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Developmental Biology

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Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

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Abstract

La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.

Introduction

La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativo o cultivos de órganos enteros. Kalaskar et al. 1 han demostrado que la cultura embriogénesis ex vivo toda produce resultados comparables (en el 58% de los embriones cultivados) en el desarrollo del útero, lo que sugiere que los métodos de cultivo ex vivo son una alternativa viable para los estudios de organogénesis.

Un sistema de cultivo de órganos individualizado, como este ex vivo droPlet sistema de cultivo, permite el análisis de órganos conjunto independiente de los efectos sistémicos, al tiempo que permite la manipulación de una vía de señalización específica o interacciones celulares a través de la adición de reactivos farmacológicos o anticuerpos. Tradicionalmente, el estudio de desarrollo de los órganos del feto se ha limitado a las tecnologías transgénicas y knockout de ratón, además de reactivos farmacológicos entregados por vía materna. Sin embargo, hay cuestiones técnicas que implican estas técnicas y tratamientos in vivo; la mayoría de las preocupaciones giran en torno a los efectos de influir en varios órganos simultáneamente que a menudo resulta en letalidad embrionaria. Una preocupación adicional de estudios de manipulación de desarrollo fetal farmacológicamente es el efecto materno de los fármacos sobre el desarrollo embrionario in utero (por ejemplo, el metabolismo maternal de la droga antes de que alcance el embrión) y si tales reactivos pueden pasar a través de la barrera placentaria.

La técnica de cultivo de órganos toda describióaquí fue adaptada de un protocolo descrito por primera Maatouk et al. 2, en la que las gónadas fetales enteros se incuban en cultivos ex vivo de gotas en posición vertical. Una ventaja significativa de cultivo de gónadas fetales es que los inhibidores de molécula pequeña pueden acceder fácilmente todo el órgano por difusión simple. . DeFalco et al han demostrado que la utilización de este método de cultivo gotita ex vivo en combinación con inhibidores de molécula pequeña se puede utilizar para estudiar los procesos y las interacciones que se producen durante el desarrollo de las gónadas 3 de señalización; estos procesos serían difíciles de examinar in vivo debido a problemas técnicos (por ejemplo, el paso de drogas a través de la placenta o letalidad de afectar a múltiples órganos utilizando enfoques genéticos o farmacológicos).

La cultura gotita no es sólo una mejora en algunos aspectos más de la experimentación en el útero, pero también es una mejora con respecto in vitro y ex visistemas vo también. El uso de líneas celulares para estudiar la morfogénesis es extremadamente difícil porque carecen de los diversos tipos de células, carecen de la matriz extracelular (ECM) componentes críticos que permiten la formación de la arquitectura de órganos, y pueden exhibir artefactos en las cascadas de señalización. Aunque la ingeniería de tejidos ha hecho mejoras significativas en la creación de andamios que simulan ECM, la falta de conocimiento con respecto a la cual las señales son requeridos por cada tipo de célula durante la organogénesis hace que sea difícil para construir un sistema de órganos in vitro. Otros sistemas ex vivo han sido establecidos previamente para estudiar la organogénesis, o más específicamente la morfogénesis y han sido muy exitoso para imágenes en vivo de los órganos fetales en agar 4, transwells 5, 6, filtros y otras matrices de andamio 7,8. La ventaja del sistema de cultivo gotita es que permite el estudio de la morfogénesis, proporcionando la capacidad de utilizar menos reactivos, que son often caro, pero también dando la tensión superficial de órganos, lo cual es importante para el crecimiento y la señalización de capacidades 9.

En el ratón, la morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre embrionario (E) etapas E11.5 y E13.5; estas etapas comprenden la ventana de tiempo óptimo para los factores que influyen en la diferenciación de sexo-específicas de instrucción. Entre los procesos críticos que ocurren durante la formación de los testículos son la generación de la arquitectura cable de testículo y la formación de una red vascular-testículo específico. La utilización de este órgano vivo todo el sistema de cultivo ex gotita, uno es capaz de alterar la vascularización-masculina específica e inhibir la morfogénesis testículo mediante el uso de un inhibidor de pequeña molécula que bloquea la actividad de los receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); La remodelación vascular mediada por VEGF es crítico para el desarrollo testicular 10-12. Esta técnica se puede aplicar con éxito a otros órganos y puede apuntar tiempo específicoventanas de desarrollo. Formación de imágenes de órganos Todo el montaje permite la visualización de las estructuras vitales así como los cambios estructurales y celulares resultantes de la administración de diversos inhibidores. Es importante destacar que este sistema es ventajoso en que el investigador puede pasar por alto posibles efectos de confusión de la administración del fármaco materna o la interrupción sistémica in vivo durante estrategias gen diana. Por lo tanto, todo este órgano ex vivo sistema de cultivo de gota puede mejorar significativamente la capacidad de entender las interacciones y la señalización que se producen específicamente en determinados órganos durante el desarrollo fetal.

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Protocol

Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories. Experimentos de cultivo anteriores también se han realizado en otras cepas, tales como C57BL / 6J (datos no presentados), pero cualquier cepa se puede utilizar. Hembras adultas embarazadas fueron de aproximadamente 2-3 meses de edad y se sacrificaron mediante inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical y toracotomía bilateral antes de la eliminación del embrión. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices del NIH, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y Platos

  1. Preparar una solución de etanol al 70%. Agua desionizada Autoclave (para la fabricación de cámaras humidificadas y para hacer soluciones / dilución). Esterilizar las herramientas de disección (pinzas, tijeras, y 27 g jeringas de aguja) rociando abajo con etanol al 70%.
  2. PrepararSolución salina tamponada con fosfato 10X (PBS) que contiene calcio y magnesio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M CaCl 2, 3,75 ml de 1 M de MgCl 2 ). Revuelva para disolver en 1 l de agua estéril en autoclave y luego filtrar con papel de filtro. Diluir 10 veces con agua para hacer 1X PBS.
  3. Heat inactivar suero bovino fetal (FBS) a 55 ° C durante 30 min y el filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras.
  4. Preparar 38 ml 1X medio de cultivo completo (llamado DMEM completo, cDMEM), que consiste en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 10% filtró dilución FBS inactivado por calor y un centésimo de penicilina-estreptomicina de valores. Esto por lo general se debe utilizar fresco, pero se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
  5. Reconstituir el VEGFR tirosina quinasa Inhibidor II (TKI II) en DMSO para una concentración de solución madre de 5 mg / ml, y diluir la acción con cDMEM para hacer una solución de trabajo. El aire acondicionado de últimacentración para este estudio es 1,875 g / ml en cDMEM. De acuerdo a las recomendaciones de la empresa, soluciones de reserva son estables durante un máximo de 6 meses a -20 ° C. En cuanto a las soluciones de trabajo, hacer fresco y utilización en el mismo día.
    Nota: La concentración de este fármaco en la solución de trabajo debe ser de dos veces mayor que la concentración final deseada (ya que se diluirá de dos veces en la gotita). Al mismo tiempo, preparar el mismo volumen de cDMEM que contiene el mismo volumen de DMSO para el tratamiento de "control".
  6. Preparar los reactivos de digestión cola (NaOH 50 mM y 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) por separado en agua destilada.
  7. Hacer un balance de los cebadores de PCR XY 25 M (XY adelante 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'y 5' XY Reverse-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 ') junto con agua libre de nucleasa.
  8. Preparar tampón 50X TAE (242 g Base Trizma, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,5, y añadir agua a 1 l fivolumen final). Preparar tampón de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluyó con agua hasta 1 L de volumen total).
  9. Para crear una solución al 2,5% de agarosa (0,625 g de agarosa, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de agua), solución de agarosa de calor en el microondas hasta que hierva, luego dejar enfriar hasta alrededor de 55 a 65 ° C (capaz de tocar). Una vez frío, añadir 2 l de solución de bromuro de etidio 1%, y se vierte en gel.
    ¡CUIDADO! El bromuro de etidio es un mutágeno y teratógeno; por favor, utilice guantes de nitrilo y adecuado protocolo de seguridad al manejar. Alternativamente, se pueden usar otros agentes o colorantes gel de resolución potencialmente menos tóxicos.
  10. Preparar solución de bloqueo (PBS con 0,1% Triton X-100, 10% de suero bovino fetal [FBS], y 3% de albúmina de suero bovino [BSA]) para inmunofluorescencia.
  11. Preparar la solución de lavado (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% de FBS, y 3% de BSA) para inmunofluorescencia.
  12. Preparar PbTx (PBS con 0,1% Triton X-100) para inmunofluorescencia.
  13. Preparar las cámaras de incubación para culture. Llenar platos grandes (100 mm de diámetro) de Petri con 35 ml de agua en autoclave. Coloque cerca del lugar donde se llevará a cabo la disección y culturas.

2. Aislamiento de Fetal Testículos de Mus musculus

  1. Compruebe el ratón hembra de tapones vaginales cada mañana. Mediodía en el día en el que se detecta el tapón vaginal se considera E0.5. La eutanasia del ratón hembra embarazada en E11.5, de una manera consistente con los animales protocolos aprobados.
  2. Rocíe abdomen del ratón con etanol al 70%.
  3. Abra la piel del vientre y el peritoneo con una incisión en forma de V con unas tijeras finas y tire hacia atrás colgajo de tejido para exponer los órganos interiores.
  4. Localice los ovarios en ambos extremos de la trompa uterina. Con unas tijeras, corte en el ovario y el tejido conectivo para separar el útero que contiene los embriones desde el cuerpo de la madre.
  5. Abra la pared uterina cortando suavemente el lado opuesto a la placenta, la exposición de las bolsas de la yema. Sea cuidadoso para no pusaco vitelino ncture para evitar embriones dañar o perder.
  6. Cortar cerca de la placenta para eliminar las bolsas de la yema contiene embrión y colocarlos en un plato que contiene PBS con calcio y magnesio. La presencia de iones de calcio y magnesio ayudará a moléculas de adhesión celular apoyo para mantener la arquitectura del tejido e impiden que el tejido se pegue a las herramientas de disección.
  7. Con unas pinzas, retire el saco vitelino y amnios del embrión mediante la punción con cuidado el saco vitelino para crear un agujero en el que el embrión se puede deslizar hacia fuera. Una vez que el embrión se encuentra fuera del saco vitelino, cortar el cordón umbilical.
  8. Desde este punto en adelante, utilizar un microscopio ubicado en una campana de cultivo de tejido estéril. Retire la cabeza del embrión y deseche pellizcando con pinzas a cada lado del cuello.
  9. Retire la cola y colocar en un nuevo tubo de microcentrífuga para el análisis XY PCR para determinar el sexo del embrión.
    Nota: Si bien es óptimo para gónadas cultura tan pronto como sea posible después de la cosecha, también es possible para eliminar ADN de la cola y realizar XX / XY genotipado antes del cultivo, de modo que el sexo de cada embrión es conocido y sólo el sexo deseado tiene que ser cultivado. Si bien la determinación del genotipo se está haciendo, los embriones pueden mantenerse separados (de modo que puedan ser seguidos) a 4 ° C o en hielo hasta que esté listo para la cultura. Una advertencia es que este periodo fuera en el útero o condiciones de cultivo puede afectar potencialmente a la viabilidad de la cultura o el desarrollo posterior durante el cultivo.
  10. Asegurar el embrión en una posición supina en contra de la parte inferior de la placa de cultivo fijando las axilas de embrión con un par de pinzas (por lo general el fórceps mantenidos en la mano débil). Mantener estas pinzas en lugar de mantener el embrión quieto durante todo el proceso de disección.
  11. Con otro par de pinzas, quite la piel del abdomen y cubre eliminar suavemente el hígado, los intestinos y otros órganos para exponer la pared posterior del cuerpo.
  12. Como las gónadas se encuentran en la pared del cuerpo de vuelta a cada lado de la aorta dorsal,un vaso sanguíneo grande que recorre la línea media del cuerpo, cucharada por debajo de la cresta urogenital con pinzas cerradas y retire la cresta urogenital mediante la apertura de la pinza y levantando. Como las gónadas serán libremente fijadas a la pared, tenga cuidado de no tirar demasiado rápido sin quitar estas conexiones o las gónadas pueden estirar, causando daños a los órganos.
  13. Mueva la cresta urogenital en cDMEM en un plato para aclimatarse tejido para los medios de comunicación.
  14. Separar el complejo gónada-mesonefros del resto de la cresta urogenital utilizando 27 g agujas. Use una aguja para cortar presionando hacia abajo, y utilizar la otra para guiar el tejido correctamente para permitir la separación óptima. Evite el uso de un movimiento de aserrado contra el fondo del plato, como agujas afiladas crearán fragmentos de plástico que se adhieren a los tejidos. Asegúrese de mantener el mesonefros completamente unidos a la gónada.

3. El cultivo de gónadas con un inhibidor de molécula pequeña

  1. Establecer dos 20 μl pipetas a 15 l cada uno. Cortar unos 1-2 mm de una de las puntas de pipeta de barrera utilizando una hoja de afeitar limpia, esterilizada para la transferencia de las gónadas y además del control cDMEM, mientras que la otra pipeta se utilizará únicamente para cDMEM tratado con el fármaco.
  2. Alinear gónadas con su eje longitudinal paralelo a la punta de la pipeta por lo que fácilmente se pueden pipeta con la punta de corte. Tenga cuidado de las gónadas se pegan en el interior de la punta de pipeta.
  3. Etiquetar un lado como la gotita de control y el otro como la gotita que contiene el fármaco. Sólo dos gotitas pueden caber en una tapa de placa de 35 mm. Asegúrese de que las etiquetas de los párpados se ajustan a las etiquetas de los tubos de microcentrífuga que contiene la cola de los tejidos.
  4. Pipeta 15 l de cDMEM que contienen una sola gónada en una gotita en la tapa de una pequeña (35 mm) placa de cultivo (utilizar sólo las tapas, ya que los fondos son demasiado alto para caber dentro de una cámara humidificada placa de Petri). Coloque dos gotas que contienen las gónadas-separadas a ambos lados del plato, fr bien separadoom uno del otro. Compruebe bajo el microscopio para asegurar que las gónadas se han transferido a las gotas.
  5. Para la gotita designado como el control, agregar un adicional de 15 l de cDMEM que contienen DMSO (realizada en el paso 1.5) para hacer una gota con un volumen total 30 l. Utilice sólo la pipeta "control" que no va a ponerse en contacto con la droga.
  6. Para la otra gotita (muestra tratada con fármaco), añadir 15 l de TKI-II que contiene cDMEM para hacer una gota con un volumen total de 30 l. Utilice sólo la pipeta designado para las muestras tratadas con el fármaco.
  7. Usando la pipeta, extender las gotas en un patrón circular expansión hasta que estén cerca de 15-18 mm de diámetro y la gónada se encuentra aproximadamente en el centro. Orientar la gónada para que quede en su lado y la gónada y mesonefros son fácilmente distinguibles. Orientar el pulmón de manera que los dos lóbulos en posición plana.
    1. Aunque diámetro de gota puede variar ligeramente, asegúrese de que las gónadas no son floating y se mantiene en su lugar por la tensión superficial. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí o con el lado de la tapa. Sin la tensión de la superficie, los órganos crecerán en la tapa durante el cultivo y aplanar, distorsionando así la morfología de órganos.
  8. Colocar con cuidado la tapa de la placa de cultivo que contenía las gotitas en posición vertical sobre la superficie del agua en el grande (100 mm) plato humidificador. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas debajo de la parte inferior de la tapa y que está acostado sobre la superficie del agua. No invierta la tapa y tener cuidado de no dejar que el agua toque la parte superior de la tapa donde se encuentran las gotas.
  9. Para crear una pequeña cámara húmeda, cubrir inmediatamente con la tapa del plato humidificador grande para encerrar las culturas gónadas. Actuar lo más rápidamente posible para minimizar cualquier evaporación de medios de comunicación. Asegúrese de que el plato más pequeño tiene espacio entre ella y la tapa del plato más grande para moverse libremente; de lo contrario, la condensación puede hacer un sello y bel intercambio de aire de bloqueo para el tejido.
  10. Una vez que dos pequeñas tapas se colocan en la cámara, coloque inmediatamente la cámara en la incubadora. Incubar las culturas de gotas durante 48 horas en un humidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C.

Reacción en Cadena de la Polimerasa 4. para determinar el sexo de los embriones

  1. Añadir las colas embrionarias para fondo de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Añadir a cada tubo 200 l de NaOH 50 mM.
  3. Coloca a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que el tejido se haya disuelto completamente.
  4. Añadir 50 l de 1 M Tris-HCl y agitar ligeramente y brevemente.
  5. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, hacer una mezcla maestra de PCR fresca multiplicando cada volumen por el número total de muestras: 0,5 l de 25 mM solución Primer, 2,5 l de 10X Taq Buffer, 0,5 l mM dNTPs 10 (nucleótidos), 19,3 l nuclease- agua libre, 0,2 l de ADN polimerasa Taq. Mezclar bien.
  6. Añadir 23l de mezcla maestra de PCR a PCR tubos que contienen 3 l de lisado de colas digeridos.
  7. Tubos Flick para mezclar ellos, a continuación, realizar un breve centrifugado para llevar las muestras a la parte inferior del tubo.
  8. Ejecutar XY programa (Short) PCR (Tabla 1).
  9. Cargar las muestras (con tinte 5x) y la escalera en un gel de agarosa al 2,5% en tampón TAE 1X.
  10. Ejecute la electroforesis en gel de agarosa hasta XX y XY bandas se pueden resolver.
  11. Imagen del gel con la captura de imágenes de luz UV y.
  12. Analizar el X-cromosoma específico vs Y bandas del cromosoma específico (cromosoma X = 331 pares de bases [pb] y XY = 302 pb) 13; XY muestras (masculinas) tendrán dos bandas de 331 y 302 pb, mientras XX (femeninos) muestras aparecerán como una única banda de 331 pb.

5. Toda la inmunofluorescencia Monte Organ

Día 1:

  1. Retire las gónadas de la cultura con una pipeta 1.000 l con una punta de corte. Si se desea, pueden estarcolocado en un plato de PBS para lavar medios y reactivos. Coloque en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. El tamaño de tubo más pequeño conservará reactivos y hacer más fácil hacer un seguimiento de las muestras en el tubo.
    1. Asegúrese de mantener el control y las muestras tratadas, así como muestras XX y XY, en tubos separados y eliminarlos de la cultura con conjuntos separados de pipetas para evitar la contaminación potencial de drogas.
  2. Lávese las gónadas dos veces con PBS. A partir de ahora, este protocolo puede utilizar 1X PBS que carecen de calcio y magnesio. Para lavar ellos, permiten que las gónadas para hunden hasta el fondo del tubo (por gravedad) y luego eliminar el líquido anteriormente. Tenga cuidado de no perder gónadas pipeteando demasiado cerca de ellos.
  3. Eliminar la mayor cantidad PBS como sea posible desde el tubo. Añadir 250 l de paraformaldehído al 4% en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100, y dejar incubar O / N a 4 ° C en un agitador. Alternativamente, esta fijación se puede realizar durante 2 horas a 4 ° C en un agitador. ¡CUIDADO! Paraformaldehyde es una sustancia tóxica, por lo que sigue el protocolo de seguridad al manejar.

Dia 2:

  1. Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx a RT.
  2. Lávese las gónadas 3 veces con 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador.
  3. Bloquee las gónadas al menos 1 hora en 250 l de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador.
  4. Teñir las gónadas O / N a 4 ° C en un rockero en 250 l de anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo.

Día 3:

  1. Enjuague las gónadas dos veces en 250 Solución de lavado l.
  2. Lávese las gónadas 3 veces con 250 l solución de lavado durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en una mecedora.
  3. Bloquee las gónadas 1 h en 250 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador.
  4. Cubra el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para proteger secundaria de anticuerpos fluorescentes de la luz.
  5. Incubar las gónadas 04.02 horas a RT en arocker en 250 l de anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo que contiene Hoechst 33342. Alternativamente, realice anticuerpo secundario y Hoechst 33342 incubación O / N a 4 ° C en eje de balancín.
  6. Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx.
  7. Lávese las gónadas 3 veces en 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador.
  8. Usando una punta de pipeta de corte, transferir gónadas en un portaobjetos con el líquido mínimo. Retire el exceso de líquido con la pipeta, pero asegúrese de que el tejido no se seque.
  9. Orientar las gónadas en forma deseada con unas pinzas, y añadir rápidamente una gota de medio de montaje para montar las gónadas de la diapositiva. Asegúrese de que los abrigos de los medios de montaje todas las muestras por completo; es fundamental para evitar que las muestras se sequen.
  10. Use cubreobjetos (número 1.5 del estilo) de tamaño adecuado para cubrir suavemente muestras. Deje de montaje propagación medios de comunicación para ponerse en contacto con toda la superficie del cubreobjetos. Si es necesario, pulse muy ligeramente en las esquinas de modo que el cubreobjetosno hay grandes burbujas de aire.
  11. Sellar las diapositivas con claro esmalte de uñas en los bordes para reducir la evaporación de los medios de montaje. Tienda diapositivas montadas en la oscuridad a 4 ° C.

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Representative Results

El cultivo ex vivo de gota le permite a uno para manipular órganos enteros, como el de las gónadas, para estudiar las interacciones celulares y dinámicas. La figura 1 muestra de manera gradual cómo preparar una cultura E11.5 gonadal gotas. Los primeros pasos en el protocolo de cultivo incluyen la eliminación inicial del útero que contiene embrión del ratón madre (Figura 1A y 1B). Después de la extracción del útero de la madre, la pared uterina se corta y los embriones se liberó del saco vitelino en PBS para su posterior disección (Figura 1C-E). Después de la extracción de órganos viscerales, la cresta urogenital es claramente visible a lo largo de la pared del cuerpo espalda del embrión (Figura 1F) y se aísla (Figura 1G). El complejo gónada-mesonefros A continuación, se disecó fuera de la cresta urogenital (Figura 1H), y se coloca en la cultura gotita con el inhibidor de molécula pequeña (Figura 1I,izquierda: "T" para tratar) y sin inhibidor de molécula pequeña (Figura 1I, derecha: "C" para el control). Los pequeños platos que contienen las gotas están encerrados en una cámara húmeda de expediente (Figura 1J) y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 horas.

Después de la incubación de 48 h se eliminan los órganos cultivados, se lavaron con PBS, y se someten a todo un protocolo de inmunofluorescencia de montaje para evaluar la eficacia de la cultura y el tratamiento de drogas; Alternativamente, pueden ser procesados ​​para extracción de ARN para los análisis de la expresión génica. Enteros fetales gónada-mesonefros complejos (E11.5 y mayores) tienen una alta tasa de supervivencia cuando se transfiere a los medios de cultivo inmediatamente después de una disección limpia y se cultivaron en condiciones normales (37 ° C y 5% de CO 2) de 48 horas (pero pueden ser potencialmente cultivaron durante más tiempo si es necesario). Las comparaciones de las gónadas E11.5 bajo microscop campo claroy en incubación inicial frente después de 24 o 48 horas de cultivo revelan un cambio dramático en la forma de las gónadas y la aparición de estructuras del cordón-raya como en la gónada XY de control (Figura 2). Por lo tanto, después de cultivar durante 48 horas, el desarrollo es comparable a la de E13.5 en las gónadas útero (Figura 2). Además, el pulmón fetal E11.5 crece y muestra aumentó de ramificación que se produce normalmente durante esta fase en el desarrollo (Figura 2). El proceso de cultivo da lugar generalmente a órganos más pequeños en comparación con in utero, muy probablemente debido a hecho de que las condiciones de cultivo no son tan óptimo para el crecimiento en relación con el medio ambiente en el útero (ver Discusión).

Aunque el tamaño de los órganos resultantes de la cultura 48 hr difiere de la de los órganos en el útero -desarrollado, órganos cultivadas ex vivo muestran la arquitectura del tejido similar y pueden servir como sustitutos razonables (Figures 3 y 4). Para caracterizar la arquitectura del órgano y la morfogénesis, marcadores que etiquetan específicamente tipos de células de órganos críticos fueron usados, tales como SOX9 para las células de Sertoli testículo y células de pulmón de ramificación, E-cadherina para las células epiteliales del pulmón, PECAM1 para las células germinales y la vasculatura, y se escindió de la caspasa 3 para células apoptóticas (Figuras 3 y 4). Sox9, que codifica un factor de transcripción, juega un papel importante en la proliferación fetal órgano, la diferenciación y formación de la matriz extracelular. Por lo tanto, en ambos órganos, SOX9 se utiliza como un marcador de arquitectura común de que las etiquetas de las células de Sertoli situadas dentro de las cuerdas 14-16 testículo y estructuras de ramificación dentro de los pulmones 17.

Culturas gónadas, en particular, recrean en la morfogénesis útero con eficacia. La gónada ratón se especifica en el embrionario (E) E10.0 escenario y es inicialmente morfológicamente idénticas en XY (masculino) y XX (female) embriones. La expresión de la (región determinante del sexo del cromosoma Y) Sry gen en gónadas XY a partir de E10.5 impulsa grandes cambios morfológicos y moleculares que se producen rápidamente entre E11.5 y E13.5 en el testículo fetal 19, incluyendo: la especificación de células de Sertoli, el linaje de células de soporte del testículo; la formación de cordones de testículo, que se componen de células de Sertoli y germinales y son los precursores a fetales túbulos seminíferos adultos; y gran remodelación vascular. En la remodelación vascular específica de machos, las células endoteliales liberados de un plexo vascular en el mesonefros vecinos migran a la gónada para formar un sistema arterial 4,20-testículo específico. Inmunofluorescencia análisis revelan estructuras del cordón testículos bien desarrollados y vasculatura en E13.5 en los testículos útero relativos a E11.5 testículos (Figura 3). Como las imágenes de la Figura 3 muestran, el sistema de cultivo de gota puede recrear testículo diferenciación eventos ex vivo, ya que es posible visualizar las células de Sertoli SOX9-positivas en gónadas XY forman en cuerdas-túbulo como vasculatura y que forman en todo el órgano. Con respecto a los pulmones, los resultados de los cultivos de 48 horas en una mayor ramificación de SOX9 / E-cadherina ramas epiteliales de doble positivas en el transcurso de 2 días (Figura 4). Además, vemos niveles similares de la apoptosis en el control cultivadas y en las gónadas el útero, mientras que hay un cierto aumento de células apoptóticas en los pulmones en las mismas condiciones de cultivo (Figuras 3 y 4), lo que sugiere que la gónada es particularmente susceptible a las condiciones de cultivo.

Inhibidores de pequeña molécula puede usarse para estudiar el desarrollo de órganos al afectar localización celular, la proliferación, y el estado del ciclo celular, así como la arquitectura de órganos y diferentes cascadas de señalización. El método gotita todo el órgano ex vivo permite al investigador para administrar reactivos farmacológicos fácilmente a Feórganos Tal en un volumen muy pequeño de medios de cultivo. Para examinar los efectos de la vascularización y el remodelado vascular en la diferenciación y la morfogénesis testículo, se utilizó el inhibidor de molécula pequeña TKI II, un reactivo que interrumpe el desarrollo vascular testículo 3 mediante el bloqueo de la actividad de los receptores de VEGF; la formación de la arquitectura testículo fetal se produce de una manera vascular dependiente, actuando a través de factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) 11,12. Mientras que la vascularización de los testículos es crítica para la exportación de la testosterona que impulsa virilización del embrión, también es un importante motor de la morfogénesis cable de testículo: el trabajo previo ha demostrado que cuando la señalización VEGFA se bloquea en o antes de E11.5, células de Sertoli dejar de particionar desde que rodea las células intersticiales y no hay estructuras del cordón formar 3,12. Los resultados mostrados aquí demuestran que la interrupción de la remodelación vascular en el testículo fetal es eficaz en el sistema de cultivo de gotita, y subsequent defectos en la morfogénesis testículo (es decir, la formación anormal cable de testículo) se pueden visualizar (Figura 3). Cabe señalar que PECAM1, un marcador de células endoteliales, también es expresado por las células germinales (Figura 3); esta tinción de células germinales es un control interno que muestra que la falta de tinción vascular en las gónadas tratado no se debe a razones técnicas, y también demuestra que otros tipos de células tales como las células germinales no se ven afectados por el tratamiento con fármacos. Dado que la mayoría morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre E11.5 y E13.5, estas etapas son la ventana óptima para factores que influyen en la diferenciación específico del sexo, en particular, el papel de VEGF y el remodelado vascular en la gónada determinante.

El uso de TKI II durante el desarrollo pulmonar entre E11.5 y E13.5 muestra que la inhibición de molécula pequeña de la vasculatura puede ser reproducido en otro órgano (Figura 4). Estos resultados muestran la eficacia de tél ex vivo sistema de modelo de cultivo de órgano gotita fetal y la capacidad de utilizar inhibidores de molécula pequeña para alterar las vías de señalización dentro de los órganos. Dada la facilidad, flexibilidad y eficacia de este protocolo, la cultura gotita ofrece una alternativa adecuada para las preguntas experimentales en relación con el desarrollo de órganos que no puede ser abordado en vivo.

Figura 1
Figura 1. Pasos en el vitro órgano completo protocolo de cultivo gotita en. (A) sacrificados ratón embarazada de cavidad peritoneal abierto. (B) del cuerno uterino con embriones cerrados. (C) Vista de primer plano de la pared uterina se abrió con expuesta yema saco que contiene embrión. (D) Un solo embrión (e) se adjunta a la placenta (p) encerrado dentro del saco vitelino (y). (E) Embryo f separa placenta rom y el saco vitelino. (F) de embriones disecado con vísceras eliminado e cresta urogenital expuestos (gónadas dentro cresta urogenital se indica en negro). (G) Primer plano de aislados de la cresta urogenital (complejos-mesonefros gónada delineados en negro). Asterisco indica aorta dorsal en G y H. (H) Separación de gónada-mesonefros complejo desde la cresta urogenital (disección representado por la línea discontinua negro). g, gónadas; m, mesonefros. (I) Puesta en marcha de las culturas de gotas dentro de 35 mm tapa de placa de cultivo. Las flechas negras indican gónadas dentro de las gotitas. T, tratada; C, el control. (J) Dos tapas placa de cultivo de gotas colocadas dentro de una cámara húmeda abierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Desarrollo de ex vivo gotita órganos cultivados en relación con los órganos en el útero imágenes de campo claro:. E11.5 en utero- desarrollado órganos (gónadas y pulmones) (primera columna); Órganos E11.5 después de 24 horas (segunda columna) y la cultura de control de gota 48 hr (tercera columna); Órganos cultivados durante 48 horas con el inhibidor de TKI II VEGFR (cuarta columna) E11.5; y E13.5 desarrolló en utero- órganos (quinta columna). Las gónadas están orientados con gónadas (estructura clara) por encima de los mesonefros (estructura opaca). Gónadas E11.5 son bipotencial y parecen morfológicamente idénticas en XY (masculino) y XX muestras (hembra). Barra de escala, 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Ex vivo testículos cultura de gota son comparables en la arquitectura del tejido y la muerte celular a sus homólogos desarrollados en utero- imágenes de inmunofluorescencia de:. E11.5 en el útero -desarrollado testículos fetales (primera columna); testículos de control E11.5 después de 48 horas de control de vivo la cultura de gota (segunda columna) ex; E11.5 testículos después de 48 h de ex vivo la cultura de gota con inhibidor de VEGFR TKI II (tercera columna); y E13.5 en utero- desarrollado testículos (cuarta columna). Las líneas discontinuas indican gónada-mesonefros frontera (gónada se orienta en la parte superior). SOX9 es un marcador de las células de Sertoli y se utiliza para visualizar la arquitectura cable de testículo; PECAM1 se expresa en germen y células endoteliales vasculares (por lo tanto, permaneciendo tinción PECAM1 en las gónadas tratada es casi exclusivamente células germinales); y cleaved Caspasa 3 es un marcador de células apoptóticas. Gónadas de control cultivadas mostró la formación similares cable de testículo, la vascularización-testículo específica (flechas a lo largo de la figura), y los niveles de apoptosis en relación con homólogos desarrollados en-utero-, mientras que gónadas TKI-II cultivadas expuestas interrumpidos vasculatura y la morfogénesis anormal cable de testículo. Los corchetes indican dominio superficie de la gónada en las que normalmente está presente vasculatura pero no se detecta en las muestras tratadas. Puntas de flecha apuntan a morir grupos de células vasculares en los testículos tratados con ITC-II. Barra de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Otros órganos fetales (pulmón) cultivadas ex vivo en las gotas son comparables a > In- utero- órganos desarrollados imágenes de inmunofluorescencia de:. E11.5 en el útero pulmones -desarrollado (primera columna); E11.5 pulmones después de 48 h de control ex vivo la cultura de gota (segunda columna); E11.5 pulmones después de 48 h de ex vivo la cultura de gota con inhibidor de VEGFR TKI II (tercera columna); y E13.5 en utero- desarrollado pulmones (cuarta columna). Etiquetas SOX9 ramificación células; Marcas E-cadherina epitelial estructuras tubulares; PECAM1 etiquetas endotelio vascular; y caspasa 3 escindida marcas de células apoptóticas. órganos de control cultivadas ex vivo muestran arquitectura similar y la expresión de SOX9, E-cadherina, y PECAM1 en órganos cultivados en comparación con en-utero- órganos desarrollado, pero cantidades variables de la muerte celular. Tras el tratamiento con TKI II, el desarrollo vascular se reduce significativamente en los pulmones (según lo revelado por tinción PECAM1). Barra de escala, 100 micras.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso La temperatura Hora Número de ciclos
Comenzando 94 ° C 2 minutos 1 ciclo
La desnaturalización 94 ° C 15 sec 35 ciclos
Recocido 57 ° C 30 sec
Elongación 72 ° C 30 sec
Fin 72 ° C 5 minutos 1 ciclo

Tabla 1: Programa de Análisis de PCR XY parámetros de ciclo para "XY (Corto)" programa de PCR utilizado para la XX / XY genotipado de embriones..

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Discussion

Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como líneas celulares de mamíferos: órganos enteros se pueden utilizar, por lo tanto, el mantenimiento de interacciones intercelulares críticos que están presentes en el útero; y el volumen de cultivo es muy pequeño (~ 30 l), utilizando por lo tanto muy pequeñas cantidades de reactivos farmacéuticos raros o caros.

Aspectos críticos del protocolo de cultivo de gota incluyen: a) la disección limpia del órgano. Disección Clean permite la arquitectura del tejido que se mantiene y se minimiza el número de corte expuesta o sur dañadocaras, que pueden ser atraídos a la superficie de placa de cultivo y puede perturbar la cultura; b) la orientación apropiada del órgano dentro de la gotita, con el fin de permitir el crecimiento y la morfogénesis de órganos; c) hacer la gotita del tamaño adecuado, de modo que la gotita mantiene el órgano en su lugar por la tensión superficial, sino también no se seca; d) utilizar el volumen de la gotita correcta para el órgano. Volumen de la gotita debe determinarse empíricamente y de acuerdo con el tamaño del órgano. Sin embargo, 30 l debe ser un punto de partida razonable. e) la elección de una etapa relevante del desarrollo para hacer frente a la cuestión biológica de interés; y f) mantener un ambiente de cultivo estéril, para evitar la contaminación que puede dañar el tejido dentro de la gotita.

Este documento se centra principalmente en la gónada E11.5-E13.5 (es decir, durante la diferenciación sexual inicial), pero también muestra que este protocolo se puede aplicar a otros órganos. Modificaciones potenciales de este protocolo para otros órganos incluyen:) Alterar el volumen de la gotita de un órgano y / o de la etapa particular de desarrollo. Este método de cultivo es de aplicación para todas las etapas fetales para la gónada, pero el volumen se debe ajustar para las etapas fetales tardías de los órganos más grandes. No es probable que un límite a la que las etapas fetales se pueden utilizar para los órganos más grandes, dado que la difusión simple no permitirá que los nutrientes o reactivos para penetrar en los tejidos grandes de manera muy eficaz en las etapas posteriores. Por tanto, se recomienda el uso de esta cultura para los órganos del feto en la etapa más temprana posible para el experimento. b) la adición de factores exógenos de crecimiento, hormonas u otros factores al medio de cultivo. Ciertos órganos pueden requerir una proteína o de la hormona dado a someterse a la morfogénesis normales; Por lo tanto, este protocolo puede ser modificado por la adición de dichos reactivos al medio de cultivo. c) ajustar la longitud del tiempo en cultivo. Si bien el desarrollo inicial de testículo puede ocurrir en tan sólo 24 horas, otros órganos pueden requerir períodos más largos de tiempo en cultivo. Si las gotitasse mantienen estériles, el tejido puede ser susceptible de hasta 4 o incluso 5 días en cultivo. Para los períodos de cultivo (más de 48 hr) más largos, para eliminar el amoníaco u otros residuos construida subproductos puede ser necesario para actualizar los medios de comunicación al día (con reactivos asociados) en las gotitas mediante la eliminación de un volumen determinado de la gotita y la sustitución de que mismo volumen con medio fresco; para gotas tratados, medio fresco deben contener la misma concentración de fármaco / reactivo como en el tratamiento inicial. d) alterar la composición de los medios y / o reactivos asociados. Algunos tejidos pueden requerir más o menos de un reactivo dado farmacéutica para provocar un efecto deseado. Se recomienda probar una dilución en serie de concentraciones y la muerte celular evaluar (a través de la caspasa 3 escindida tinción) para encontrar una concentración óptima que pudiera bloquear / activar la vía deseada pero no inducir la muerte celular significativa en los órganos cultivados. e) el uso de los controles internos. Desde órganos como la gónada vienen en pares, una gónada puede servircomo un control interno ideal para la gónada tratado contralateral. Otros órganos, como el hígado no vienen de dos en dos; Si la cepa de ratón usada es raro y muestras están limitadas, es posible diseccionar el órgano en el medio y utilizar cada medio para el control y las muestras tratadas. Hay que tener en cuenta que los órganos, incluso aquellos que vienen en pares, pueden mostrar la asimetría (como un número diferente de lóbulos para cada lado de los pulmones), así que hay que tomar nota de qué lado del órgano está siendo utilizado para el control y muestras de tratamiento.

Mientras que las culturas de gotitas potencialmente pueden recrear virtualmente todos los aspectos de desarrollo en el útero, hay algunas limitaciones a esta técnica. Una es que las culturas de gotas, y vivo técnicas ex cultura en general, resultan en tasas de crecimiento consistentemente más lentos en relación con el desarrollo del útero 1,5; esto es probablemente debido a una serie de factores, tales como concentraciones más bajas de los factores de crecimiento necesarios en medios de cultivo (y suel acceso al tejido) y la neovascularización limitada que se produce ex vivo. Además del tamaño del órgano, hay una preocupación de que, si el explante no está orientada correctamente o la gotita es el tamaño incorrecto, la morfología del tejido puede llegar a ser aplanada o distorsionada con la falta de una estructura de soporte que es proporcionado por una cama agar en otros protocolos. Sin embargo, este problema se puede evitar con la optimización de los parámetros del protocolo. Otro factor que limita el potencial es lo bien que los medios de comunicación y los reactivos pueden difundir a través de todo el órgano; mientras que estos tejidos cultivados tienen vasos sanguíneos, no hay la perfusión de los nutrientes y el oxígeno a través de estos vasos ex vivo debido a la falta de flujo sanguíneo, lo que en lugar de difusión se convierte en un factor. Esta limitación es especialmente evidente en las culturas testículos postnatales, en la que la espermatogénesis ex vivo está bien sostenido en la periferia del explante pero la porción central mayor parte del tejido (es decir, más alejada de los medios de comunicación) degenerates 21 hasta 23. Teniendo en cuenta estas observaciones, parece que el tamaño es un factor limitante general para cultivo de órgano entero o protocolos de explantes de gran tamaño. Sin embargo, los programas de morfogenéticos generales, tales como la morfogénesis de ramificación en el pulmón fetal y la formación de novo de cable de testículo en la gónada fetal, todavía se producen en cultivos de gotitas. Por lo tanto, estos procesos básicos aún se pueden estudiar con esta técnica.

Este protocolo órgano completo fue descrito por primera vez por Maatouk et al. 2, que adaptó desde el método de cultivo a base de agar anterior por Coveney et al. 4 El beneficio de cultivo de órganos ex vivo a través de gotitas en lugar de en los pozos de agar es que utiliza en menos un volumen de cultivo reducido 10 veces, conservando así los reactivos; Además, el método de gota no implica pre-incubación de los pocillos de agar en medios que contienen reactivo, lo que ahorra tiempo y evita cualquier preocupación acerca de la eficiencia de los reactivos son delivered al tejido a través de agar. Mientras que los métodos basados ​​en agar-se cree generalmente para preservar con mayor fidelidad la arquitectura tridimensional del tejido, la orientación apropiada del explante y la optimización de las condiciones de cultivo (ver arriba) se asegurará de la morfología normal de los órganos de gotitas y cultivadas.

Estos resultados demuestran que ex vivo gotita cultivaron gónadas fetales crecimiento y la morfogénesis exposición comparable a la de los órganos desarrollados en-utero-. Esta técnica de cultivo no se limita a la gónada, pero también se puede aplicar a otros órganos fetales tales como el pulmón. Este método de gota de órganos ex vivo será útil para el estudio de la señalización de todo el órgano y las interacciones celulares órgano-específicas, ayudado en parte por la capacidad de imagen órganos enteros después del cultivo y tratamiento de drogas. El estudio descrito aquí utilizado un inhibidor de molécula pequeña para investigar la influencia de la vascularización en la morfogénesis, pero una gran cantidad de ava comercialmentereactivos farmacológicos ilable está disponible para estudiar una multitud de vías de señalización y los procesos biológicos. Por lo tanto, hay muchos posibles usos futuros para este método de cultivo gotita que permitirá a los investigadores a la sonda preguntas interesantes e importantes en la biología del desarrollo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

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References

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