使用单一感器录音来检测臭虫的嗅觉神经元的反应,以信息化学物质

Neuroscience

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Liu, F., Liu, N. Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals. J. Vis. Exp. (107), e53337, doi:10.3791/53337 (2016).

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Abstract

昆虫嗅觉系统在环境中的检测信息化学物质中起重要作用。特别是,触角感器其中内部容纳单个或多个神经元,被认为是使在响应化学刺激的重大贡献。暴露于刺激后可直接记录动作电位的嗅觉感器,单感器记录(SSR)技术提供了强大的方法来研究昆虫化学刺激的神经反应。为臭虫,其是臭名昭著的人类寄生虫,多种类型的嗅觉感受器的已经表征。在这项研究中,我们证明了臭虫嗅觉感受器的神经反应两个化学刺激和剂量依赖反应使用SSR方法其中之一。这种方法使研究人员能够进行早期筛查有关臭虫的嗅觉感受器个人化学刺激,这将提供有价值的信息,为devel软件包opment新的臭虫引诱或驱虫剂和效益的臭虫的控制力度。

Introduction

常见的臭虫臭虫臭虫L(半翅目:Cimicidae),作为临时外寄生虫,是一种责任吸血昆虫,这意味着它们的生存,发育和繁殖需要从主机的血液来源,包括人类和动物1,2。虽然病毒的传播很少被报道,由于C.臭虫 ,由为患产生刺骨的滋扰,严重影响主机的生理和心理上3。引进和广泛使用化学杀虫剂,特别是滴滴涕,降低侵染的风险,由20世纪50年代的侵扰末端是在如此低的水平,他们不再是严重的公众关注。然而,许多可能的因素导致在床虱种群到回潮全世界,如杀虫剂的使用减少了,公众意识的下降,增加的行进活性,和耐药性的发展对杀虫剂4-9。</ P>

化学线索的环境中检测到,并通过嗅觉器官,如天线和上颌触须认可昆虫。对昆虫触角的嗅觉感受器在检测这些化学信号发挥了至关重要的作用。化学分子穿过角质层表面气孔进入触角角质层。气味结合蛋白在触角淋巴液绑定到这些化学分子和他们运到气味受体10。臭气物质受体和它们的共受体从神经膜的非选择性阳离子离子通道,这将在去极化一旦这些化学分子被气味受体11识别。

单感器记录(SSR)的开发,以检测所引起的化学或非化学刺激的应用的动作电位的胞外变化。通过将记录电极浸入感器淋巴液和参考电极入昆虫身体(通常是复眼或腹部)的其他部分,所述神经元的响应的燃烧率,以刺激可记录12。变化尖峰的数目代表该昆虫对特定刺激的敏感性。不同的身份和浓度的化学刺激将引起不同的神经反应,用不同的燃烧率和时间的结构,并且因此可以用于研究昆虫到特定化学品的编码处理。

对于常见的臭虫,有性形式分享嗅觉感受器的相同模式的触角:九槽的PEGÇ感器,29发丝般E(E1和E2)感器,而每个Dα,Dβ,Dγ顺利盯住一对感器13,14。作为多个神经元已经于每种类型感器的已经确定,这是不容易区分从安置在同一感器不同的神经元的动作电位,所以对于这个实验中托塔动作电位升数字被用于前和刺激后500毫秒周期期间计数的脱线。然后,从刺激前动作电位的数目中减去,并以量化在每秒 15尖峰每个单独感器中的变化的燃烧率乘以二的刺激后动作电位的数目。

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Protocol

1.准备仪器,刺激方案和臭虫的

  1. 制备在20ml的瓶子50%KNO 2溶液(重量/体积)。
  2. 通过反复浸渍钨电极和流出溶液的锐化2钨微电极KNO 2溶液在5 V。
    1. 大致通过浸渍钨丝和移出KNO 2溶液的约10毫米,在2骤降/秒的速度约5分钟,从而可以大大消耗钨丝的前端锐化钨丝。
    2. 微妙锐化电极浸渍在进出溶液的金属丝端头为约1毫米,在2骤降/秒的速度进行至少1分钟,以便使了微细且鲜明点电极。检查电极尖端直径在显微镜下频频,直至达到0.2-0.5微米,这应该是好到足以击穿的臭虫嗅觉感受器的角质层。
      注意:当手动锐厄宁所述电极,所述钨丝送入KNO 2溶液的浸渍速度不是恒定的所有时间。随着越来越多的实践中,这是很容易保持一个相对恒定的速度在锐化电极。磨刀时间也是不确定取决于电极应该怎么罚金。这里,电极尖端〜0.2微米的直径足以刺穿嗅觉感受器。
  3. 每个从整齐化合物二甲亚砜(DMSO)中的化学刺激稀释至1:10体积/体积的初始浓度作为原液。创建一系列十进​​制稀释液根据多少剂量在实验用DMSO需要,再次,从每个原液每个化学。这里,使用10%的(+) - β蒎烯和桉叶油。
  4. 将不喂食物,七天后饲养的成年臭虫(男性或女性)从英尺。在T使用迪克斯殖民地(从海恩斯在肯塔基大学博士赠送)他尝试在培养皿。
    注意:对于放置在培养皿臭虫没有确切的数字。它可以是几个或很多。

2.臭虫触角准备

  1. 麻醉冰(2-3分钟)的臭虫。
  2. 解决这两个天线和虫体在显微镜盖玻片用双面胶带,并用细剪刀去除腿部。
  3. 用一个小针轻轻触碰天线,以便把它们粘在磁带上稳步推进。
  4. 休息盖玻片针对牙科蜡的一个小球(〜1厘米直径)以方便操纵,并将其调整到一个适当的角度(〜90°)为记录电极( 图1)。
  5. 一旦固定,将臭虫立体显微镜下,打开冷光源,调整光照强度,直到天线清晰呈现,并聚焦显微镜上的臭虫天线在高放大倍率的第二鞭毛(720X) 。
    注意:在实验中使用照明的强度是不定量,这真的取决于实验者的眼睛的感觉照度。

3.单感器记录

  1. 连接前置放大器(10X)与信号采集控制器,其与所述计算机进行信号记录和可视化连接。打开电脑,并启动该软件, 例如 ,AutoSpike32并单击“录制”模式从菜单栏中。然后选择“波”,以开始录制波信号。
    注:平线从左侧重复运行到显示器的,现在应该是可见的。这里,记录窗口持续40秒。最大波记录为10秒。选择的采样速率是96000和数字采样率是240有0%偏移和无滤波,没有整流为记录信号。在该软件的所有这些参数的设置可以根据需要进行修改。
  2. <利>打开连接到前置放大器,其用于呈现调色模式从触角感器的神经元的反应的扬声器。
  3. 将参比电极进入稳定臭虫的腹部。
    注意:参考电极举行通过金属站在磁力附着到空气表。
  4. 后参考电极被连接到臭虫的腹部,将记录电极,其连接到前置放大器和操纵由显微,朝向臭虫的天线的后端。
  5. 当记录电极与天线的右顶端接触,开关在显微镜并定位在低倍率的电极。
  6. 调整记录电极,同时逐渐增大放大倍数,直到两个电极和触角感器是在同一平面上,并在显微镜下清晰可见。
    注意:这个时候,显微镜通常LY最高放大倍率。
  7. 将记录电极到使用显微感器的轴,去得更深一些,如果比动作电位的背景噪声高。
  8. 一旦清楚动作电位是从所记录的感器观察,填充微量吸有10%(+) - β蒎烯。使用微量沉积由10%(+),10微升等分试样β - 蒎烯到滤纸条(〜3×15毫米)放置在玻璃巴斯德吸管内。
    1. 加载的吸移管连接至刺激控制器的脉冲流管的出口与吸移管的尖端放入小孔面向天线管。
  9. 当所有这些连接已经稳定,抑制了刺激控制的脚踏开关来实现刺激(0.5升/分)的0.5秒粉扑进入连​​续加湿空气流。动作电位的记录将被同时启动时footswitch是郁闷。录制过程将持续10秒开始刺激前1秒。
  10. 计数动作电位离线两个500毫秒期间,一前一刺激后。减去500毫秒后的刺激来自于前500毫秒记录的自发活动期间在穗率的任何变化,并通过它们乘以2转换成计数尖峰/ s的常规规模。

4.更换刺激的SSR

  1. 在吸移管β蒎烯到臭虫触角并记录该特定加臭剂的响应10秒钟,然后将吸管除去 - 一旦脚踏开关被触发,提供10%的(+)。
  2. 标号另一个新的吸移管与0.001%桉叶油素进行测试。放置一小片滤纸到其上10微升的刺激得到了应用,到新的吸管。
  3. 等待2-5分钟,直到刺激是完全vapori捷思在玻璃吸管。连接吸管到脉冲流管的出口。
  4. 将移液管尖端到面向天线管的小孔。踩下脚踏开关,启动10秒的录音。
  5. 断开吸管,并准备另一吸管0.01%桉。
  6. 测试桉叶油素的剂量(0.001%至10%)的触角感受器的所有其余观察的剂量依赖性反应。从最测试稀释到最低稀释剂量。

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Representative Results

单感器录音昆虫化学生态学和神经生理学的研究使用了强大的侦查手段。调查昆虫不同的挥发性化合物,特别是那些想到的神经反应是生态环境关系到昆虫的生存和发展,不仅为我们提供了宝贵的见解昆虫嗅觉过程中,同时也开启了充满希望的新途径,它可能会导致到有用的新试剂的发展,防治病虫害。

常见的臭虫,作为臭名昭著的城市害虫,无疑吸引了众多研究者的注意。在与臭虫的各个研究领域,它们的嗅觉机制是对臭虫化学生态学至关重要。以前的研究已经明确描述的数量和不同类型的床上嗅觉感受器的分布错误的天线。 如图2A所示,臭虫天线具有四个段(SC,PE,F1和F2)。多数嗅觉感受器的呈现在第二鞭毛(F2)的后端,但它们的分布是对于每种类型的明显不同:对D感器,即Dα,Dβ和Dγ,只有沿的内侧位于触角图2C),而C和E(E1和E2)感器上找到天线图2B)的两侧。因此,为了确保我们记录对D感器的神经反应,仔细定位天线是必不可少的。

由于臭虫份额有性形式的感受器类型相同的模式和他们的触角内侧包含了所有类​​型的感器,针对这方面的使它更容易分别记录各种不同类型的感受器的化学反应在天线上E( 图3A)。在单感器录音,不同的嗅觉感受器表现出神经信号具有明显不同的动作电位种类和幅度( 图3B)。例如,E感器已知具有内的一个或两个神经元,而D型产品感器房子比E或Ç感器更多的神经,产生更复杂的动作电位比其他作为结果。从C感器的神经反应的振幅比其他感器类型的小得多。

一旦电极连接已经建立,从各类型感器的神经反应,以每个刺激可以基于他们的身份和强度进行记录。对于一些刺激到臭虫极为敏感,神经反应能超越刺激的终止非常强,最后几秒钟。例如,响应于10%(+) - β蒎烯,臭虫显示一个巨大的射速(≥200尖峰/秒),相比单独溶剂作为刺激( 图4A和B)控制超持续时间动态变化的强烈反应。不同的刺激可引发来自相同感器和不同浓度的相同的刺激的完全不同的神经反应可能产生相当不同的烧成频率。以剂量依赖性方式如图5,增加桉叶油素的浓度升高,从30尖峰/秒击发频率在0.001%至240尖峰/秒,在10%以上。

图1
图1示出的固定程序为臭虫的示意图。该臭虫稳定在与天线固定在磁带上的盖玻片。组装的样品,然后放置一磁阶段上。的样品c中的取向和高度一个被调整到臭虫天线和记录电极之间的合适的角度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.分配上的臭虫触角嗅感器。臭虫天线(A)扫描电极显微镜(SEM)图像。该天线具有四个段,所述Sculpus(SC),Pedecel(PE),所述第一鞭毛(F1)和所述第二鞭毛(F2)。大部分的嗅感器位于F2,尽管少数嗅感器也被发现在F1中,这被认为是相关的聚集信息素检测为臭虫16的它们的功能。 二)F2的外侧的SEM图像,里面的C和E olfac保守党感器。 ( 三)F2的内侧,该产品被发现家中所有不同类型的嗅觉感受器的SEM图像:D(Dα,Dβ,Dγ),C和E,请点击此处查看该图的放大版本。 。

图3
不同类型的臭虫触角嗅觉感受器的3. 典型的 神经信号,对臭虫的触角每种类型的嗅觉感受器的(A)高分辨率SEM照片。 (B)暴露于刺激前不同的嗅觉感受器的典型的神经信号。 Dα,Dβ,Dγ和C感器,其中容纳多个嗅感觉神经元(嗅觉神经元),表现出更复杂的动作电位比E1和E2感器,其中合作ntain只有一个或两个嗅觉神经元。从C感器动作电位的幅度较其他类型的感器要小得多。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. 代表神经响应于刺激该臭虫敏感。(A)中的信号迹线示出了嗅觉感器(Dγ)与溶剂,这是作为在单感器记录控制的典型神经反应。该信号线被设定刺激的0.5秒粉扑前开工1秒。该信号线继续发起的刺激粉扑后记录为10秒。 二)信号跟踪显示嗅觉的极强的神经反应感器(Dγ)向植物的刺激,10%(+) - β蒎烯。的(+),粉扑后β - 蒎烯递送至Dγ感器,嗅觉神经元容纳这感器内被激发高频和持久的时间动态。白条信号路径上述指示刺激曝光之前的1秒时间间隔,跟踪上述的红色条对应于递送的刺激​​粉扑到嗅觉感器,和黑条的跟踪上述指示终止后记录的信号刺激粉扑。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
嗅觉神经元的 5。代表性的 剂量依赖性反应的刺激。使用其他植物的刺激,桉树作为EXAmple,所述Dγ感器显示的剂量依赖性响应于不同浓度的桉树。随着浓度从0.001%提高到10%,发射频率从30穗/秒上升到240尖峰/秒。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

的单感器记录技术已被广泛使用在测试昆虫的神经反应,如果苍蝇,蚊子和臭虫到环境中的不同的化学刺激。这些化学刺激往往溶解并稀释在一个共同的溶剂中,以制备不同剂量的治疗。然而,不同的溶剂可以产生完全不同的释放速度的刺激。在一些广泛的研究昆虫,例如果蝇冈比亚按蚊致倦库蚊伊蚊已经过去的研究 通常使用石蜡油作为溶剂以溶解的刺激,因为这些昆虫是相对不敏感的石蜡油17-20。石蜡油也被用于在臭虫较早单感器记录研究中,出于同样的原因14。然而,最常用的溶剂可能不是最好的为每个昆虫物种。在CA臭虫,既石蜡油和DMSO中,向其中臭虫还表现出不敏感本身已被用来溶解在不同的研究14,15的刺激,但同样的剂量刺激在DMSO中稀释的出现上引起更强的神经反应臭虫的感受器。例如,DMSO溶解的R - (+) - 柠檬烯和S - ( - ) - 苎烯≥70尖峰/从臭虫触角Dγ感器秒产生神经反应,而石蜡油溶解柠檬烯引起的只有神经反应≤25尖峰/从Dγ感器秒。这种减少在神经反应是在已稀释用石蜡油,可能是由于石蜡油用DMSO相比较慢的释放速率刺激相当普遍。这个较慢的释放速率降低刺激递送到感器的表面上的量,并可能导致关于昆虫某些化学信息素的敏感性误导结论。

两个关键STEPS用于进行单感器记录是:1)样品制备和2)信号记录。对于样品制备,由于臭虫具有很强的腿和积极移动天线,这是非常重要的是要除去所有的腿和紧紧贴天线到双面胶带。在信号记录过程中,有时,它在位置上不可能用于电极点进感器轴上。如果是这样的情况下,电极可刺穿感器,它总是给出了一个非常干净和清楚的信号用很少的背景噪声的后端。

由于有收容在D和C型感器多个神经元,因此,通常很难利用SSR期间所产生的动作电位的振幅和形状的单个神经元之间进行区分。然而,它仍然是可能的,看看在臭虫的反应的基础上的所有神经元在同一个S合并的发射频率不同的刺激的差异ensillum。理论上,臭虫与强刺激而不受其它刺激与弱刺激在相同剂量下对某些刺激敏感。因此,进一步的研究整合行为测试,他们对这些刺激的神经反应的信息将提供关于生态相关的化学信息素的臭虫有意义的信息。

在这项研究中,我们也采用了SSR技术测试嗅觉感受器的神经反应,以不同剂量的刺激。我们观察到在臭虫的神经反应的剂量依赖性模式不同的化学物质。但是,考虑到环境复杂臭虫住,臭虫在其正常的环境中所遇到的挥发物的实际剂量将是非常低的。其结果是,该引出在低剂量强神经反应向下至1:10 5体积/体积和1:10 4体积/体积更可能是生物学上有意义的臭虫比其它化学品吨的信息化学物质帽子的功能仅在高剂量。因此,那些在低剂量时充当化学信息素很可能在臭虫的化学感受发挥重要的作用,帮助他们找到一个主机或避免不良因素的影响,并因此在有希望的臭虫引诱剂或驱虫剂的使用提供了在筛选有用的指导实验室和现场试验。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire A-M SYSTEMS #716500 Used for preparing the electrode
KNO2 Sigma #310484 Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply BK Precision 1653A Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Leica Z6 APO Microscope Leica 10447424 Used for observing the sensilla on antennae
Simulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
4-Channel USB Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Light Source SCHOTT A20500 Providing light sources for observation
Micromanupulator Leica 115378 Used for minor movement of electrode
Speaker Juster 95a Connected with Acquisition Controller IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic stand Narishige GJ-1 Used to hold the reference electrode, stablized bed bug and stimulus delivery tube
TMC Vibration Isolation Table TMC 63-500 Used for isolating the vibration from the equipments
Coverslip Tedpella 2225-1 Used for holding the bed bug
Double-sided Tape 3M XT6110 Used for stablizing the bed bug on the coverclip
Dental Wax Dentakit DK-R012 Used for supporting the coverclip where bed bug is stablized 

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References

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