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Developmental Biology

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Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

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Abstract

자궁의 기관 형성을 조사하면 자궁 내에서 개발 배아에 의한 시약의 어려움에 태반 포유 동물에서 기술적으로 어려운 과정이다. 새로 개발 된 생체 똑바로 방울 문화 방법은 자궁 내에서 수행 연구에 매력적인 대안을 제공합니다. 생체 액적 배양 검사 및 다양한 차단 및 활성화 화합물의 사용을 통해 세포 상호 작용 및 다양한 신호 전달 경로를 조작하는 능력을 제공; 부가 적으로, 특정 기관의 개발에 다양한 약리 시약의 효과는 자궁 내 전신성 약물 투여의 부작용없이 조사 할 수있다. 시험 관내 시스템에서 다른 비교하여, 액적 배양 포유 동물 세포주에서 복제 될 수없는 삼차원 형태 형성 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 능력을 가능하게 할뿐만 아니라 (R)를 훨씬 적게 요구뿐만생체 전 다른 것보다 체외 프로토콜에 eagents. 본 논문은 방법의 효과를 입증하기 위해 전체 장기 면역 다음에 적절한 마우스 태아의 장기 해부 및 수직 방울 배양 기술을 보여줍니다. 생체 액적 배양법 유사한 생체 내에서 관찰되며, 생체 내 모델에서 배아 치 명성에 기인 달리 어려운 학습 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있는지에 대한 장기 구조의 형성을 허용한다. 모델 시스템과 같은 어플리케이션, 소분자 억제제는 고환 혈관의 형태 형성의 역할을 조사하기 위해 이용 될 것이다. 각 기관에 광범위하게 될 어떤 프로토콜 기관 특이 수정을 결정하기 위해 검토되어야하지만,이 생체 액적 배양법, 예컨대 폐 및 잠재적으로 다른 기타 태아 기관 시스템까지 확장된다. 이 기관 배양 물 시스템은 태아의 장기와 실험에 유연성을 제공하고, 결과 obtaineD 연구자들은 태아의 개발에 대한 통찰력을 얻을 도움이 될 것입니다이 기술을 사용.

Introduction

인간의 생체에서 장기 재생은 매우 제한적이다 따라서, 조직 공학, 조직 및 호스트에 의해 기증 개별 세포로부터 장기 개발, 장기 교체 매력적인 잠재적 치료되고있다. 이 치료 전략이 성공하려면 그러나, 요인과 기관의 형태 형성에 관여하는 세포의 상호 작용은 철저하게 공부해야 잘 이해했다. 전통적인 접근 방식과 특정 장기의 개발을 연구 할 수 없기 때문에, 연구자들은 대체 전체 배아 또는 전체 기관 배양에 돌았 다. Kalaskar 등. 1은 체외 배양 방법은 기관 형성 연구에 대한 실현 가능한 대안 제시, 자궁 개발에 (배양 된 배아의 58 %에서) 그 생체 전체 배아 문화가 유사한 결과를 얻을 보여 주었다.

개별적인 기관 배양 시스템 등이 생체 DRO시약 또는 약물 항체의 첨가를 통해 특정한 신호 경로 또는 세포 상호 작용의 조작을 허용하면서 plet 배양 시스템은 전신 효과의 전체 기관 독립 분석을 허용한다. 전통적으로, 태아 기관 개발 연구는 모체 약물 전달 시약 이외에, 트랜스 제닉 마우스와 녹아웃 기술에 한정되어왔다. 그러나, 생체 내에서 이러한 기술과 치료에 관련된 기술적 인 문제가있다; 대부분의 문제는 종종 배아 치사를 초래 동시에 여러 장기에 영향을 미치는 영향을 중심으로 돌고. 태아의 발달을 조작하는 연구의 또 다른 관심사는 약리학 등의 시약은 태반 장벽을 통과 할 수있는 경우 (예, 약물의 산모 대사는 배아에 도달하기 전에) 및 자궁 내 배아 발달에 약물의 모성 효과입니다.

전체 기관 배양 기술은 기재된여기서 전체 태아 생식선이 생체 직립 액적 배양 배양 된 제 Maatouk 외. (2)에 의해 설명 된 프로토콜에서 적응시켰다. 태아 생식선을 배양 한 가지 중요한 이점은 소분자 억제제가 용이 단순 확산에 의해 전체 기관에 액세스 할 수 있다는 것이다. . DeFalco 등은 소분자 억제제와 결합이 생체 액적 배양 방법을 활용하는 것은 프로세스 및 생식선 3 개발 중에 발생하는 상호 작용을 시그널링 연구하기 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다; 이러한 프로세스는 기술적 문제로 생체 내에서 검사하기 어려운 것 (예를 들어, 태반 또는 유전 또는 약리학 적 접근 방식을 사용하여 여러 기관에 영향을 미치는 치사를 통해 약물의 통과).

액적 배양뿐만 아니라 자궁 실험의 특정 측면을 개선하지만, 그것은 또한 시험 관내EX VI 위에 개선이다VO 시스템도. 그들은, 다양한 세포 유형 부족 장기 구조의 형성을 허용하는 중요한 세포 외 기질 (ECM) 성분이 부족하고, 캐스케이드 신호에서 아티팩트를 나타낼 수 있기 때문에, 형태 형성을 연구하는 세포주의 이용은 매우 곤란하다. 조직 공학은 ECM 시뮬레이션 지지체를 작성을 크게 향상했다하더라도, 신호 형성기 중 각 세포 타입에 의해 요구되는 관련하여 기술의 부족은 도전 체외 기관 시스템을 구축 할 수있다. 다른 생체 시스템은 이전에, 필터 (6), 기타 발판 매트릭스 7,8 기관 형성을 연구하기 위해 설립, 또는 더 구체적 형태 형성, 한천 4 태아 기관의 라이브 영상에 매우 성공적이었다, 5 트랜스 웰되었다. 액적 배양 시스템의 장점은 O를 덜 시약을 이용할 수있는 기능을 제공함으로써, 형태 형성의 연구를 허용한다는 것이다ften 비싸고, 또한 성장 및 시그널링 기능 9 중요 장기 표면 장력을주는.

마우스에서, 초기 고환의 형태 형성 배아 (E) 사이에 일어난 일 E11.5 및 E13.5 스테이지; 이러한 단계는 특정 성 분화에 영향을 미치는 요인을 조사하기위한 최적의 시간 윈도우를 포함한다. 정소 형성시 발생하는 중요한 프로세스 중에서 고환 코드 구조의 생성 및 정소 특정 혈관 네트워크의 형성이다. 이 생체 전체 기관 액적 배양 시스템을 이용하여, 하나는 남성 관련 혈관 신생을 변경 및 소분자 억제제의 사용을 통해 정소의 형태 형성을 억제 할 수 있다는 것을 블록 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체의 활성; VEGF-매개 혈관 재는 고환 개발 10-12 중요하다. 이 방법은 성공적으로 다른 장기에 적용 할 수 있으며, 특정 시간을 타겟팅 할개발의 창. 전체 마운트 장기 이미징은 중요한 구조의 시각화뿐만 아니라 다양한 억제제의 투여로 인한 구조 및 세포 변화 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 시스템은 연구자가 생체 내 표적 유전자 전략 동안 모체 약물 또는 전신 투여 중단 잠재적 교란 효과를 무시할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서,이 전체 기관 체외 액적 배양 시스템은 크게 태아 발달 동안 특정 기관 내의 구체적 발생할 상호 작용 및 신호를 이해하는 능력을 향상시킬 수있다.

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Protocol

이들 연구에 사용 된 모든 마우스는 찰스 리버 연구소에서 얻은 CD-1 마우스였다. 이전 배양 실험은 또한 C57BL / 6J (데이터는 미도시)와 같은 다른 균주에서 수행되었지만, 임의의 변형이 사용될 수있다. 임신 성인 여성은 약 2~3개월 이전이었고, 자궁 경부 전위와 배아를 제거하기 전에 양자 개흉술 다음 CO 2 흡입을 통해 안락사시켰다. 마우스는 NIH의 지침에 따라 보관하고, 실험 프로토콜은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비

  1. 70 % 에탄올 용액을 제조 하였다. (습윤 챔버를 제조 및 / 희석 용액의 제조) 오토 클레이브에 탈 이온수. 70 % 에탄올로 아래로 분사하여 해부 도구 (집게, 가위, 27 G 바늘 주사기를) 소독.
  2. 준비ml의 1 M의 MgCl 2 CaCl2를 3.75 1 M의 PO 4, 7,425 ml의 칼슘 및 마그네슘 (80g 염화나트륨, 2g의 KCl, 14.4 g (2) 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2를 함유 10X 인산염 완충 식염수 (PBS) ). 1 L 멸균 멸균 물에 용해 후 여과지로 필터링 저어. 1X PBS를 만들기 위해 물을 10 배 희석.
  3. 가열을 30 분 동안 55 ° C에서 소 태아 혈청 (FBS)을 비활성화 필터 및 0.22 μm의 주사기 필터로 멸균.
  4. 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)로 구성된, (완전한 DMEM, cDMEM라고도 함) 38 ㎖의 1X 전체 문화 매체를 준비, 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 주식의 열 불 활성화 FBS와 1/100 희석 필터링. 이것은 일반적으로 신선한 표기하지만 1 개월, 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  5. 5 ㎎ / ㎖의 주식 농도 DMSO의 VEGFR 티로신 키나제 억제제 II (TKI II)를 재구성하고, 작업 솔루션을 만들기 위해 cDMEM으로 주식을 희석. 마지막 사기꾼이 연구에 대한 자기 중심은 cDMEM에서 1.875 μg의 / ㎖이다. 회사의 권장 사항에 따라, 스톡 용액은 -20 ℃에서 최대 6 개월 동안 안정하다. 작업 솔루션으로, 신선하고 같은 날에 사용합니다.
    주 : 작동 용액에서이 약물의 농도 (그 방울의 두 배 희석 될 것이기 때문에) 원하는 최종 농도보다 더 높은 두 배이어야한다. 동시에, "제어"치료 DMSO의 동일 부피를 함유 cDMEM 동일한 볼륨을 준비한다.
  6. 증류수에 별도로 꼬리 소화 시약 (50 mM의 NaOH를 1 M 트리스 - 염산 [pH가 8.0]) 준비합니다.
  7. XY PCR 프라이머의 25 μm의 재고 확인 (XY 앞으로 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 '와 XY 역을 5'-CCG CTG C​​CA AAT TCT TTG G-3') 함께 뉴 클레아없는 물.
  8. 50X TAE 버퍼 (242g 후, Trizma 자료, 57.1 ml의 빙초산을 준비, 100 ml의 0.5 M EDTA, pH가 8.5, 및 추가 물 1 L Fi를최종 볼륨). 1X TAE 런닝 버퍼를 준비한다 (20 ㎖ 50X TAE 1 L의 총 부피로 물로 희석).
  9. 끓는 때까지 전자 레인지에서 2.5 % 아가로 오스 용액 (0.625 g의 아가로 오스, 0.5 ml의 50X TAE 버퍼, 24.5 ml의 물), 열 아가로 오스 솔루션을 만들려면, 다음 식지 약 55 ~ 65 ° C를 (터치 수)까지. 일단 멋진, 1 % 에티 디움 브로마이드 솔루션 2 μl를 추가하고 젤을 붓는다.
    주의! 에 티듐 브로마이드 돌연변이와 기형이고; 니트릴 장갑과 적절한 안전 프로토콜 처리를 사용하십시오. 대안 적으로, 다른 잠재적으로 독성이 덜한 해결 겔 화제 또는 염료를 사용할 수있다.
  10. 면역 형광 대 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 % 소 태아 혈청 [FBS, 및 3 % 소 혈청 알부민 [BSA]를 PBS) 블로킹 용액을 제조 하였다.
  11. 면역 용 세정액 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS, 1 % FBS, 및 3 % BSA)을 준비한다.
  12. 면역을 위해 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBTx를 준비합니다.
  13. CU의 배양 챔버를 준비합니다lture. 물을 멸균 35 ㎖로 대형 (100mm 직경) 페트리 접시를 채우십시오. 해부와 문화를 수행 할 위치 근처에 배치합니다.

뮤스의 musculus에서 태아 고환 2. 분리

  1. 매일 아침 질 플러그의 여성 마우스를 확인합니다. 질 플러그가 감지되는 날 정오가 E0.5 간주됩니다. 승인 동물 프로토콜에 따른 방식으로, E11.5로 임신 여성 마우스를 안락사.
  2. 70 % 에탄올로 마우스의 복부를 스프레이.
  3. 미세 가위를 사용하여 V 자형 절개와 배꼽 피부와 복막을 열고 내부 장기를 노출 조직의 플랩을 다시 당깁니다.
  4. 자궁의 양쪽에있는 난소를 찾습니다. 가위를 사용하여, 모체로부터 배아를 함유 자궁을 분리 난소 및 결합 조직을 절단.
  5. 부드럽게, 태반 반대 측면을 절단 난황 주머니를 노출하여 자궁 벽을 엽니 다. PU에 조심하지 수ncture 난황는 손상 또는 손실 배아를 방지 할 수 있습니다.
  6. 배아 함유 난황 주머니를 제거하고 칼슘과 마그네슘과 PBS를 포함하는 접시에 그들을 배치 태반 근처 잘라. 칼슘 및 마그네슘 이온의 존재는지지 세포 유착 분자는 조직 구조를 유지하고 절개 도구에 달라 붙는 것을 방지하기 위하여 조직을 도울 것이다.
  7. 집게로 조심스럽게 배아 밖으로 밀어 수있는 구멍을 만들 난황을 천공하여 배아의 난황과 양막을 제거합니다. 배아는 난황의 외부되면, 탯줄을 잘라.
  8. 이 시점에서, 멸균 조직 문화 후드에있는 현미경을 사용합니다. 태아의 머리를 제거하고 목의 양쪽에 집게로 집어 버린다.
  9. 꼬리를 제거하고 태아의 성별을 결정하는 XY PCR 분석을위한 새로운 microcentrifuge 관에 배치합니다.
    주 : 수확 후 가능한 빨리 배양 생식선에 최적이지만,도이다 POSsible 꼬리 DNA를 제거하고 각 태아의 성별이 알려져 있습니다 만 원하는 섹스를 배양 할 필요가 있도록, 문화에 앞서 XX / XY의 유전자형을 수행 할 수 있습니다. 유전자형이 수행되는 동안 문화에 대한 준비가 될 때까지 4 ° C 또는 얼음에 (그들이 추적 할 수 있도록), 배아 분리 유지 될 수있다. 한 가지주의해야 할 점은 자궁 또는 문화 조건에서 외부의이 기간은 잠재적으로 문화 중 문화 또는 후속 개발을위한 생존 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것이다.
  10. (일반적으로 약한 손에 개최 집게) 포셉 일쌍와 배아의 겨드랑이를 달아하여 배양 접시의 바닥에 대한 앙와위에서 배아를 고정합니다. 전체 해부 과정에서 여전히 배아를 보유하는 대신에이 집게를 유지한다.
  11. 포셉의 다른 쌍으로, 피부 커버 복부를 제거하고 부드럽게 몸 벽을 다시 노출 간, 창자, 그리고 다른 장기를 제거합니다.
  12. 생식선은 등쪽 대동맥의 양쪽에 뒤쪽 몸통 벽 상에 위치되는 바와 같이,몸의 정중선을 따라 실행 큰 혈관 폐쇄 집게와 비뇨 생식기 능선 아래 특종과 집게를 열고 들어 올려 비뇨 생식기 능선을 제거합니다. 생식선이 느슨하게 벽에 부착 될 수있는 바와 같이, 이러한 연결을 제거하지 않고 너무 빨리 끌어이나 생식선이 기관에 손상을 초래, 스트레칭 할 수있다 않도록주의하십시오.
  13. 미디어에 조직을 적응하기 위해 접시에 cDMEM으로 비뇨 생식기 능선을 이동합니다.
  14. 27 G 바늘을 사용하여 비뇨 생식기 능선의 나머지 부분에서 생식선 - mesonephros 복합체를 분리합니다. 최적의 분리를 허용하도록 압하에 의해 절단 한 조직을 정확하게 안내하도록 다른 하나를 사용하는 바늘을 사용한다. 날카로운 바늘이 조직에 충실 할 수 있습니다 플라스틱 파편을 생성하므로, 접시 바닥에 대한 톱질 동작을 사용하지 마십시오. 완전히 생식선에 부착 된 mesonephros을 유지해야합니다.

소분자 억제제 생식소 3. 배양

  1. 두 20 μ 설정15 μL를 각각 L 피펫. 다른 피펫은 약물 치료 cDMEM으로 만 사용되는 반면, 생식선 및 제어 cDMEM의 첨가 전송을위한 청소, 소독 면도날을 사용하여 장벽 피펫 팁 하나 떨어져 약 1-2mm을 잘라.
  2. 그들은 쉽게 차단 피펫 팁을 사용 할 수 있도록 피펫 팁으로 장축과 평행 생식선 일렬. 피펫 팁의 내부에 부착 생식선의주의하십시오.
  3. 하나의 제어 방울로 측과 약물 함유 방울과 다른 레이블. 단 두 방울 35mm 접시 뚜껑에 들어갈 수 있습니다. 뚜껑에 라벨 꼬리 조직 함유 마이크로 원심 튜브에 라벨과 일치하는지 확인하십시오.
  4. 소형 (35mm) 배양 접시의 뚜껑에 물방울에 하나의 생식선을 포함 cDMEM의 피펫 15 μL (바닥이 가습 배양 접시 챔버 내에 맞게 너무 키가 큰만큼, 단지 뚜껑을 사용). 접시의 양쪽에 두 개의 생식선 함유 방울을 놓고, 잘 분리 FR톰 서로. 생식선이 방울로 전송되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다.
  5. 컨트롤로 지정 방울에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들기 위해 (단계 1.5에서 만든) DMSO를 포함 cDMEM의 추가로 15 μl를 추가합니다. 약물에 문의하지 않습니다 만 "컨트롤"피​​펫을 사용합니다.
  6. 다른 방울 (약 처리 샘플)에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들 TKI-II 함유 cDMEM의 15 μl를 추가합니다. 약물 처리 된 샘플에 대한 지정 만 피펫을 사용합니다.
  7. 그들은 직경 약 15-18mm이다 및 생식선이 대략 중간에 위치 할 때까지 피펫을 사용하여, 확대 원형 패턴으로 방울을 확산. 그것의 측면에 거짓말과 생식선과 mesonephros 쉽게 구별 할 수 있도록 생식선의 방향. 두 개의 돌출부가 평평 누워 있도록 폐의 방향.
    1. 물방울 직경이 약간 다를 수 있지만, 생식선이 floatin되지 않도록G와는 표면 장력에 의해 장소에서 개최됩니다. 물방울이 서로 또는 덮개의 측면을 만지지 않도록합니다. 표면 장력없이 장기 따라서 장기 형태를 왜곡, 배양 동안에 성장 및 뚜껑 상에 평평하게된다.
  8. 신중 직립 큰 (100mm) 가습기 접시 물의 표면에 물방울을 함유 배양 접시에 뚜껑을 배치. 뚜껑의 하단 아래에 갇힌 기포가 없는지 확인하고는 물 표면에 평평하게 눕혀져된다. 뚜껑을 반전과 물이 물방울이있는 뚜껑의 상단에 접촉하지 않도록주의하지 마십시오.
  9. 작은, 가습 실을 만들려면, 즉시 생식소 문화를 둘러싸는 큰 가습기 접시의 뚜껑 커버. 미디어 중 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 작동한다. 작은 접시가 자유롭게 이동하는 그것과 큰 접시의 뚜껑 사이의 공간이 있는지 확인하십시오; 그렇지 않으면, 응축 실 및 b를 만들 수 있습니다조직에 잠금 공기 교환.
  10. 두 개의 작은 뚜껑이 챔버에 배치되면, 바로 인큐베이터로 챔버를 놓습니다. 37 ℃에서 가습 된 CO2 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양 액적 부화.

배아 성을 결정하기위한 제 중합 효소 연쇄 반응

  1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 바닥에 배아 꼬리를 추가합니다.
  2. 각 튜브의 50 mM NaOH를 200 μl를 추가합니다.
  3. 15 분 동안 또는 조직이 완전히 용해 될 때까지 95 ° C에서 발생.
  4. 가볍게 간단히 50 1M 트리스 - 염산의 μL와 소용돌이를 추가합니다.
  5. 0.5 ㎕의 25 μM 프라이머 용액 2.5 μL 10X의 Taq 완충액, 0.5 ㎕의 10 mM의 dNTPs를 (뉴클레오티드), 19.3 μL nuclease- : 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에, 샘플의 총 수에 의해 각각 용적을 곱하여 새로운 PCR 마스터 믹스를 만들 무료 물, 0.2 μL DNA의 Taq 중합 효소. 잘 섞는다.
  6. 23 추가PCR 마스터 믹스의 μL 소화 꼬리의 3 ㎕의 용 해물을 함유하는 PCR 튜브.
  7. 톡 튜브는 튜브의 바닥에 샘플을 가지고 짧은 스핀을 수행을 혼합한다.
  8. XY (짧은) PCR 프로그램 (표 1)를 실행합니다.
  9. 1X TAE 버퍼에 2.5 % 아가로 오스 겔과 사다리 (5 배 염료) 샘플을로드합니다.
  10. XX와 XY 밴드가 해결 될 때까지 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다.
  11. 화상 UV 광 및 캡쳐 이미지와 겔.
  12. Y 염색체 특이 밴드 대 특정 X-염색체 (X 염색체를 = 331 염기쌍 [BP]와 XY = 302 BP) 분석 (13) XY (남성) 샘플, (331)의 두 밴드와 302 BP있을 것이다 XX 반면 (여성) 샘플은 하나의 331 bp의 밴드로 나타납니다.

5. 전체 마운트 장기 면역 형광

1 일 :

  1. 차단 팁과 1,000 μL 피펫을 사용하여 문화의 생식선을 제거합니다. 원한다면, 그들은 수있다미디어 및 시약을 씻어 PBS의 접시에 배치. 0.5 ml의 microcentrifuge 관에서 PBS에 놓습니다. 작은 튜브 크기는 시약을 보존하고 쉽게 튜브에 시료를 추적 할 수 있도록한다.
    1. 잠재적 인 약물 오염을 방지하기 위해 별도의 튜브, 제어 및 처리 샘플뿐만 아니라, XX와 XY 샘플을 유지하고 피펫의 별도의 세트 문화에서 제거해야합니다.
  2. PBS로 두 번 생식선을 씻으십시오. 이 시점부터,이 프로토콜은 칼슘과 마그네슘이 부족 1X PBS를 사용할 수 있습니다. 를 세척하기 위해, 생식선이 (중력에 의해) 튜브의 바닥에 침몰하고 위의 액체를 제거 할 수 있습니다. 그들에게 너무 가까이 피펫 팅에 의해 생식선을 잃지 않도록주의하십시오.
  3. 튜브에서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. PBS는 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 4 % 파라 포름 알데히드 250 μl를 추가하고, 로커에 4 ° C에서 O / N을 배양 할 수 있습니다. 대안 적으로,이 고정은 로커에 4 ℃에서 2 시간 동안 수행 될 수있다. 주의! Paraformaldehyde는 처리 할 때 매우 안전 프로토콜을 따르 독성 물질이다.

주 2 :

  1. 실온에서 250 μL의 PBTx 두 번 생식선을 씻어.
  2. 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx과 생식선 3 회 반복한다.
  3. 로커에 실온에서 솔루션을 차단 250 μL의 생식선이 적어도 1 시간 차단합니다.
  4. 솔루션을 차단에 희석 250 μL 차 항체의 로커에 4 ° C에서 생식선 O / N을 얼룩.

주 3 :

  1. 250 μL 세척 용액에 두 번 생식선을 씻어.
  2. 로커에 실온에서 10 분마다 생식선 250 μL 세척 용액으로 3 회 반복한다.
  3. 생식선에게 로커에 실온에서 차단 솔루션 250 μL에 1 시간을 차단합니다.
  4. 광으로부터 형광 이차 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 커버.
  5. AR에 실온에서 생식선 2-4 시간을 품어ocker 대안 훽스트 33342.을 포함 차단 솔루션에 희석 250 μL 차 항체에, 로커에 4 ° C에서 이차 항체와의 Hoechst 33342 배양 O / N을 수행합니다.
  6. 250 μL PBTx 두 번 생식선을 씻어.
  7. 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx의 생식선 3 회 반복한다.
  8. 컷오프 피펫 팁을 사용하여, 최소한의 액체와 함께 생식선 슬라이드에 옮긴다. 피펫으로 물기를 제거하지만, 조직이 건조하지 않도록해야합니다.
  9. 집게로 원하는 방식으로 생식선의 방향을, 빠르게 슬라이드의 생식선을 마운트 장착 미디어의 한 방울을 추가합니다. 설치 미디어 코트 완전히 모든 샘플 확인; 이 샘플은 건조시키는 않도록하는 것이 중요합니다.
  10. 적절한 크기의 사용 된 커버 (수 1.5 스타일) 부드럽게 샘플을 포함합니다. 커버 슬립의 전체 표면을 접촉하는 설치 미디어의 확산을 보자. 필요하다면, 매우 가볍게되도록 커버 슬립의 모서리에 눌러더 큰 기포가 없습니다.
  11. 설치 미디어의 증발을 줄이기 위해 가장자리 명확 매니큐어와 슬라이드를 밀봉합니다. 스토어는 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 장착.

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Representative Results

생체 방울 문화는 하나, 같은 생식선으로 전체 기관을 조작하는 세포의 상호 작용과 역학을 공부하기. (1) E11.5의 생식선 방울 문화를 준비하는 방법을 단계별 방식으로 보여줍니다도 있습니다. 문화 프로토콜의 첫 번째 단계는 어머니 마우스 (그림 1A 및 1B)에서 배아 함유 자궁의 초기 제거를 포함한다. 어머니의 자궁을 제거 후, 자궁 벽 절단 및 배아 더 해부 (그림 1C-E)에 대한 PBS에 난황에서 해방된다. 내장들을 제거한 후, 비뇨 생식 융기는 배아 (도 1F)의 뒤쪽 몸통 벽을 따라 명확하게 볼 수 있고 (도 1G)를 격리한다. 생식선 - mesonephros 단지는 다음 멀리 비뇨 생식기 능선 (그림 1H)에서 해부하고, 작은 분자 억제제 (그림 1I와 방울 문화에 배치됩니다왼쪽 : 치료를위한 "T")와 작은 분자 억제제 (그림 1I없이, 오른쪽 : 제어를위한 "C"). 방울을 포함하는 일품 요리는 48 시간 동안 CO 2를 변통 가습 실 (그림 1J)로 묶어서 배양 37 ℃에서 5 %이다.

48 시간 배양 후에 배양 장기를 PBS로 세척하고, 제거하고, 배양 및 약물 치료의 효과를 평가하기 위해 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 실시한다; 유전자 발현 분석을위한 대안 적으로, 이들은 RNA 추출을 위해 처리 될 수있다. 정상 상태 (37 ℃, 5 % CO 2) 48 시간 동안에서 배양 즉시 깨끗한 절개 후 문화 미디어로 전송하면 태아 전체 생식선 - mesonephros 단지 (E11.5 세)는 높은 생존율을 (하지만 그들은 수 ) 필요한 경우 더 이상 잠재적으로 배양. 시야 microscop에서 E11.5의 생식선의 비교배양 24 시간 또는 48가 (도 2) 생식선 형상 극적인 변화 및 제어 XY의 생식선에 줄무늬 형상의 코드 구조의 모양을 계시 후에 대 초기 배양에서 Y. 따라서, 48 시간 동안 배양 한 후, 개발은 자궁 내에서의 생식선 E13.5 (도 2)의 것과 비슷하다. 또한, E11.5 태아의 폐 성장하고 디스플레이는 일반적으로 개발이 단계 (그림 2) 중에 발생하는 분기 증가했다. 인해 배양 조건은 자궁 내 환경 (토의 참조)에 비해 성장에 관해서 최적이 아닌 사실로 자궁 내, 가장 가능성에 비하여 배양 공정은 일반적으로 더 작은 장기 초래한다.

자궁 -developed 기관에서, 기관 체외 배양 유사한 조직 구조를 표시하고 적절한 대체물을 제공 할 수의 48 시간 배양에 의한 장기의 크기 (즉에서 F를 다르지만igures 3 및 4). 기관의 구조와 형태 형성, 이러한 고환의 세르 톨리 세포와 폐 분기 세포, 폐 상피 세포에 대한 E-cadherin의, PECAM1 생식 세포와 혈관에 대한, 및 절단을위한 SOX9 카스파 제 3 특별히 중요한 장기 세포 유형에 레이블을 표시 하였다를 특성화하기 사멸 세포 (도 3 및도 4). Sox9, 전사 인자를 코딩은 태아 기관의 증식, 분화 및 세포 외 매트릭스의 형성에 중요한 역할을한다. 따라서, 두 기관에서 SOX9 폐 17 정소 내에 코드 14-16 및 분지 구조 내에 위치한 세르 톨리 세포 라벨 일반적 구조 마커로서 사용된다.

효과적으로 자궁의 형태 형성에 특히 재 작성의 생식소 문화. 마우스 생식​​선은 배아 (E) 무대 E10.0에 지정 XY (남성)와 XX (FEM 초기에 형태 학적으로 동일하다에일) 배아. E10.5은 태아의 고환 19 E11.5와 E13.5 사이에 급속하게 발생하는 등 주요 분자 형태 학적 변화를 드라이브에서 XY 유전자 SRY (Y 염색체의 성별 결정하는 지역)의 발현이 시작 생식선 :의 사양을 세르 톨리 세포, 정소의지지 세포 계보; 버팀과 생식 세포의 구성 및 성인 정소 세관에 태아의 전구체입니다되는 고환 코드의 형성; 주요 혈관 재. 남성 특정 혈관 리모델링, 이웃 mesonephros에서 혈관 신경 얼기로부터 방출 내피 세포는 정소 특정 동맥 시스템을 형성하기 위해 4,20 생식선으로 이동한다. 면역은 E11.5의 고환 (그림 3)에 비해 자궁 내 고환에 E13.5에 잘 발달 고환 코드 구조와 혈관을 공개 분석한다. 도 3 표시 화상으로서, 액적 배양 시스템은 고환 분화 EV을 재현 할엔트 생체 그것이 장기에 걸쳐 형성 세관 형 코드 및 맥관 형성에 XY의 생식선에 SOX9 양성 세르 톨리 세포를 시각화 할 수있다. 이일 (그림 4)의 과정을 통해 SOX9 / E-cadherin의 이중 양성 상피 가지의 증가 분기 폐, 48 시간 배양 결과에 대하여. 동일한 배양 조건에서 폐 세포 사멸 세포의 일부 증가 (그림 3과 4) 생식선이 배양 조건에 특히 의무가 있음을 암시가있는 동안 또한, 우리는, 제어 배양 및 자궁의 생식선에서의 세포 사멸 비슷한 수준을 참조하십시오.

소분자 억제제는 세포 지역화, 증식 및 세포주기 상태뿐만 아니라, 장기 구조 및 다양한 시그널링 캐스케이드에 영향을 미치는하여 장기 개발을 연구하는데 사용될 수있다. 생체 전체 기관 방울 방법은 연구자가 철에 쉽게 약리 시약을 관리 할 수 있습니다배양 배지의 매우 작은 체적의 탈 기관. 정소 분화 및 혈관 신생에 대한 형태 형성 및 혈관 리모델링의 효과를 조사하기 위해, 우리는 소분자 억제제 TKI II, VEGF 수용체의 활성을 차단하여 고환 혈관 발달을 방해 3 시약을 사용; 태아 정소 구조의 형성은 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA) (11, 12)을 통해 작용, 혈관 의존적 방식으로 발생한다. 고환의 혈관은 태아의 남성화를 구동 테스토스테론의 수출을위한 중요하지만, 또한 고환 코드 형태 형성의 주요 드라이버입니다 : 이전 작업이 보여준 그 VEGFA 신호는, 세르 톨리 세포 또는 이전 E11.5에 차단 될 때 간질 세포를 둘러싼 어떠한 코드 구조는 3,12를 형성하지으로부터 분할 실패합니다. 여기에 도시 된 결과는 태아 고환 혈관 재 형성의 방해가 액적 배양 시스템에 효과적임을 입증하고 subsequen(즉, 비정상적인 고환 코드 형성) 고환의 형태 형성에 T 결함 (그림 3)를 시각화 할 수 있습니다. 그것은 PECAM1, 내피 세포에 대한 마커, 또한 생식 세포 (도 3)에 의해 표현되는 것을 주목해야한다; 이러한 생식 세포 염색 처리 생식선 혈관 염색 부족 기술적 인 이유로 아니라는 것을 보여 주며, 또한 생식 세포와 같은 다른 세포 유형은 약물 치료에 의해 영향을받지 않는 것으로 보여 내부 제어이다. 대부분의 초기 고환의 형태 형성이 E11.5와 E13.5 사이에 일어난 점을 감안,이 단계는 특히, 생식선에서 VEGF의 역할과 혈관 재 섹스 특정 분화에 영향을 미치는 요인을 결정하기위한 최적의 창입니다.

E11.5와 E13.5 사이의 폐 개발하는 동안 TKI II의 사용은 혈관의 작은 분자 억제 다른 기관 (그림 4)에서 재생 될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 t의 효능을 나타낸다그 생체 태아 기관 액적 배양 모델 시스템과 기관 내 신호 전달 경로 변경하는 소분자 억제제를 사용하는 능력. 이 프로토콜의 용이성, 유연성 및 효율성을 감안할 때, 액체 방울 문화는 생체 내에서 해결할 수없는 장기 개발에 관한 실험 질문에 대한 적절한 대안을 제공합니다.

그림 1
관내 전체 기관 방울 문화 프로토콜의 1 단계 그림. 열린 복강 임신 마우스 안락사 (A). 동봉 된 배아와 (B) 자궁 경적. (C) 노출 된 배아 함유 난황 열린 자궁 벽의 근접 촬영보기. (D) 단일 배아 (e)는 부착 난황 (Y)로 묶여 태반 (P)에. (E) 배아는 F를 분리 롬 태반과 난황. (F) 내장 기관을 제거하고 비뇨 생식기 능선이 (검은 색에 설명 비뇨 생식기 능선 내 생식선). (G)를 노출 비뇨 생식기 능선의 고립의 근접 (생식선 - mesonephros 단지 검은 색에 설명)와 해부 배아. 별표 G와 H. (검은 색 점선으로 묘사 해부) 비뇨 생식기 릿지에서 생식선 - mesonephros 단지의 (H) 분리의 지느러미 대동맥이다. G, 생식선; M, mesonephros. (I) 35 mm 배양 접시의 뚜껑 내 방울 문화의 집합입니다. 검은 색 화살표는 방울 내 생식선을 가리 킵니다. (T)는, 처리; C, 제어 할 수 있습니다. (J) 오픈 가습 챔버 내에 배치 두 방울 배양 접시의 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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생체의 그림 2. 개발 자궁 기관에서 상대적 배양 장기 방울의 브라이트 이미지를 :. E11.5에-utero- 개발 기관 (생식선과 폐) (첫 번째 열) 24 시간 (두 번째 열)과 48 시간 액적 제어 문화 (제 3 열) 후 E11.5 기관; TKI II VEGFR 억제제 (제 4 열)와 함께 48 시간 동안 배양 E11.5 기관; 및 E13.5 인 - utero- 기관 (다섯 번째 열)을 개발. 생식선은 mesonephros (불투명 한 구조) 위의 생식선 (일반 구조)를 지향하고 있습니다. E11.5의 생식선은 바이 포텐셜하고 (남성) XY와 XX (여성) 샘플 형태 학적으로 동일하게 나타납니다. 스케일 바, 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. 예 생체 방울 문화 고환에-utero- 개발 대응에 조직 구조와 세포 사멸에 필적의 면역 형광 이미지 :. 인 - 자궁 E11.5 태아 고환 (첫 번째 열) -developed; 제어 E11.5의 고환 제어 생체 방울 문화 (두 번째 열)의 48 시간 후, E11.5 고환 TKI II VEGFR 억제제 (세 번째 열)와 생체 방울 문화의 48 시간 후, 과에-utero- E13.5은 (제 4 열) 고환을 개발했다. 점선은 (생식선이 위에 지향) 생식선 - mesonephros 경계를 나타냅니다. SOX9는 세르 톨리 세포 마커 및 정소 코드 구조를 시각화하는데 사용된다; PECAM1는 세균과 혈관 내피 세포 (따라서, 처리 생식선에 PECAM1 염색 남은 거의 독점적으로 생식 세포이다)로 표현된다; 및 cleavED 카스파 제 3 사멸 세포의 마커입니다. 전시 TKI-II 배양 생식선은 혈관 비정상 정소 코드 형태 형성을 방해하면서 배양 제어 생식선은, 인 utero- 개발 대응 유사한 정소 코드 형성, 정소 특정 혈관 (도에 걸쳐 화살표), 및 아폽토시스의 상대적인 수준을 보였다. 혈관이 일반적으로 존재하지만 처리 시료에서 검출되지 않는 경우 브래킷은 생식선의 표면 영역을 나타냅니다. 화살촉은 TKI-II 처리 고환의 혈관 세포 덩어리 죽어 가리 킵니다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 기타 태아의 장기 (폐) 방울 생체 전 배양이 비슷하다 > IN- utero- 개발 기관의 면역 형광 이미지 :. E11.5에-자궁 -developed 폐 (첫 번째 열) E11.5 폐 제어의 48 시간 생체 방울 문화 (두 번째 열) 후; E11.5 폐 TKI II VEGFR 억제제 (세 번째 열)와 생체 방울 문화의 48 시간 후, 과에-utero- E13.5은 (제 4 열) 폐를 개발했다. 세포 분기 SOX9 라벨; E-cadherin의 마크는 관형 구조 상피; PECAM1은 혈관 내피 세포 레이블; 그리고 카스파 3마르크에게 사멸 세포를 분해. 예 생체 제어 배양 기관에-utero- 개발 기관에 비해 배양 기관에서 유사한 아키텍처와 SOX9, E-cadherin의 발현 및 PECAM1을 보여 주지만, 세포 사멸의 다양한 양. (PECAM1 염색으로 계시) TKI II 치료시 혈관 개발은 크게 폐 감소된다. 스케일 바, 100 μm의.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단계 온도 시간 횟수
시작 94 ° C 2 분 1주기
변성 94 ° C 15 초 35주기
가열 냉각 57 ° C 30 초
연장 72 ° C 30 초
72 ° C 5 분 1주기

표 1 : XY PCR 분석 프로그램 배아의 XX / XY의 유전자형에 사용 "XY (짧은)"PCR 프로그램 사이클 파라미터를..

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Discussion

이 연구는 태아의 발달을 연구하는 많은 응용 가능성을 갖는 생체 전체 기관 방울 방법을 보여줍니다. 이 기술로 인해 배아 및 배아 치사의 잠재적 어려움을 사용하여 생체 내에서 생물학적 검사하기 어려운 문제를 해결하기위한 접근 연구원 여러 기관에 사용하고, 허용 할 수있다. 이 배양 방법은 포유 동물 세포주와 같은 접근 체외 다른 위에 추가적인 이점이 전체 기관 그러므로 자궁 내 존재하는 중요한 세포 간 상호 작용을 유지하면서 사용될 수있다; 배양 부피는 따라서 드문 비싼 약제 학적 시약의 매우 소량을 사용하여 (~ 30 μL) 매우 작다.

방울 문화 프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다 기관의) 깨끗한 해부. 깨끗한 해부 조직 구조가 유지 될 수 있도록 노출 절단되거나 손상된 SUR의 수를 최소화배양 접시 표면에 흡착 될 수 있으며, 문화를 방해 할 수있다면,; b) 장기 성장 및 형태 형성을 허용하기 위해 액적 내의 기관의 적절한 방향,; 액 적이 건조하지 또한 표면 장력에 의해 제자리에 유지되지만 장기되도록 c), 액적에게 적절한 크기를 결정; d) 기관에 대한 정확한 액적 부피를 사용. 액적 부피는 경험적으로 결정되고, 장기의 크기에 따라서한다. 그러나, 30 μL 합리적인 출발점이 될 것이다. E) 목표 세포 문제를 해결하기 위해 개발의 중요한 단계를 선택하고; 및 f) 상기 액적 내 조직을 손상시킬 수있는 오염을 방지하기 위해, 멸균 된 배양 환경을 유지.

이 논문은 주로 (초기 성적 분화 동안 즉,) E11.5-E13.5의 생식선에 초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 다른 기관에 적용 할 수 있음을 보여줍니다. 다른 기관이 프로토콜의 잠재적 인 수정은 다음과 같습니다 :) 개발의 특정 기관 및 / 또는 스테이지에 대한 액적 부피를 변경. 이 방법은 배양중인 모든 태아 생식선 단계에 적용 가능하지만, 큰 부피 장기 이후 태아 단계에 대해 조정되어야한다. 간단한 확산 영양소 또는 시약은 나중 단계에서 매우 효과적으로 큰 조직을 관통하도록 허용하지 않는다는 주어진 태아 단계가 큰 기관에 사용될 수있는 한계는 가능성이있다. 그것은 따라서 실험에 대한 가능한 초기 단계에서 태아의 기관이 문화를 사용하는 것이 좋습니다. b) 배양 배지에 외인성 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 요소를 추가. 일부 기관은 정상적인 형태 형성을 받아야하는 특정 단백질이나 호르몬을 필요로 할 수있다; 따라서,이 프로토콜은 배양액에 같은 시약의 첨가에 의해 변형 될 수있다. c) 배양 시간의 길이를 조정하는 단계를 포함한다. 초기 고환 개발이 적은 24 시간에서 발생할 수 있지만, 다른 기관은 문화에 더 긴 시간을 필요로 할 수있다. 방울 경우무균 유지, 조직 문화에서 최대 4 또는 오일에 순종 할 수있다. 문화 (이상 48 시간)의 오랜 기간 동안, 암모니아를 제거하거나 다른 빌드 업 폐기물 방울의 세트 볼륨을 제거하고 있음을 대체하여 물방울 (관련 시약)는 매일 미디어를 새로 고침 할 필요가있다 부산물 신선한 매체와 동일한 볼륨; 처리 방울을 위해, 신선한 미디어는 초기 치료로 약물 / 시약의 동일한 농도를 포함해야합니다. D) 미디어 및 / 또는 관련 시약의 구성을 변경. 일부 조직은 원하는 효과를 유도하는 약제 학적 주어진 시약의 다소를 요구할 수있다. 그것은 / 차단 원하는 경로를 활성화하지만 배양 된 장기에 중요한 세포 사멸을 유도하지 않습니다 최적의 농도를 찾아 (절단 된 카스파 제 3 염색을 통해) 농도의 용액을 희석 및 평가 세포 죽음을 시도하는 것이 좋습니다. 내부 통제의 E)를 사용. 같은 생식선 등의 기관이 쌍으로 제공하기 때문에, 하나의 생식소는 역할을 할 수있다반대측 처리 생식선을위한 이상적인 내부 통제 등. 같은 쌍으로 오지 않는 간 등 다른 장기; 사용 된 마우스 균주가 드문 샘플이 제한된 경우, 반 장기 해부 및 제어 및 치료를위한 각 샘플의 절반을 사용하는 것이 가능하다. 하나는 하나가 기관의 측면에 주목을해야한다, 그래서 심지어 기관, 쌍으로 와서 그 사람들은 (예 : 폐의 각면 로브의 다른 번호) 비대칭이 표시 될 수 있음을 명심해야한다 제어에 사용되는 및 치료 샘플.

방울 문화가 잠재적으로 자궁 개발의 거의 모든 측면을 다시 만들 수 있지만,이 기술에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하나는 일반적으로 액체 방울 문화 및 체외 배양 기술은, 자궁 개발 1,5에서에 대해 지속적으로 느린 성장 속도가 발생할 것입니다; 이는 이러한 배지에 필요한 성장 인자의 낮은 농도와 같은 요소의 개수 가능성 (및조직에 대한 액세스) 및 제한 신생 혈관 생체 발생합니다. 장기의 크기에 더하여, 이식편이 제대로 배향 또는 방울이 잘못된 크기되지 않은 경우, 조직 형태 평탄화 또는 한천 침대에 의해 제공되는지지 구조체의 부족으로 왜곡 될 수 있으며, 문제가있다 다른 프로토콜에. 그러나,이 문제는 프로토콜 파라미터의 최적화를 회피 할 수있다. 또 다른 잠재적 인 제한 요소는 미디어 및 시약 전체 장기에 걸쳐 확산 될 수있는 방법도이고; 이러한 배양 조직을 혈관되었지만, 거기에 의한 혈류의 부족이 혈관을 통해 생체 영양분 및 산소의 관류 없으므로 대신 확산 인자가된다. 이 제한은 생체 정자에서 이식편의 주변하지만 조직의 중심 - 대부분의 부분 (즉, 미디어에서 먼) degenera에서 잘 유지하고, 출생 후 고환의 문화에서 특히 분명하다TES 21-23. 이러한 관찰을 감안할 때 크기가 전체 기관 배양 물 또는 대형 이식편 프로토콜에 대한 일반적 제한 요소 인 것으로 보인다. 그러나, 태아 폐 및 태아 생식선의 드 노보 정소 코드 형성 분지 형태 형성과 같은 일반적인 형태 발생 프로그램은, 여전히 액적 배양에서 발생한다. 따라서, 이러한 기본적인 공정은 여전히​​ 이러한 기술을 이용하여 연구 할 수있다.

이 모든 기관 프로토콜은 처음 Maatouk 등으로 설명했다. Coveney 등에 의해 이전 한천 기반의 배양 방법에서 적응 2. 4 배양 장기를 생체 통해 물방울보다는 한천 우물의 혜택이에 사용한다는 것입니다 따라서 시약 보존 적어도 10 배 감소 배양 부피; 또한, 액체 방울 법은 시간을 절약되는 드 시약의 효율성에 대한 우려를 우회 시약 - 함유 배지에서 한천을 미리 웰 배양 포함하지 않는다한천을 통해 조직에 겁 많은. 한천 기반의 방법은 일반적으로 조직의 더 충실 입체 구조를 유지하는 것으로 생각되지만, 이식편 및 배양 조건의 최적화 (상기 참조)의 적절한 방향은 액적 배양 장기의 정상 형태를 보장한다.

이러한 결과에-utero- 개발 기관에 필적하는 생체 방울 배양 태아의 생식선 전시 성장과 형태 형성을 보여줍니다. 이 배양 기법 생식선에 한정되지 않고, 또한 폐 같은 다른 태아 기관에 적용될 수있다. 이 생체 장기 방울 방법은 전체 기관 신호 및 기관 고유의 세포 상호 작용의 연구에 도움이 될 것입니다, 문화, 약물 치료 후 이미지 전체 기관 수있는 능력에 의해 부분적으로 도움을 주었다. 혈관 형태 형성에 미치는 영향을 조사하는 소분자 억제제를 이용 연구 여기서 설명하지만, 시판 아바의 과다ilable 약리 시약은 신호 전달 경로 및 생물학적 과정의 군중을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 많은 잠재적 인 미래의 연구자가 발생 생물학에 흥미 있고 중요한 질문을 검사 할 수 있도록이 방울 배양 방법에 사용이 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

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References

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