マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

Bioengineering

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Rozovski, U., Hazan-Halevy, I., Calin, G., Harris, D., Li, P., Liu, Z., Keating, M. J., Estrov, Z. Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome. J. Vis. Exp. (112), e53300, doi:10.3791/53300 (2016).

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Abstract

タンパク質をコードする遺伝子の転写調節が広範に研究されたが、ほとんどは、具体的にはマイクロRNAの転写因子は、非コードRNAの転写に関与している方法で知られています。ここでは、公的に利用可能なデータ、計算リソースと高スループットデータを使用してマイクロRNAの転写を調節する転写因子の潜在的な役割を研究するための戦略を提案します。我々は、転写因子結合部位に濃縮されているマイクロRNAプロモーターを同定するために、ENCODEプロジェクトからデータを-sequencingマイクロRNAプロモーターおよびクロマチン免疫沈降(ChIP)を識別するためにH3K4me3とエピジェネティックな署名を使用しています。 shRNAのが目的の転写因子を標的とし、マイクロRNA配列に細胞をさらすと、目的の細胞をトランスフェクトすることにより、我々は、マイクロRNAトランスクリプトーム上で、この転写因子の効果を研究します。説明に役立つ例として、我々は慢性光年のマイクロRNAトランスクリプトーム上のSTAT3の影響に関する我々の研究を使用しますmphocytic白血病(CLL)細胞。

Introduction

マイクロRNAは、典型的には、転写後レベルでのmRNA発現の負の調節因子として機能する内因性の小さな非コード規制のRNAです。約1,000非コード20〜25ヌクレオチド長のマイクロRNAは、ヒトのゲノム1,2に記載されています。マイクロRNAは、マイクロRNA、一般に、標的mRNAの3 '非翻訳領域(UTR)に位置するその相補的シードマッチ配列のシード配列との間の標準的な塩基対形成を介して遺伝子発現を調節します。まとめると、マイクロRNAは、タンパク質をコードする遺伝子3の30%以上を調節し、少しだけは、マイクロRNAのDNAから転写について知られています。マイクロRNAの転写の調節は、mRNA 4,5と同様であることが示唆されています。具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の転写を促進するその活性と同様に、転写因子は、マイクロRNA 6の転写を活性化すると考えられています。転写因子メートルicroRNAの相互作用は、遺伝子発現の調節因子7因子として報告されており、また、フィードバックとフィードフォワードループを形成してもよいです。例えば、Yamakuchi らは、p53が順番にp53のリプレッサーSIRTし、それによって増加p53活性8の翻訳を阻害するmicroRNA34aの発現を誘導するフィードバックループを報告しました。

マイクロRNAの転写因子依存性発現の特定の例が報告されている一方で、関心の転写因子は、マイクロRNA-トランスクリプトームの発現を調節する方法に関する情報を提供する認められた方法が欠けています。本明細書で提案したプロトコルの目的は、マイクロRNA-トランスクリプトームの転写因子依存性調節の詳細な説明を提供することです。公に利用可能なデータ、バイオインフォマティクスツールを組み合わせ、マイクロアレイ技術を用いて、このアルゴリズムに従う、研究者は、ゲノム規模で捕捉することができるだろうか、任意の関心対象の任意の細胞型における転写因子は、マイクロRNA-トランスクリプトームの発現を調節し、マイクロRNAの発現を調節する転写因子mRNAの推定寄与を探索します。

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Protocol

1.データマイニング手法を用いたマイクロRNA遺伝子のプロモーターにおける転写因子結合部位を特定します

  1. DNA要素(ENCODE)プロジェクトの百科事典の一部として生成されたクロマチン免疫沈降(チップ)配列データを抽出するために、カリフォルニア大学サンタクルーズ(UCSC)ゲノムブラウザを使用してください。
    1. UCSCゲノムブラウザでテーブルブラウザを開きます。
    2. テーブルを抽出するために、以下の仕様を使用します。クレード:(哺乳類)、ゲノム:(人間)、アセンブリ:(Feb2009(GRch37 / hg18))、グループ:(規制)、トラック(TxnFactorChIP)、テーブル:(weEncoderesTFbsCo7steredv3)、地域:(ゲノム)、出力形式(選択したテーブルからすべての遺伝子)。
    3. .txtファイルとして1.1.2からの出力を保存し、スプレッドシートに。
    4. 関心の転写因子のためのソートやフィルタ( 例えば 、STAT2)。
  2. Baeer で入手可能なH3K4me3とのエピジェネティクスのシグネチャに基づいて、マイクロRNAプロモーターのリストを使用してください。9
  3. ヒトゲノム上の座標に応じて一致させるために、( 例えば 、STAT3が推定されるマイクロRNAプロモーターに結合)1.1および1.2からのデータをマップし、補足的なコーディングファイル1に概説されるようにシャープなC言語で書かれたコードを使用して中央値の結合親和性を決定します。

2. shRNAが関心の転写因子の発現をダウンレギュレートするために

  1. プレート約10cmプレート293ヒト胎児腎臓細胞株から1.5×10 6細胞を50%コンフルエンス(10%FBSを含むDMEM)。
  2. shRNAを含む緑色蛍光タンパク質(GFP)レンチウイルス5μgの293ヒト胎児腎臓細胞株由来のトランスフェクト細胞は、目的の転写因子に向けられ、パッケージングベクター5μgのは、製造者のプロトコルに従って接着細胞のためのトランスフェクション試薬を用いました。
  3. 対照として、293ヒト胎児腎臓細胞株からの細胞をトランスフェクト製造業者のプロトコルに従ってのshRNAおよびパッケージングベクターをスクランブル。
  4. (37℃、CO 2インキュベーターで)16時間細胞にトランスフェクションミックスを維持し、次いで10%FBSで、新鮮な10%DMEM培地10ミリリットルにメディアを変更します。
  5. 細胞培養(300×gで、5分間)遠心し、感染性上清を回収、48時間後にトランスフェクションを待ちます。任意の浮遊細胞を除去するために、0.45μmのシリンジフィルター(25mmの界面活性剤フリーのセルロースアセテート膜)を介して上清をフィルタリングします。
  6. 上清を濃縮し、100キロダルトンの閾値と超遠心フィルター装置を使用してレンチウイルスを収集します。 30 950×gでスピン - ボリュームになるまで60分未満250μlに濃縮されています。 -80℃で濃縮したウイルスを保管してください。
  7. レンチウイルスを用いて細胞をトランスフェクト。 -80℃の冷凍庫から冷凍レンチウイルスを削除し、室温に解凍。新鮮な1.5mlマイクロチューブにウイルス上清100μlを移します。
    1. ブリン低血清培地で1ミリリットルにチューブでボリュームアップグラム。 、10ng / mlの最終濃度を1ミリリットルのウイルス懸濁液に臭化ヘキサジメトリンを追加穏やかに混合し、混合物を5分間放置しました。
  8. 遠心し、5×10 6各形質導入のための細胞と穏やかには、ウイルスを含む培地0.5mlに細胞ペレットを再懸濁します。その後、10%FBSの最終濃度に20%FBSを含む培地の0.5ミリリットルを追加し、24時間 - 細胞が4インキュベーターに滞在してみましょう。
  9. 48〜72時間を待って、製造元の指示に従ってヨウ化プロピジウム(PI)および緑色蛍光タンパク質(GFP)で細胞を染色します。光から細胞を保護し、GFP + / PIの速度を測定するために、FACSソーターを使用-細胞を。唯一の死細胞のPI汚れているので、このレートは、生細胞におけるトランスフェクション効率の推定値です。
  10. 以前に10を説明したようにFACSソーターによりGFP発現(GFP +)のに陽性細胞集団をソートします。
  11. 使用Weste以前前に指定されたshRNAを目的の細胞(例えば、CLL細胞)を感染させた後、目的の転写因子のレベルを決定するために、10に記載されているよう RN免疫ブロッティング。

3.転写因子-shRNAをトランスフェクトした細胞におけるマイクロRNAトランスクリプトームの発現レベルを測定

  1. 製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いてRNAを単離します。
  2. RNAにラベルを付け、マイクロRNAマイクロアレイ11にハイブリダイズします。
  3. 転写因子のshRNAまたは空のベクターコントロール5でトランスフェクトした細胞において差次的に発現マイクロRNAを決定します。
  4. PCR 5リアルタイムを使用して最も差次的に発現するマイクロRNAのためのマイクロアレイの結果を検証します。

4.転写因子依存トランスクリプトームの記述にバイオインフォマティクスおよびshRNAのアプローチ間のオーバーラップを決定

  1. DETへ予想され 、それらのプロモーター中の転写因子結合部位を保有するマイクロRNA遺伝子の比率を観察し、転写因子のshRNAトランスフェクションした細胞で下方制御されたのオコジョ、次の操作を行います。
    1. 1.3で生成されたリストからのプロモーター/総マイクロRNAに興味のある転写因子を保有する遺伝子の比を得ます。このリストは、( 例えば 、STAT3結合部位/総マイクロRNA遺伝子とマイクロRNA遺伝子が= 0.25テスト済み) 期待される比率です。
    2. 決定転写因子のshRNAにおいてダウンレギュレートされた遺伝子の数は3.3で生成されたリストから細胞をトランスフェクトし、1.3で生成されたリストから、結合部位、目的の転写因子を有しています。この数/ダウンレギュレートされた遺伝子の総数は、 観測され比率(STAT3結合部位/ダウンレギュレートされたマイクロRNA = 0.6の合計数と例えば 、マイクロRNA遺伝子)です。
    上記生成された観察と予想される比率を比較し、転写因子のshRNAトランスフェクトされた細胞においてダウンレギュレートされた遺伝子のリストは、それらのプロモーター中の転写因子結合部位に濃縮されているかどうかを判断するための統計をχ2使用します。

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Representative Results

STAT3は、典型的には、抗アポトーシス及び増殖効果12を有する遺伝子の転写を誘導する転写因子です。 STAT3は、非コードRNAトランスクリプトームに影響を与えるかどうかは現時点では不明です。すべてのCLL細胞ではSTAT3は、セリン707残基10,13上に構成的にリン酸化されています。核へホスホセリンSTAT3シャトルは、DNAに結合し、他の細胞型10にチロシンのpSTAT3により活性化されることが知られている遺伝子を活性化します。 CLLは、マイクロRNAネットワーク14の世界的な規制緩和によって特徴づけされているので、我々は、セリンのpSTAT3の存在がCLL細胞におけるマイクロRNAの発現に影響を与えるという仮説を立てました。

この仮説を試験するためにSTAT3結合部位を保有するマイクロRNAのプロモーターが同定されていました。ベアにより生成されたデータを交配することにより。H2K4me3ヒストンMODIFI有する領域9STAT3は、チップ、SEQ実験15によって識別される結合部位を有する、プロモーター部位を特徴付けるカチオンは、推定上のSTAT3結合部位を同定しました。 160推定プロモーターは、100(最低スコア)から千(最高スコア)( 表1)の範囲の結合スコアを有する(N = 200)を調べマイクロRNA遺伝子の約25%で検出されたこのアプローチを使用。

続いて、CLL細胞は、STAT3-のshRNAまたは空ベクターでトランスフェクトし、マイクロRNA配列を使用し、ダウンSTAT3は、これらのマイクロRNAの転写を促進することを示唆しているトランスフェクション( 図1)は、以下の調整された63マイクロRNAを同定しました。 63ダウンレギュレートマイクロRNA遺伝子の60%(N = 38)のチャンス(P <0.0001)によって予想よりはるかに多くの遺伝子の位置の上流推定プロモーターに結合STAT3確認のChIP-seqのデータを、。トランスフェクション後にダウンレギュレートされたナインマイクロRNA、STAT3は負の転写のレベルを調節することを示唆しています。

図1
STAT3-shRNAをCLL細胞の 図1. トランスフェクションは、STAT3タンパク質およびSTAT3のmRNAの発現レベルを低下させます。 :。(西部の免疫ブロッティングにより検出された右のパネル)STAT3タンパク質のSTAT3-のshRNA(定量的RT-PCRによって検出された左のパネル)STAT3 mRNAのレベルとレベルのCLL細胞のトランスフェクションの後有意に減少したB:CLLのマイクロRNA配列細胞は、その発現が、空のベクターでトランスフェクトSTAT3-shRNAをトランスフェクトしたCLL細胞およびCLL細胞の間で有意に異なっ23マイクロRNAを描きました。 0.01未満のP値を統計学的に有意であると考えられたC:使用STAT3-shRNAの処理後示差発現していた7マイクロRNAのRT-PCRによって定量化した平均発現マイクロRNAの配列。バーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル1. このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

miR-1537
マイクロRNA遺伝子 染色体 プロモーターの開始座標 プロモーターの終了座標 中央値(範囲)STAT3結合スコア*
miR-1205、のmiR-1206、のmiR-1207 8 q24.21 128961454 128962791 1000(1000-1000)
1 q42.3 236045425 236047415 1000(1000-1000)
miR-21 17 q23.1 57901872 57921277 1000(112-1000)
miR-3124 1 Q44 249115404 249123965 1000(1000-1000)
miR-451 17q11.2 27222251 27224114 1000(1000-1000)
miR-92B 1 Q22 155162340 155168439 1000(1000-1000)
miR-3197 21 q22.2 42537544 42543023 943(943から943)
miR-646 20 q13.33 58712550 58715320 789(789から789)
miR-629 15 Q23 70383751 70394586 773(661から885)
miR-30E、のmiR-30C-1 1 p34.2 41173077 41177703 759(759から759)
miR-3125 2 p24.3 12855381 12862915 756(756から756)
miR-3145 6 q23.3 138776942 138779365 743(487-1000)
miR-645 20 q13.13 49199911 49201187 743(743から743)
miR-1256 1 p36.12 21346830 21350211 725(725から725)
miR-619 12 q24.11 109248263 109253306 719(719から719)
miR-181A-2のmiR-181B-2 9 q33.3 127418928 127426139 710(710から710)
miR-29A、のmiR-29B-1 7 q32.3 130583383 130597803 697(482-1000)
miR-202 10 q26.3 135069499 135077337 696(393-1000)
miR-3142、のmiR-146A 5 Q34 159890882 159899475 671(671から671)
miR-548c 12 q14.2 65000968 65011503 660(660から660)
miR-630 15 q24.1 72764289 72769197 627(255-1000)
miR-135B 1 q32.1 205416952 205452990 622(245-1000)
miR-29C、のmiR-29B-2 1 q32.2 207991044 208002382 608(608から608)
miR-1825 20 q11.21 30791020 30798310 604(209-1000)
miR-548h-1 14 q23.2 64578834 64581657 587(174-1000)
miR-612 11 q13.1 65183633 65198528 581(157-1000)
miR-148B 12 q13.13 54717640 54721204 578(578から578)
miR-3174 15 q26.1 90543381 90549092 576(152-1000)
let7a-3、let7b 22 46480680 46481826 573(146-1000)
miR-1255a 4 Q24 102263848 102272541 557(557から557)

STAT3結合部位を有する表1推定マイクロRNAのプロモーター。プロトコルは、公開されたデータのデータマイニングを使用してマイクロRNAの推定上のプロモーターに結合する転写因子を同定する方法を提供。例として、ここでは、推定上のマイクロRNAプロモーターにSTAT3の結合を示す表を提示します。結合スコアは、ENCODEプロジェクト15の一部として公開全ゲノムチップのseqデータから0〜1,000のスケールで与えられています。プロモーターはH3K4me3とエピジェネティックな署名9の存在によって同定されています。

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Discussion

タンパク質をコードする遺伝子のRNAポリメラーゼII-依存性転写の基礎となるメカニズムは、広く研究されています。これらの要素はわずか1%を占める一方で-ヒトゲノムの2%、ENCODEプロジェクトからの証拠は、ヒトゲノムの80%以上が転写17を受けることができるし、何が非コードDNAエレメントの転写を調節することを示唆しているが、主に未知のままである6

可能性を解読するのPol IIは、公的に利用可能な資源からのデータを組み合わせる戦略を開発するために私たちを率いて、また、マイクロRNA 6を含むいくつかの非タンパク質コード遺伝子の転写のために責任があることが示されたいくつかの研究で、計算アルゴリズムおよびin vitro試験マイクロRNAの転写を調節する目的の転写因子の機能を有します。本明細書中で提案した戦略は、2の重要なステップを含んでいます。まず、転写因子Bを識別するために、公的に利用可能なデータを使用しますマイクロRNAプロモーターにinding。そのために我々は、転写因子結合およびマイクロRNA-プロモーターの間接的マーカーとしてプロモーターを代表エピジェネティックな署名を識別するために、ENCODEコンソーシアムによって公開チップseqのデータを使用しています。これらのデータセットからの遺伝的座標を横断することは関心の転写因子は、マイクロRNA-プロモーターに結合するか、頻繁の総推定を提供します。第二の転写因子の発現をサイレンシングするためのshRNAの技術を使用してマイクロRNA配列に細胞を供することにより、マイクロRNA、トランスクリプトームの転写因子の機能的重要性を探索することが可能です。

マイクロRNA発現の変動は、部分的にしか転写因子依存性調節によって説明されます。化学量論的変動および他の細胞または細胞外の要因が重要な役割を果たし、提案したアルゴリズムでシミュレートされていません。その他の制限事項は次のとおりです。H3K4me3とに基づいて、プロモーター解析を署名は939注釈付きのマイクロRNAで行いました。それ以来、より多くのマイクロRNAのゲノム位置が同定されています。しかし、更新されたデータベースに基づいており、より包括的なリスト我々の知る限りにまだ公開されていません。 939マイクロRNA遺伝子のプロモーター領域を代表H3K4me3とは、781マイクロRNA遺伝子(83%)において同定されました。この分析は、明らかに不完全なデータセットに基づいていながらそれ故、マイクロRNA-トランスクリプトームのかなりの部分をキャプチャします。

また、エピジェネティクスの署名は、部分的にインプリントされ、一部の細胞特異的でされています。したがって、エピジェネティクスマーカーによって定義された推定プロモーターのgenerabilityを疑問視することができます。 H3K4me3とは、転写18の独立した持続するので、それは一般的にインプリントされたプロモーターのマーカーと考えられています。これらのプロモーターは、異なる細胞 - で同定されたならば、我々は、本明細書に提案する解析的アルゴリズムは、したがって、細胞特異的マイクロRNAプロモーターを見逃す可能性タイプ。最後に、いずれかの結論は、テストされるべきであり、経験的に確認されました。最も顕著なのは、転写因子のダウンレギュレーションとの間の関連は、と(マイクロRNAの配列によって識別される)マイク​​ロRNA発現(shRNAのアプローチを使用して)のみ、このようなクロマチン免疫沈降(チップ)または電気泳動移動度として許​​容可能なアッセイによって確認されるべきである直接的な転写役割を提案することができますシフトアッセイ(EMSA)。本明細書中で提案された方法への変更は、例えば、マイクロRNAプロモーターと転写因子の発現をノックダウンするさまざまな方法を特定するためのさまざまな方法、代わりにshRNAの小干渉RNAが含まれます。マイクロRNAの転写調節は、タンパク質をコードする遺伝子(遺伝子内のマイクロRNA)及び(遺伝子間マイクロRNA)そうでないものの中に存在するマイクロRNAのために、実質的に異なる可能性があります。遺伝子内のマイクロRNAは、一般的にその宿主遺伝子19と一緒に転写されるのでプロモーターは、通常すぐに発見されたupstrea転写開始部位をメートル。しかし、一般的にタンパク質をコードする遺伝子のために使用される多くの遺伝子間の転写開始部位が不十分注釈されているマイクロRNA、および予測ツールのために不十分20行います。

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Acknowledgments

この研究は、CLLグローバル研究財団からの助成金によってサポートされていました。テキサス大学MDアンダーソンがんセンターは、がんセンターサポート助成金(P30CA16672)を通じて米国国立衛生研究所によって部分的にサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamin 2000 Life Technologies 11668027
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific (Nalgene) 190-2545
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa Merck Millipore
Polybrene Merck Millipore TR-1003-G
TRIzol reagent Life Tachnologies (Invitrogen) 15596-026
293 Cell line human Sigma-Aldrich 85120602

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References

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