessità. Pertanto, nella pratica corrente, usiamo ancora il 10-20% Phix picco-in per il sequenziamento VDJ. Per il sequenziamento di tutto il repertorio B-cellule del sangue periferico, che normalmente contiene un gran numero di disposizioni VDJ diverse, è possibile ridurre la quantità di Phix spike-in. Sebbene il numero di cloni e subcloni identificati di ogni campione è positivamente correlata con il numero di letture in sequenza, metà per un milione di paired-end letture per campione è sufficiente confrontare strutture clonali tra i campioni e dedurre i modelli di evoluzione clonali tra campioni raccolti a diversi stadi della malattia dello stesso paziente 12. esso èpossibile che PE 150 bp sequenza potrebbe non raggiungere una sufficiente copertura di quei lunghi frammenti FR1 (cioè 350-380 bp). In alcuni casi, le informazioni di sequenza del segmento D potrebbe non essere raccolte o potrebbero non essere sufficienti informazioni di sequenza sul segmento V differenziare subcloni da SHMS. Tuttavia, con l'avanzamento delle tecnologie di sequenziamento, è diventato possibile sequenziare più e coprire l'intero amplicone FR1.

Attraverso il sequenziamento del repertorio IGH delle cellule B è stato possibile tracciare l'espansione dei singoli cloni di cellule B e dedurre evoluzione clonale nel corso dalla diagnosi alla recidiva. Con l'uso di analisi sulle popolazioni di subcloni generati da modelli SHM, siamo stati in grado di differenziare due modalità di progressione del cancro alla ricaduta esaminando loro filogenesi. Le ultime rappresentazioni grafiche utilizzando trame scaling multidimensionale e grafi non orientati in base alla distanza Levenshtein ulteriormente allow di capire 1) la composizione subclonal di ogni tumore, 2) come sottocloni individuale sono legati l'uno all'altro, e 3) come ogni subclone evolve durante la progressione della malattia. Inoltre, l'analisi statistica ha mostrato che queste strutture filogenetiche erano chiaramente diverse e che le popolazioni subclonal differivano per quanto riguarda la loro eterogeneità. Infine, la traiettoria dell'evoluzione clonale ottenuto con VDJ-sequenziamento può essere ben correlata con l'evoluzione genetica e caratterizzata da uno o exome resequencing 12 mirati. Pertanto, la combinazione di questi due approcci ha il potenziale per identificare mutazioni del driver durante lymphomagenesis e linfoma ricaduta

Oltre a definire il B IGH cellule repertorio e tracciare l'evoluzione clonale della progressione del linfoma, l'approccio VDJ-ss può essere potenzialmente usato come metodo altamente sensibile per il monitoraggio della malattia residuo minimo, il monitoraggio della risposta del tumore alle terapie, e potenzialmente identificare la presenzadi cloni resistenti ai farmaci. Un approccio simile può anche essere applicata alle cellule T per mappare T cell receptor repertorio, e può essere usato per sondare risposta sorveglianza immunitaria al cancro. Inoltre, VDJ-seq può essere eseguita anche in modelli murini usando primers disponibili da Hanna et al. 13 È prevedibile che le informazioni raccolte tramite questo approccio nei prossimi anni può risultare in una migliore comprensione delle dinamiche di sviluppo del tumore, nonché espandere la nostra conoscenza del sistema immunitario e delle sue funzioni, nel difendere il nostro corpo da invasione tumorale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

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References

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  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481, (7381), 306-313 (2012).
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