मानव परिधीय रक्त से जनरेशन और संस्कृति रक्त का परिणाम endothelial कोशिकाओं

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Ormiston, M. L., Toshner, M. R., Kiskin, F. N., Huang, C. J., Groves, E., Morrell, N. W., Rana, A. A. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (106), e53384, doi:10.3791/53384 (2015).

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Abstract

Introduction

अभी हाल तक, नए रक्त वाहिकाओं के प्रसवोत्तर पीढ़ी पूर्व मौजूदा वाहिकाओं के endothelial कोशिकाओं से नए जहाजों की अंकुरण के रूप में परिभाषित angiogenesis के रूप में जाना एक प्रक्रिया है, के माध्यम से विशेष रूप से घटित करने के लिए माना जाता था। 1 यह प्रक्रिया vasculogenesis से विरोधाभासों, या भ्रूण के दौरान विशेष रूप से घटित करने के बारे में सोचा गया था, जो endothelial पूर्वज से रक्त वाहिकाओं के नए सिरे से गठन। 2 हालांकि, हाल ही के अध्ययन की पहचान की और वयस्कों के परिधीय रक्त में endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) घूम अलग है। इन कोशिकाओं को संस्कृति में परिपक्व endothelial कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के अधिकारी और प्रसव के बाद vasculogenesis में भाग लेने के लिए माना जाता है। 3,4

अलगाव और इन निर्यात संवर्धन परिषदों के विस्तार के लिए प्रोटोकॉल आम तौर पर Vascul सहित endothelial वृद्धि कारकों युक्त मीडिया में परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) की संस्कृति को शामिलएआर endothelial वृद्धि कारक (VEGF) और fibroblast वृद्धि कारक-2। 5-8 ईपीसी संस्कृतियों नाटकीय रूप से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म का उत्पादन। प्रारंभिक संस्कृतियों (<7 दिन) "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों के रूप में साहित्य में जाना जाता है एक monocytic सेल प्रकार, का प्रभुत्व है। उनके नाम के बावजूद, इन कोशिकाओं एककेंद्रकश्वेतकोशिका मार्कर CD14 व्यक्त करते हैं, पूर्वज मार्कर CD34 के लिए नकारात्मक हैं और शास्त्रीय एन्दोथेलिअल मार्कर CD31 और वीईजीएफ़ रिसेप्टर 2 (VEGFR2) के न्यूनतम स्तर को व्यक्त करते हैं। 5 लगातर संस्कृति कोशिकाओं के एक माध्यमिक आबादी को जन्म देता है, endothelial कोशिकाओं की तरह के रूप में विचारशील कालोनियों दिखाई देते हैं, जो देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों या रक्त परिणाम endothelial कोशिकाओं (BOECs) के रूप में जाना जाता है। Monocytic जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों के विपरीत, यह भी endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs), परिणाम endothelial कोशिकाओं या देर परिणाम endothelial कोशिकाओं बुलाया गया है जो BOECs, endothelial सेल monolayers की खासियत है कि पत्थर आकृति विज्ञान प्रदर्शन और सतह मार्कर काफी हद तक समान5 और जीन अभिव्यक्ति 9 endothelial कोशिकाओं परिपक्व करने के लिए।

परिधीय रक्त से endothelial कोशिकाओं की तरह की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से इस तरह के फेफड़े के धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) 10 या वॉन Willebrand रोग। 11 प्रायर BOECs की उपलब्धता के लिए, एन्दोथेलिअल के रूप में संवहनी विकारों के साथ जुड़े endothelial सेल में शिथिलता के अध्ययन के लिए, कई लाभ प्रदान करता है कोशिकाओं केवल जन्म के समय गर्भनाल नस से मृत्यु या अंग प्रत्यारोपण, या अलग-थलग करने के समय में explanted अंगों से प्राप्त किया जा सकता है। यह कम उपलब्धता हृदय रोगों, साथ ही endothelial कोशिकाओं और या तो रक्त कोशिकाओं या भित्ति कोशिकाओं के बीच बातचीत के साथ रोगियों से endothelial कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने के लिए एक गंभीर सीमा का प्रतिनिधित्व किया। इसके अलावा, अलग-थलग करने और इन स्रोतों से endothelial कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी संवर्धन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और इन तरीकों से ली गई कोशिकाओं केवल एक limite का प्रदर्शनडी proliferative क्षमता। BOECs इसलिए रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मूल्यवान किराए की पेशकश करते हैं।

उनकी इन विट्रो अनुप्रयोगों के अलावा, BOECs भी ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा में संभावित रूप से उपयोगी हैं। ये आवेदन पत्र 13 BOEC व्युत्पन्न IPSCs रोग मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता neovascularization (उसमें 12 और संदर्भ देखें) को बढ़ावा देने के लिए दोनों endothelial सेल प्रत्यारोपण, साथ ही प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी (IPSCs)। में शामिल हैं और शुरू करने के रूप अपार क्षमता की पेशकश ऑटोलॉगस सेल उपचार के लिए सामग्री। BOECs तेजी से और त्वचा fibroblasts की तुलना में उच्च दक्षता के साथ reprogram। इसके अलावा, BOECs भी अनुवादकीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो जाएगा कि किसी भी तकनीक का एक अनिवार्य विशेषता है जो karyotypic असामान्यताओं, के लिए स्वतंत्र हैं कि IPSCs की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। एक मरीज को खून का नमूना एक से IPSCs उत्पन्न करने की क्षमताLSO जिससे घाव भरने के विकारों, या बहुत युवा के साथ रोगियों से कोशिकाओं की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए एक त्वचा बायोप्सी के लिए की जरूरत है और त्वचा fibroblasts की पीढ़ी, समाप्त।

नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल, ने मंजूरी दे दी है और राष्ट्रीय अनुसंधान आचार सेवा समिति (इंग्लैंड के पूर्व) के दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा से 90% से अधिक कुशलता के साथ BOECs की पीढ़ी के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि (60 प्रदान करता है एमएल) परिधीय रक्त की। इन कोशिकाओं को अत्यधिक proliferative हैं और एक भी रक्त के नमूने से कोशिकाओं के लाखों लोगों के सैकड़ों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, बार-बार passaged जा सकता है।

Protocol

BOEC पीढ़ी प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. रक्त संग्रह और घनत्व ढाल centrifugation

  1. प्रत्येक दाता के लिए, दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब से प्रत्येक के लिए सोडियम साइट्रेट के 3 मिलीलीटर जोड़ें। Venipuncture से रक्त का 60 मिलीलीटर लीजिए और प्रत्येक ट्यूब करने के लिए 30 मिलीलीटर जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे 2-3 बार पलटना। तदनुसार समायोजित साइट्रेट संस्करणों के साथ, प्रोटोकॉल में रक्त के रूप में छोटा रूप में 40 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
    नोट: यह रक्त के नमूने संग्रह के 2 घंटे के भीतर कार्रवाई कर रहे हैं कि आवश्यक है। परिणाम कॉलोनी उपज में एक उल्लेखनीय कमी में रक्त परिणामों की प्रोसेसिंग में देरी की।
  2. पहली बोतल मिश्रण करने के लिए कई बार inverting द्वारा घनत्व ढाल centrifugation मध्यम युक्त नया शंक्वाकार ट्यूबों तैयार। एक बाँझ हुड में, 50 मिलीलीटर प्रति शंक्वाकार ट्यूब (रक्त की हर 10 मिलीलीटर, दाता प्रति 6 ट्यूब के लिए एक ट्यूब) घनत्व ढाल centrifugation माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. Dulbecco फास्फेट के साथ 1: रक्त एक पतला-Buffered खारा (DPBS)। काम की सतह के साथ 20 डिग्री के कोण करने के लिए घनत्व ढाल centrifugation मध्यम युक्त ट्यूब झुकाएँ। एक विंदुक सहायता और एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक का प्रयोग, धीरे धीरे धीरे धीरे झुका ट्यूब की दीवार के नीचे खून जोड़कर मध्यम के शीर्ष पर पतला खून की 21 मिलीलीटर की परत।
    नोट: ऐसा करने से घनत्व ढाल परत के साथ रक्त के मिश्रण को कम कर देंगे और एक तंग बफी कोट, साथ ही एक बढ़ाया उपज का उत्पादन होगा।
  4. 35 त्वरक के साथ आरटी पर मिनट और ब्रेक बंद के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं।
  5. 2.4 - इस centrifugation अवधि के दौरान, कदम 2.1 में विस्तृत कोलेजन कोटिंग शुरू करते हैं। इन चरणों 3.1 कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले पूरा किया गया है सुनिश्चित करें।

टी -75 फ्लास्क और संस्कृति के माध्यम से तैयारी की 2. कोलेजन कोटिंग

नोट: एक सेल संस्कृति हुड में निम्न चरणों के बाहर ले।

  1. शेयर अस्थाई गिराए द्वारा एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन समाधान तैयार। मैं 0.02M एसिटिक एसिड उदाहरण के 10 मिलीलीटर में कोलेजन पीई: कोलेजन शेयर के लिए 4.05 मिलीग्राम की एकाग्रता में / एमएल, 0.02 एम एसिटिक एसिड के 10 मिलीलीटर कोलेजन के 123.5 μL जोड़ें। बाँझ फिल्टर कोलेजन निलंबन का उपयोग करने से पहले।
  2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, एक टी -75 सेल संस्कृति फ्लास्क कोलेजन समाधान के 7.5 मिलीलीटर जोड़ें। यह मात्रा 5 ग्राम कोलेजन / 2 सेमी (या 375 माइक्रोग्राम / कुप्पी) देता है। आरटी पर 1 घंटे के लिए कोट कुप्पी।
  3. निर्माता द्वारा प्रदान की वृद्धि कारक की खुराक के साथ endothelial बेसल मध्यम सप्लीमेंट द्वारा BOEC पीढ़ी के लिए इस्तेमाल endothelial वृद्धि के माध्यम से तैयार। सभी की खुराक जोड़ें, लेकिन सीरम जोड़ नहीं है। , BOEC पीढ़ी माध्यम के 15 मिलीलीटर की तैयारी वृद्धि कारक की खुराक युक्त एन्दोथेलिअल मध्यम विकास के 12.5 मिलीलीटर परिभाषित भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
  4. 1 घंटे कोटिंग अवधि के बाद धारा 3 में उल्लिखित चरणों के साथ आगे बढ़ें कोलेजन समाधान महाप्राण और pipetting द्वारा अवशिष्ट एसिटिक एसिड दूर धोने10 मिलीलीटर DPBS में। DPBS बंद महाप्राण और एक बार फिर इस धोने कदम दोहराएँ। 3.3 कदम के दौरान प्राप्त सेल निलंबन इस समय चढ़ाना के लिए तैयार नहीं है, तो सुखाने-बाहर से कोलेजन कोटिंग रखने के लिए फ्लास्क BOEC पीढ़ी माध्यम की 5mL जोड़ें।

3. संग्रह और PBMNCs की चढ़ाना

  1. 1.4 चरण में उल्लिखित घनत्व ढाल centrifugation के बाद, ध्यान से एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग बफी कोट परत लीजिए। बफी कोट का संग्रह प्रत्येक ट्यूब से सेल निलंबन और प्लाज्मा के लगभग 20 मिलीलीटर उपज चाहिए। घनत्व ढाल मध्यम स्थानांतरित करने से बचें।
  2. मोनोन्यूक्लियर सेल निलंबन एक पतला DPBS में एक और मिश्रण को पलटना। अधिकतम पर ब्रेक और एक्सीलेटर के साथ 300 XG पर 20 मिनट के लिए आरटी पर अपकेंद्रित्र।
  3. Centrifugation के बाद, नीचे बार-बार प्रत्येक गोली BOEC पीढ़ी के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने और Pipetting और सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं महाप्राण। पूल सेल एक निलंबनशेष मध्यम के साथ 10 मिलीलीटर डी शीर्ष तक कुल मात्रा।
  4. कुल सेल नंबर, नमूना सेल निलंबन के 10 μl के एक अनुमान पाने के लिए और लाल रक्त कोशिकाओं lyse जाएगा जो तुर्क के समाधान के 490 μl, साथ 50x पतला करने के लिए। एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कर पतला सेल निलंबन की एक 10 μl नमूना गणना।
    नोट: खून की 60ml चढ़ाना के लिए लगभग 100-150 एक्स 10 6 सफेद रक्त कोशिकाओं उपज चाहिए।
  5. एक एकल, कोलेजन लेपित टी -75 फ्लास्क में प्लेट पूरे सेल निलंबन, 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15ml / फ्लास्क और संस्कृति के लिए शीर्ष तक मध्यम मात्रा। इस समय चढ़ाया कोशिकाओं बीतने के 0 प्रतिनिधित्व करते हैं।
    नोट: यह एक बाद में समय पर या BOECs उत्पन्न किया जा सकता है, जहां एक अलग प्रयोगशाला में PBMNCs परिवहन करने के क्रम में BOECs प्राप्त करने के लिए आदेश में पूर्व BOEC अलगाव को पृथक PBMNCs फ्रीज करने के लिए संभव है। हालांकि, यह ठंड PBMNCs BOEC अलगाव की क्षमता को कम कर सकता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। एसविधि के लिए नीचे दिए गए ई धारा 8।

4. लंबे समय तक सेल संस्कृति

  1. ताजा BOEC पीढ़ी माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़कर मध्यम हर 2 दिन बदलें (5: endothelial सेल के विकास के माध्यम से 1 मिश्रण और FBS परिभाषित)। सप्ताहांत के लिए, मध्यम परिवर्तन हर 3 दिन के लिए देरी हो सकती है।
    नोट: परिणाम कालोनियों संस्कृति के 7 और 14 दिनों के बीच दिखाई देनी चाहिए।
  2. परिणाम कालोनियों की उपस्थिति के लिए दिनों 7-14 पर BOEC संस्कृति कुप्पी की निगरानी करें। एक क्लासिक एन्दोथेलिअल पत्थर आकृति विज्ञान का प्रदर्शन कोशिकाओं के परिपत्र समूहों के रूप में कालोनियों को पहचानें।
  3. एक कॉलोनी या एकाधिक कालोनियों फ्लास्क में पहचान हो जाने के बाद, मध्यम परिवर्तन के साथ जारी रखने के लिए और कालोनियों passaging पहले कॉलोनी के अनुसार लगभग 1000 2000 के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। किसी न किसी दृश्य अनुमान के माध्यम से कॉलोनी प्रति सेल संख्या निर्धारित है।
    नोट: एक गाइड के रूप में, यह एक सप्ताह पहले परिणाम कॉलोनी की पहचान के बाद पारित होने के प्रारंभिक परिणाम कालोनियों के लिए प्रथागत है।
  4. <ली> DPBS के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार बोतल rinsing द्वारा पारित होने कोशिकाओं। 1X ट्रिप्सिन- EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। 5 मिनट के बाद, मध्यम (FBS युक्त) के 10 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर और दोहराया pipetting के साथ निलंबन में कोशिकाओं को लाने के लिए।
  5. 5 मिनट के लिए 300 XG, ताजा BOEC पीढ़ी माध्यम के 15 मिलीलीटर में resuspend और एक नया टी -75 कुप्पी (का प्रतिनिधित्व मार्ग 1, पी 1) में पूरे सेल निलंबन प्लेट पर अपकेंद्रित्र निलंबन। कोई कोलेजन कोटिंग की आवश्यकता है।
  6. कोशिकाओं मिला हुआ (कुप्पी मोटे तौर पर प्रति 3-5 x 10 6 कोशिकाओं) कर रहे हैं जब तक ऊपर वर्णित के रूप में मध्यम परिवर्तन जारी रखें। मिला हुआ है एक बार, पारित होने कोशिकाओं 4.3 चरण में वर्णित है।
    नोट: के बाद पारित होने के 2 से, कोशिकाओं नहीं रह BOEC पीढ़ी मध्यम आवश्यकता होती है और endothelial सेल मध्यम विकास और 10% मानक गर्मी निष्क्रिय FBS में संवर्धित किया जा सकता है। कोलेजन की उपस्थिति BOEC prolifer वृद्धि कर सकते हैं सुझाव है कि सबूत नहीं है के रूप में कोलेजन कोटिंग, एक वैकल्पिक कदम आगे जा रहा है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताव्यावहारिक दरों।
  7. निरंतर passaging, प्लेट टी -75 फ्लास्क प्रति कोई कम 750,000 से कोशिकाओं के लिए के रूप में कम सेल घनत्व BOECs proliferating को रोकने के लिए पैदा कर सकता है।

5. ठंड और विगलन BOEC संस्कृति

  1. 5 मिनट के लिए 300 XG पर धारा 4.3 और सेंट्रीफ्यूज के रूप में वर्णित कोशिकाओं Trypsinize। माध्यम के 10 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend Aspirate। इस endothelial सेल मध्यम विकास की आवश्यकता नहीं है; 10% मानक FBS के साथ DMEM के लिए पर्याप्त होगा। एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कर एक मैनुअल कोशिका गिनती प्रदर्शन करने के लिए सेल निलंबन की एक 10 μl नमूना ले लीजिए।
  2. ठंडा cryopreservation के मध्यम (50% FBS और 10% DMSO के साथ 40% DMEM) में 2x10 6 कोशिकाओं / एमएल पर फिर से अपकेंद्रित्र और resuspend। में एक बर्फ के ठंडे isopropanol cryopreservation पोत और जगह में 0.5 मिलीलीटर (10 6 कोशिकाओं) प्रत्येक शीशी, जगह शीशियों जोड़े -80 में कम से कम 2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस फ्रीजर तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरित करने से पहले। अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को मत छोड़ो। , कोशिकाओं पिघलना एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पूर्व गर्म माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
    नोट: मार्ग 1 कोशिकाओं को बाहर विगलन, जब विगलन के बाद पहले दो दिनों के लिए एफबीएस परिभाषित 20% के साथ पूरक endothelial सेल मध्यम विकास में पिघलना। यह एक अधिक स्थिर सेल अलगाव आगे जा रहा है की ओर जाता है।
  3. केवल एक छोटा सा बर्फ क्रिस्टल शीशी में छोड़ दिया जाता है जब तक कोमल आंदोलन के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तरल नाइट्रोजन और पिघलना से कोशिकाओं को निकाल दें। शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब शीशी बूंद-वार की सामग्री जोड़ें और 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन।
  4. 10 मिलीलीटर ईजीएम 2mV + 10% FBS में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली। 15 मिलीलीटर टी -75 फ्लास्क और ऊपर मध्यम में जोड़े।

फ्लो द्वारा BOECs 6. विशेषता

  1. धुंधला बफर में मिलीलीटर प्रति 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में धारा 4.4 और resuspend के रूप में वर्णित धारा 4 में वर्णित BOEC कालोनियों Trypsinize कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए अनुमति दी गई है एक बार (DPBS बुद्धिएच 2% FBS और 2 मिमी EDTA)।
  2. CD45, CD14, CD34, CD31 (प्रयोग 1:20 कमजोर पड़ने पर सभी) या VEGFR2 (पतला 1:10) के खिलाफ निर्देशित fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी (पूरी जानकारी के लिए देखें तालिका 1) के साथ 10 5 कोशिकाओं का मिश्रण। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 1 मिलीलीटर 5 मिनट के लिए 300 XG पर बफर और सेंट्रीफ्यूज धुंधला के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और विश्लेषण के लिए 400 μl धुंधला बफर में resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखें और हल्के से विश्लेषण करने से पहले रक्षा की।
  4. परख में इस्तेमाल fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सुसज्जित एक कोशिकामापी पर cytometric विश्लेषण करते हैं।
  5. आगे का समायोजन और पक्ष तितर बितर voltages, साथ ही FITC और एपीसी चैनलों के लिए voltages द्वारा कोशिकामापी पर सेल की आबादी की पहचान करने के लिए एक बेदाग BOEC नमूना का प्रयोग करें।
  6. प्रत्येक fluorochrome के लिए निर्धारण दाग कोशिकाओं का उपयोग कर थ्रेसहोल्ड gating का निर्धारण करते हैं। Presenc के आधार पर प्रत्येक कोशिका की सतह मार्कर के लिए सकारात्मकता का आकलनfluorochrome के लिए निर्धारण नियंत्रण बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक चोटी पारी की ई का विश्लेषण किया जा रहा है।

Immunofluorescent माइक्रोस्कोपी द्वारा BOECs 7. विशेषता

  1. Endothelial सेल मध्यम विकास के 500 μl में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व पर coverslips के बिना एक 24 अच्छी तरह से, फ्लैट नीचे टिशू कल्चर प्लेट में प्लेट BOECs 10% गर्मी निष्क्रिय अच्छी तरह से प्रति FBS और पालन करना और 37 से बढ़ने के लिए छोड़ दें डिग्री सेल्सियस, कोशिकाओं तक 5% सीओ 2 में कम से कम 70-80 प्रत्येक की सतह क्षेत्र के% अच्छी तरह से (एक प्रकाश microsope तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा अनुमान confluency) को कवर किया।
  2. DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में कोशिकाओं को धो लें।
  3. DPBS में 4% paraformaldehyde समाधान के 500 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन ठीक करें।
  4. अच्छी तरह से प्रति DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ 3 एक्स 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें। जोड़ें और क्रमश: एक पिपेट और एक Aspirator का उपयोग कर DPBS हटा दें।
  5. DPBS में 0.2% Polysorbate 20 के साथ 3 एक्स 10 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize। DPBS में 10% FBS युक्त बफर अवरुद्ध में आरटी पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सीओ पर दाग कोशिकाओं एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर CD34 (10 माइक्रोग्राम / एमएल), CD144 के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त (DPBS में 0.1% गोजातीय सीरम albumin) के 300 μl में / एन (1: 300) या vWF (1: 250) । पूरी जानकारी के लिए 1 टेबल देखें।
  7. DPBS के साथ 5 एक्स 10 मिनट के लिए अपार प्राथमिक एंटीबॉडी से धो लें।
  8. (: 200 1 सभी) तालिका 1 में विस्तृत रूप में उचित fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. DPBS के साथ 5 एक्स 10 मिनट के लिए अपार माध्यमिक एंटीबॉडी से धो लें।
  10. आरटी पर 10 मिनट के लिए DPBS में / एमएल 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 1 ग्राम (DAPI) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  11. एक और 3 एक्स 5 मिनट के लिए DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  12. एक देते हैं का उपयोग कर प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए एक बाहरी प्रकाश स्रोत के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग 100x बढ़ाई छवि कोशिकाओं, और छवियों पर कब्जाबाद के विश्लेषण के लिए ऑफ़लाइन एड डिजिटल कैमरा।

8. ठंड और विगलन PBMNCs

  1. Centrifugation के बाद मंच 3.2 के अंत में, मध्यम महाप्राण और मैन्युअल दोहराया pipetting के साथ और एक P1000 विंदुक टिप का उपयोग कर नीचे सेल गोली बाधित। एक सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए धीरे मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित कर रही है, ठंड मध्यम, 90% सीरम और 10% DMSO के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक cryovial सेल निलंबन स्थानांतरण और फ्रीज और धारा 5 में वर्णित के रूप में पिघलना।

Representative Results

रक्त का 60 मिलीलीटर से बफी कोट मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव आम तौर पर 100-150x10 6 कुल श्वेत रक्त कोशिकाओं अर्जित करता है। एक भी टी -75 फ्लास्क में चढ़ाया, जब unlysed सेल निलंबन में कोशिकाओं की बड़ी संख्या में यह मुश्किल brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर व्यक्ति पक्षपाती कोशिकाओं को हल करने के लिए बनाता है। बार-बार मध्यम परिवर्तन गैर पक्षपाती कोशिकाओं की निकासी में परिणाम और "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों monocytic के पक्षपाती आबादी के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। दिन 7 में टी -75 लगभग 7x10 6 इन लम्बी पक्षपाती कोशिकाओं के शामिल होंगे। 7 से 14 दिन से, BOECs की कालोनियों कुप्पी (2A चित्रा) के भीतर दिखाई देनी चाहिए। कालोनियों के रूप में पहली 3-5 सन्निकट कक्षों दिखाई देते हैं। परिणाम कॉलोनी नंबर रक्त का 60 मिलीलीटर प्रति 1 से 10 कालोनियों से भिन्न हो सकते हैं। आम तौर पर, युवा दाताओं (यानी, 20-25 साल) पहले भी संस्कृति में दिखाई देते हैं जो परिणाम कालोनियों की एक बड़ी संख्या का उत्पादन करते हैं।BOECs कई सौ कोशिकाओं से मिलकर परिपत्र कालोनियों के रूप में कोशिकाओं के इस केंद्रीय समूह से पैदा करना। इन कालोनियों के भीतर कोशिकाओं एक क्लासिक एन्दोथेलिअल cobblestone आकारिकी दिखा रहे हैं।

वे कालोनी के अनुसार लगभग 1000 कोशिकाओं होते हैं जब यह पारित होने के प्रारंभिक कालोनियों के लिए बेहतर है। परिणाम कालोनियों आम तौर पर 7 दिन संस्कृति में अपने मूल स्वरूप के बाद इस आकार तक पहुँचने। मूल कालोनियों एक नया टी -75 फ्लास्क में passaged रहे हैं, वे 5 दिन या उससे कम समय (चित्रा 2 बी) के भीतर एक मिला हुआ monolayer (फ्लास्क प्रति 3-5x10 6 कोशिकाओं) के रूप में पैदा करना चाहिए। विलगन का एक छोटा सा प्रतिशत में (<10%), परिणाम कालोनियों प्रकट करने के लिए असफल हो, या इस प्रारंभिक passaging के कदम के बाद पर्याप्त पैदा करना नहीं है। अपनी पहली passaging के बाद कम प्रसार कि प्रदर्शन BOECs शायद ही कभी स्थिर BOEC विलगन हो जाते हैं और अक्सर 2-3 मार्ग भीतर proliferating को रोकने के लिए चले जाते हैं। monocyticBOEC संस्कृतियों के भीतर निहित जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों गैर proliferative हैं और आम तौर पर 1-2 मार्ग भीतर संस्कृतियों से मंजूरी दे दी है। इन प्रारंभिक कोशिकाओं की क्लीयरेंस सेल मौत की वजह से है, जल्दी कोशिकाओं की विफलता passaging और दोहराया passaging के साथ गैर proliferative जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों के कमजोर पड़ने के बाद फिर से पालन करने के लिए।

मार्ग 1 कोशिकाओं या तो संस्कृति में आगे passaged या बाद में उपयोग के लिए नीचे जमे हुए किया जा सकता है। एक स्थिर अलगाव उत्पन्न हो जाने के बाद, कोशिकाओं को मौन बनने से पहले पारित होने के 8 या 9 तक 3-5 नए टी 75 बोतल के लिए एक मिला हुआ कुप्पी की दर से passaged जा सकता है। फिर, सेल घनत्व संस्कृति भर में महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, कोई कम 750,000 से कोशिकाओं के विकास गिरफ्तारी पैदा कर सकता है कम सेल घनत्व के रूप में, एक टी -75 फ्लास्क में चढ़ाया जाना चाहिए। BOECs के उच्च proliferative क्षमता के बावजूद, कोशिकाओं को भी overconfluent बनने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए (यानी।,> फ्लास्क प्रति 5x10 6 कोशिकाओं) इस convers पैदा कर सकता है के रूप में एक गैर proliferative phenotype के लिए BOECs के आयन।

हम एक BOEC एन्दोथेलिअल मार्करों के लिए उचित कोशिका की सतह और intracellular धुंधला प्रदर्शित करना चाहिए के रूप में किसी भी सेल चिह्नित किया जा रहा है कि प्रस्ताव। BOECs की विशेषता ठेठ endothelial सेल मार्करों के लिए धुंधला निम्नलिखित, फ्लो (चित्रा 3) या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। BOECs endothelial सतह मार्कर CD31 और VEGFR2 के लिए सकारात्मक रहे हैं और एककेंद्रकश्वेतकोशिका मार्कर CD14 और अखिल ल्युकोसैट मार्कर CD45 के लिए नकारात्मक हैं। BOECs भी WEIBEL-Palade शव उठा रहे हैं और इस प्रकार असतत, कबरा साइटोप्लास्मिक धुंधला के रूप में वॉन Willebrand फैक्टर (vWF) व्यक्त करते हैं। ऐसे फेफड़े के धमनी या महाधमनी endothelial कोशिकाओं के रूप में अन्य परिपक्व endothelial सेल प्रकार के विपरीत, BOECs भी उनकी सतह पर पूर्वज और सक्रियण मार्कर CD34 व्यक्त करते हैं।

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एन्दोथेलिअल मध्यम विकास में कोलेजन लेपित प्लेटों पर चित्रा 1. BOEC पीढ़ी प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear घनत्व ढाल centrifugation द्वारा शिरापरक रक्त से अलग कर रहे हैं और सुसंस्कृत एफबीएस परिभाषित हैं। BOEC कालोनियों संस्कृति के 7-14 दिनों के भीतर दिखाई देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा प्रतिनिधि BOEC संस्कृतियों का 2. brightfield छवियों। (ए) परिणाम कालोनियों एक पत्थर monolayer में व्यवस्था की है और एक केंद्रीय बिंदु से त्रिज्यात बाहर पैदा करना जो कर रहे हैं endothelial कोशिकाओं की तरह, के संग्रह के रूप में उपस्थित दिन 7 और 14 कालोनियों के बीच संस्कृतियों में दिखाई देते हैं। आसपास के परिणाम कालोनियों पक्षपाती मोनो हैंजल्दी संस्कृतियों में कोशिकाओं के विशाल बहुमत को बनाने वाली cytic कोशिकाओं। पहले के रूप में वर्णित इन कोशिकाओं, "जल्दी" endothelial पूर्वज कोशिकाओं, एक धुरी की तरह आकारिकी है और monocytic मार्कर CD14 व्यक्त करते हैं। गैर proliferative monocytic कोशिकाओं से मरने या passaging के बाद फिर से संलग्न करने के लिए असफल रूप में या तो (बी) passaging के बाद, अत्यधिक proliferative BOECs, संस्कृतियों भर में ले। स्केल बार 250μm। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा फ्लो द्वारा BOECs 3. विशेषता। BOECs trypsinized और विशिष्ट सतह मार्कर (लाल रेखा) के खिलाफ निर्देशित fluorescently संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (भरा शिखर ग्रे) या एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। Cytometric लक्षण वर्णन के लिए सतह मार्करhematopoietic मार्कर CD45 और CD14, endothelial मार्कर CD31 और VEGFR2 और progentior और endothelial सक्रियण मार्कर CD34 शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Endothelial सेल मार्करों के लिए BOECs चित्रा 4 Immunofluorescent धुंधला। BOECs के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों endothelial सेल सतह मार्कर CD144 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ (-cadherin किया है, शीर्ष सही पैनल) और रक्त ग्लाइकोप्रोटीन वॉन Willebrand फैक्टर (vWF, नीचे सही पैनल) immunostained । परमाणु DAPI धुंधला दिखा इसी पैनल के बाईं ओर दिखाए जाते हैं। स्केल बार 50μm। CD144 के लिए। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For blood collection
60 ml syringe with luer-lok tip BD 309653
19G Surflo Winged Infusion Set Terumo SV-19BL
50 ml conical centrifuge tube StarLab E1450 2 per donor
Sodium Citrate Martindale Pharmaceuticals 270541
Name Company Catalog Number Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) Sigma-Aldrich D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes Appleton Woods KC231
Turk’s Solution Millipore 1.093E+09
Name Company Catalog Number Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail) BD Biosciences 35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) Sigma-Aldrich D8537
0.02M Acetic Acid  Sigma-Aldrich A6283 prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV
(containing Bullet Kit, but not serum)
Lonza CC-3202 Note: It is essential that the medium does not contain heparin.  
Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined Hyclone SH30070
10x Trypsin EDTA Gibco T4174 Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS Gibco 10500-064
DMEM Gibco 41965-039
DMSO Sigma-Aldrich 276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container Sigma-Aldrich C1562
Name Company Catalog Number Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14 BD Biosciences 555397 Mouse IgG1k, Clone: WM59
Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31 BD Biosciences 555445 Mouse IgG1k, Clone: WM59
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34 BD Biosciences 555824 Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34
Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45 BD Biosciences 560976 Mouse IgG1k, Clone: HI30
Dilution: 1:20
 APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 R&D Systems FAB357A Mouse IgG1, Clone: 89106
Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control BD Biosciences 555748 Clone: MOPC-21
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control BD Biosciences 555751 Clone: MOPC-21
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control R&D Systems IC002A
Dilution: 1:10
Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution Sigma-Aldrich E7889
Name Company Catalog Number Comments
For immunofluorescent microscopy 
Corning Costar 24-well tissue culture plate Sigma-Aldrich CLS3527
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
BSA Sigma-Aldrich A7906
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody R&D Systems MAB72271 Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) R&D Systems AF938 Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) Abcam ab154193 Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-21202 Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11055 Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Life Technologies A-10042 Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542 use at 1 μg/ml

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References

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