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식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

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Jenkin, S., Molina, I. Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers. J. Vis. Exp. (105), e53386, doi:10.3791/53386 (2015).

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Abstract

Introduction

혈관 식물은 식물 조직과 외부 환경 사이의 방수 장벽으로서 기능 외 층에 의존한다. 이러한 친 유성 세포벽 - 관련 구조는 병원성 감염을 제한 및 식물 조직에서 1 가스, 물 및 용해 된 물질의 수동적 운송을 조절한다. 이러한 장벽은 표피 식물, 식물 (2) 및 다른 suberin 함유 확산 장벽 synapomorphic 독특한 구조이다. 표피는 세포벽 3-5의 외 측면에 pectinaceous 층을 통해 표피 세포에 의해 합성되고 바인드 친 유성 층이다. 이것은 식물 조직과 환경 사이의 인터페이스로서 기능하는 필수적인, 고등 식물의 주요 공중 장기를 둘러싼 다.

각질, 표피의 구조 매트릭스 및 suberin은 용매 추출 왁스 2,4과 관련이 불용성 glycerolipid 폴리 에스테르이다. 이러한 고분자 Lipids 포화 및 불포화 지방산 유도체로 이루어지는 두 구조적 및 기능적으로 유사하다된다. 그러나, 그들은 화학 조성 및 증착 사이트의 특성의 차이에 의해 구별된다.

Suberin는 보조 벽을 형성하는 소정의 외부 및 내부 조직의 셀 벽 내부에있는 지방족 폴리 에스테르이다. Suberized 조직은 뿌리의 periderms, 덩이 줄기와 나무 껍질, 뿌리 endodermis, 씨앗 ​​코트 층, 치유 상처 (2)를 포함한다. 각질 달리 suberin 폴리 에스테르는 전형적으로 알콜, 포화 모노 - 불포화 된 디카 르 복실 산, 매우 장쇄 단량체의 큰 비율 (C≥20)을 포함한다.

각질 혈관 식물 6에서 가장 풍부한 지질 폴리 에스테르, 글리세린과 하이드 록시 및 하이드 록시 - 치환 된 에폭시 지방산 AS 4 C16-C18 interesterified 지방산 유도체, 구성된다. 각질 중합체 조성물 동안0, 18- 히드 록시 -9,10- 에폭시 18 : 0, 18 9,10,18 트리 히드 록시 : 0 지방산 tracheophyte 종에 걸쳐 변화가 가장 우세한 단량체는 주 16 16 히드 록시, (10)이다. 2 디카 르 복실 산 7,8 : 흥미롭게도, 애기 잎과 각질 줄기는 주로 (18)로 구성되어있다.

식물 표피는 수 마이크로 미터 (9)에 수 나노 미터에 이르기까지, 두께에 상당한 변화를 제시한다. 표피 분리는 특히 애기 장대 (8)의 것과 매우 얇은 잎 큐티클위한 수고와 시간이 많이 걸리는 공정이기 때문에, 표피 분리를 우회 방법 개발 7,8 검증되었다. 여기서, 우리는 나트륨 메톡 시드 (에 NaOMe) 해중합 촉매 반응 이후 가스 크로마토 그래피 / 질량 분석 (GC / MS)에 의해 분석 된 애기 장대 잎의 각질의 단량체 조성물을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 공동을 분석을위한 강력한 방법을 제공한다전체 delipidated 조직에서 식물 지질 폴리 에스테르의 mposition, 그리고 이전에보고 된 프로토콜 7,10,11에서 적응하고있다. 전체 조직 샘플은 균질화 제 철저 cuticular 및 epicuticular 왁스, 멤브레인 지질 및 트리 아실 글리세롤을 포함한 용매 추출 성 지질을 제거 delipidated. 세포벽 강화 잔기는 나트륨 메톡 시드 메탄올 촉매 작용에 의해 그 구성 메틸 에스테르 단량체로 해중합된다. 지방산 메틸 에스테르 산성화에 추출하고, 해당 트리메틸 실릴 또는 아세틸 유도체를 얻기 위해 유도된다. 유도체 화 잔기는 높은 휘발성이며, GC / MS 분석에서 구조적 형태를 변경하지 않고 적절한 온도에서 기체 크로마토 그래피 칼럼으로부터 용출 될 수있다.

Protocol

참고 :이 프로토콜은 보나 벤처 호텔 등의 알에서 적응했다. (2004), 몰리나 등. (2006), 리튬 등. (2013) 7,10,11. 1-5 단계는 그림 1에 요약되어있다.

1. 조직 탈지

참고 : 항상, 클로로포름 모든 유리와 모자를 씻어 사용하기 전에, 흄 후드에서 건조시키는.

주의 : 조직 균질화 및 흄 후드 아래에있는 모든 용매 전송 단계를 수행; 항상 화학 물질과 직접 접촉을 방지하고 오염으로부터 샘플을 보호하기 위해 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오.

  1. 예열 물 목욕 및 85 ° C의 열 블록.
  2. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 캡 나사 벌였습니다 미리 칭량 20mm X 125mm 유리 시험관에 각 리프 시료 약 0.5 g을 단다. 샘플 당 네 개의 복제를 포함합니다.
  3. 삼각 플라스크 (약 125 ml의 2- 프로판올을 배치; SAMP의 g 당 25 ㎖를르). 0.01 %의 최종 농도 (또는 부틸 히드 록시 톨루엔, BHT로 알려진) 2,6- 디 -tert- 부틸 -4- 메틸 페놀을 추가 (W / V).
    주 : 메탄올 모액 (/ V W) 5 % 내지 BHT 추가 (BHT는 불포화 지방산의 산화를 최소화).
  4. 물을 욕조에 85 ° C로 예열 2- 프로판올 솔루션입니다.
  5. 열 블록에 85 ° C에서 15 분 동안 각각의 샘플 튜브 가열로 12 ml의 뜨거운 -2- 프로판올 용매를 추가한다. 이 단계는 파괴 세포에서 방출 될 수 리파제를 비활성화합니다.
  6. 튜브를 실온으로 냉각하고 균질 한 현탁액을 수득 할 때까지 균질 조직을 완전히 분쇄하자.
  7. 궤도 통에 샘플을 넣고 100 rpm으로 상온에서 1~2 시간 동안 흔들어.
  8. 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
  9. 2- 프로판올의 동량을 첨가하고, 실온에서 12 시간 동안 흔들어.
  10. 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
  11. 12 ㎖의 CH 추가CL 3 : CH 3 OH (2 : 1, V / V) (샘플의 g 당 25 ㎖)에 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 밤새 흔들.
  12. 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
  13. 12 ml의 클로로포름 추가 : CH 3 OH를 (1 : 2, v / v)의 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 하룻밤 흔들.
  14. 800 XG에 10 분 동안 원심 분리기 및 용매 제거합니다.
  15. 샘플을 실온에서 밤새 흄 후드에서 건조 시키십시오.
  16. 잔류 물을 공기 - 건조 후, 무수 CaCl2를 또는 일정한 중량 (3~5일)에 도달 할 때까지 4 CASO 위에 진공 데시 케이 터 내에서 배치했다.

2. 해중합 : 나트륨 메톡와 메탄올 (그림 2)

주의 : - 2.4, 2.7-2.8, 2.10 - 단계 2.3 수행 2.15과 2.17 - - 2.11, 2.13 흄 후드에서 2.18; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오.

  1. 60 ℃로 예열 열 블록.
  2. (추가 계산을 위해 중요) 건조 잔류 물을 포함하는 테스트 튜브의 무게.
  3. 각각의 튜브 내부 기준을 추가 : 25 ωL 메틸 heptadecanoate (1 ㎎ / ㎖ 주) 25 μL의 ω-pentadecalactone (1 ㎎ / ㎖ 주식을).
  4. 각 튜브에 0.9 ml의 메틸 아세테이트, 1.5 ml의 나트륨 메톡 시드, 및 3.6 mL의 메탄올을 첨가하고 그들을 모자. 다르게는, 이러한 세 가지 시약과의 반응 혼합물을 준비하고, 각 샘플을 6 mL의 분취 량을 추가한다.
  5. 2 ℃에서 60 시간 동안 주기적으로 15 분 간격으로 선회 용 열 샘플.
  6. 샘플을 실온까지 냉각 보자.
  7. 지방산 메틸 에스테르를 추출 메틸렌 클로라이드 (CH 2 CL (2)) 및 빙초산 150 mL를 10 ㎖를 추가한다.
  8. 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다.
  9. 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플.
  10. 폴리 중형 크기의 튜브를 청소 (저급) 유기상을 트랜스퍼 (16 × 125mm의 유리 시험관테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡).
  11. 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다.
  12. 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플.
  13. 수성 (위) 단계를 제거하고를 반복 2.11-2.12 단계를 반복합니다.
  14. 모든 수성 (위) 단계를 제거합니다.
  15. 1 분 동안 튜브, 소용돌이 캡 용매에 무수 황산나트륨 (NA 2 SO 4)을 추가; 샘플은 현재 다음 날 때까지 남아있을 수 있습니다.이 점 샘플 흄 후드에서 밤새 남아있을 수 있습니다에서.
  16. 하단에있는 나 2 SO 4 소금을 압축하는 800 XG에서 2 분 동안 원심 분리기.
  17. 작은 유리 일회용 튜브 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌 13 X 100mm 유리 테스트 튜브 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡)에 유기 상을 전송합니다.
  18. 질소 하에서 건조에 용매를 증발 및 유도체 화 단계로 진행합니다. 즉시 처리되지 않는 경우, 저장소는 -20 ° C에서 샘플을 증발시켰다 (샘플 일 수있다LSO) 증착 단계 이전에 저장된다.

가스 크로마토 그래피 파생 상품 3. 준비

주의 : 단계 3.1.2과 3.1.5 수행 - 흄 후드에서 3.1.8을; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오.

  1. 트리메틸 실릴 유도체
    1. 100 ℃로 예열 열 블록.
    2. 각각의 튜브에 피리딘 100 ㎕와 BSTFA (N, O 비스 - 트리메틸 실릴 - 트리 플루오)의 100 μl를 추가하고 캡.
    3. 10 분 동안 100 ℃에서 가열 된 샘플.
    4. 샘플을 실온까지 냉각 보자.
    5. 실온에서 질소하에 샘플을 증발시켰다. 시료에 열을 가하지 마십시오, 단량체는이 단계에서 매우 휘발성이다.
    6. 1 (v / v)의 헵탄 : 톨루엔 1의 500 μl를 추가합니다.
    7. 800 X g에서 2 분 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플.
    8. GC 바이알에 샘플을 추가하고 GC / MS 분석을 진행합니다.
  2. 아세틸파생 상품
    주 : 아세틸 들어, 단계 수정 3.1.1-3.1.3 상기 (비디오에 도시되지 않음) 다음; 3.1.4-3.1.8이 동일한 단계 :
    1. 60 ℃로 예열 열 블록.
    2. 피리딘 100 ㎕와 튜브에 아세트산 무수물 100 ㎕ (O 행 2)를 추가합니다.
    3. 열 샘플 60 ° C에서 1 시간.

4. GC / MS 분석

  1. HP-5 캐 필러 리 컬럼 (30 MX 0.25 mm X 0.25 μm의 필름 두께) 또는 이와 동등한 (예., 5 % 페닐, 95 % 디메틸 폴리실록산)를 사용합니다. 프로그램 3 ℃ / 분으로 300 ℃까지 150에서 프로그래밍 헬륨 캐리어 가스 1.5 ml / 분으로 설정 유량 및 오븐 온도 GC.
  2. 40-600 AMU (전자 충격 이온화)를 통해 모드를 스캔 분할 주입 (분할 비율 1시 10분) 및 설정 질량 분석기를 사용합니다.
  3. 용매 (빈), (WT) 및 돌연변이 복제, 각 사용하여 표시 각질 분석 방법을 포함한 일련의 테이블을 만듭니다.
  4. 로드 용매그리고 회전 목마 샘플 유리 병은, 필요한 경우 자동 시료 주입기에 주사기 세척 유리 병에 헥산을 추가하고 순서를 시작합니다. 시퀀스가 완료된 후, 총 이온 크로마토 그램 트레이스 모든 샘플 가능하다.

5. 데이터 분석

  1. 게시 된 질량 스펙트럼에 대한 각 피크의 질량 스펙트럼을 비교하거나 가능한 경우 상용 라이브러리를 검색하여 지질 폴리 에스테르 단량체를 확인합니다.
  2. 총 이온 전류 크로마토 그램의 각각의 피크에 대해 식별, GC / MS 소프트웨어 (기업도 1)에서 적분 결과 테이블 영역을 찾기 위해 각각의 체류 시간을 사용한다.
  3. 각 단량체 (컬럼 AB)를 들면, 모노머의 엑셀 테이블 (보조 파일 2 열 CF)에서 샘플을 복제마다의 해당 칼럼에 통합 테이블 (기업도 1, 열 D)에 위치한 영역 값을 추가 스프레드 시트는 애기 장대를 정량화하기각질 TMSI 유도체. 아세틸 유도체 대신 준비하는 경우 보충 파일 3을 사용합니다.
  4. IS 열 (홍콩)에 내부 표준 (IS)의 영역을 추가합니다. 단량체 테이블의 정량 (보라색 음영 셀에 대한있는 그대로 공 명성 (IS1); 보충을 : 그, 즉 지방산 메틸 에스테르를 유도하지 않는 단량체 (FAMES), 및 디카 르 복실 산 디메틸 에스테르 (DCA DMEs)의 경우, 17을 사용 파일 2/3). 차 알코올, 페룰 산 및 ω-하이드 록시 산을 포함하는 수산화 단량체, 15 사용 : 화합물 정량에 대한 선택의있는 그대로 0 ~ 15 하이드 록시 명성 (IS2) (단량체 테이블에 녹색 shadded 세포, 2/3 보충 파일) .
  5. 각각의 건조 잎 무게 추가 열을 복제 AX-BA (보충 파일 2) 또는 AQ-AT (보조 파일 3); 대안 적으로, 단량체 단위 당 부하를 표현하는 표면 영역을 계산하고, 단량체 테이블 영역 값을 추가하기 위해 잎을 스캔표면적.

Representative Results

.이 논문에서 설명하는 프로토콜은 그림 1 비 각질 지질 (10)의 기여를 최소화, (., 각질 또는 suberin 예) 지질 폴리 에스테르 단량체를 결정하기 위해 설정 모두 8 사이의 소요 분석의 개요를 제시한다 - 10 일 (GC 데이터를 획득 초기 조직 수확에서), 건조 허용되는 시간을 샘플에 따라.

선택된 염기 - 촉매 메탄올 (그림 2) 폴리 에스테르를 해중합하는 방법은 이전에 각질과 suberin 모두 포함 애기 씨에 대해 검증 하였다. 조직이 먼저 균질화하고 철저하게 용매 추출 지질을 제거하는 delipidated된다. 추출 후 잔류 물 수익률은 초기 신선한 무게의 비율로, A의 보통 6 %입니다 장대 골-0 잎. 세포벽 강화 잔기 진공 건조기에서 건조시킨 후, 그 구성에 의해 메틸 에스테르 단량체로 해중합 아르염기 - 촉매 transmethylation. 두 시간 인큐베이션 해중합 적절한 지질 및 폴리 에스테르 성분의 회복에 필요한 중요한 시간으로 선택되었다. 긴 배양 시간은 2- 히드 록시 산의 증가 하였다; 이러한 잠재적으로 막 스핑 고리 피드 (10)에서 파생.

O -TMSi 에테르 유도체 (도 3A)O의 아세틸 유도체 (도 3B)에 대한 야생형 애기 장대 잎의 cutin는도 3에 도시되어있는 경우의 전형적인 크로마토 그램. 각각의 피크는 문헌 7,812 당사 비디오 프로토콜 TMSI 유도체를 제조하는 방법을 보여준다 공용 데이터베이스로부터 질량 스펙트럼 비교에 의해 식별 되었으나, 샘플은 다르게는 수산기를 유도체 화하는 아세틸 화 될 수있다. 그들이 진단 질량 스펙트럼을 제공하기 때문에 실릴 유도체 식별을 위해 좋다. 그러나, 아세틸 유도체보다 안정적이고 좋은 대안이 실릴하기한 번 단량체 (10) 확인되었다. 단지 GC 불꽃 이온화 검출기 (FID)에 접속 한 실험실에서 이러한 프로토콜을 구현하기 위해, GC / FID는 WT 리프 각질 단량체 및 지방산 메틸 에스테르를 기준 동족체 계열에 아세틸 화 유도체에 대응하는도 나타낸다 트레이스 (기업도 4).

이 방법은 정성과 샘플 사이의 양적 차이, 돌연변이 분석에 따라서 그 값을 검색합니다. 개별 단량체의 양은 샘플 사이의 단량체 풍부 비교를 가능하게 정량의 내부 표준 방법을 사용하여 결정된다. 이 피크의 크기 (총 이온 카운트) 폴리 에스테르 단량체의 몰비를 반영하지 않을 수 있음이 명확해야한다. 우리는 지방산 메틸 에스테르 유도체 및 TMSI (보조 파일 1) 또는 ACE로 애기 장대 잎의 cutin 모노머 량을 계산하는 단량체의 편집되는 테이블을 포함 알코올의 TYL 유도체 (보충 파일 2). 이 테이블은 샘플이 다른 기관 또는 식물 종에서 추출하는 경우 적용 할 필요가있다.

예를 들어, 우리가 분석 한 애기 장대 탈리아 NA 컬럼비아 (골-0) 야생형 잎과 CYP86A2 / ATT1 유전자, att1-1 (M-1)과 att1-2의 두 이전에 특성화 된 널 돌연변이 대립 유전자 (M-2 ) (13, 14). CYP86A 아과의 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제는 추정 ω-oxydases를 인코딩 및 suberin과 각질 단량체 생합성에 참여한다. 우리의 결과 (그림 4) (WT) 잎에 비해 돌연변이 잎에 세 가지 주요 지질 단량체의 부하에 상당한 감소를 보여줍니다. 0, 18 : 2, 18 : 효소의 예측 기능, 16 일치 1 디카 르 복실은 특히 att1 돌연변이에 영향을 받았다.

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그림 지질 폴리 에스테르 분석 1. 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도에 NaOMe - 촉매 transmethylation 반응 2. 메커니즘. 핵성 메톡 음이온 용이 지방산 메틸 에스테르 및 알콕시 드 음이온 (B)로 해리 불안정한 사면체 중간체 (A)를 형성하는 지질 폴리 에스테르 cabonyl 탄소를 공격한다. 이 알콕사이드는 공액 염기이며, 이에 추가 해중합 반응 (C)를 ​​유지하는, 촉매 활성 메톡 음이온 재생 메탄올로 반응한다. 물이 존재하면시스템은, 그것은 수산화 나트륨, 비가 역적으로 바람직하지 않은 유리 지방산을 생성하는 에스테르를 가수 분해 강염기를 형성하기 위해 나트륨 메톡 시드와 반응한다. 메틸 아세테이트. 시스템 (D) 내에서 수산화 나트륨의 적은 양을 제거하기 위해 공동 용매 (15)으로 추가됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 야생형 애기 장대의 잎 각질 모노머의 대표적인 총 이온 크로마토 그램. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) 에테르와 (B) 아세테이트 하이드 록시 유도체 등을들 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
애기 장대 WT 4. 각질 단량체 조성물과 CYP86A2 유전자의 두 널 돌연변이 대립 유전자. (돌연변이-1 = att1-1; 돌연변이 -2- = att1-2) 오차 막대는 (N = 4)의 평균의 표준 편차를 나타내는 . © 블랙웰 출판 (2007)의 허가, 13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1
GC / MS 소프트웨어에서 보충 그림 1. 피크 통합 결과 테이블. 확인 단량체 및 내부 기준에 해당하는 봉우리는 retenti에 의해 식별된다 시간 (열 C) 및 면적 값이 열에 표로에 디는 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
애기 장대 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 트리메틸 실릴 에테르 유도체)의 보충 파일 2. 표. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
애기 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 O의 아세틸 유도체)의 기업 파일 3. 표.COM / 파일 / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx "대상 ="_ 빈 ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
기업도 4 GC / FID의 트레이스 (AB) 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 보유 지수는 표준 (피크는 각각 포화 FAME 사슬 길이로 표지된다); 및 (C)는 (A)를 아세틸 장대 중량 잎 각질 단량체. 16 : 0 FAME (1), ferulate (2), 18 : 3 FAME (3), 18 : 1/18 : 2 FAMES (4), 18 (5), sinapate 0 FAME (6 피크 숫자에 해당합니다 ), 16 : 0 DCA (7), 16-OH 16 : 0 FAME (8), 18 : 2 DCA (9), 18 : 1 DCA (10) 18 : 0 DCA (11), 18-OH 18 : 2 명성 (12), 18-OH 18 : 1 FAME (13), 20 : 0 FAME (14), 10,16 - 디 하이드 록시 16 : 0 FAME (15), 24 : 0 FAME (16). DCA : 다이 카복실산 다이 메틸 에스터; FAME : 지방산 메틸 에스터; IS1 : 내부 표준 1, 17 : 0 명성; IS2 : 내부 세인트andard 2, 15-OH 15 : 0 FAME. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이러한 DNA와 단백질 등의 생체 고분자와는 달리, 식물 지질 폴리 에스테르 템플릿에서 만든되지 않습니다. 대신, 자신의 조성물은 이러한 세포 외 중합체를 만드는 조직에 존재하는 효소의 특이성에 따라 달라집니다. 같은 화학 성분 분석으로 구성 요소는 지질 폴리 에스테르 성분을 이해하는 것이 중요하다.

에스테르 결합을 절단하는 화학적 방법은 비누화, 수소화 분해, 산 촉매 transmethylation,베이스 - 촉매 transmethylation (2)를 포함한다. 그들 각각의 장점과 단점이 있습니다. 비누화 보조 반응을받을 수있는 자유 지방산 하이드 록시 산을 생산하고 있습니다. 리튬 알루미늄 하이드 라이드와 수소화 (LiAlH 4)도 16은도 7의 cutin 분석에 사용되었다. 수소화는 알코올에 탄소수 작용을 감소시키고 구조가 원래의 알루미늄 리튬 중수소 (LiAlD 4)와 deuteriolysis 유추되어야한다. 그만큼이 방법의 단점은, 그 구조의 할당을 획득하기 위해 지방산 폴리올 deuteriation의 정도를 비교하는 사진 GC / MS의 요구 사항이다. 메탄올 불화 붕소 (BF 3)와 에스테르 교환 반응 산 촉매는 자주 각질 및 suberin depolymerizations 8,17,18에서 사용되었지만, 시약은 제한된 수명을 가지며, 반응 15 측면에 의한 인공물을 초래할 수있다. 메탄올 성 황산을 10도 다른 방법에 비하여, 단량체하지만 아마도 진정한 지질 폴리 에스테르 성분없는 2- 히드 록시 지방산의 더 큰 비율과 메틸 에스테르를 산출한다.

이 프로토콜에 설명에 NaOMe - 촉매 에스테르 교환법이 식별 특성 질량 스펙트럼을 제공 수산기의 실릴 화에 의해 유도되는 지방산 메틸 에스테르를 생성하거나 아세틸 fo를 수산기보다 안정한 유도체를 제공 할R 정량. 이 기술의 한 가지 단점은 물이 반응에 존재하는 경우, 가수 분해가 에스테르 교환 반응과 경쟁한다는 것이다. 물에 NaOMe (촉매)과 반응하여 차례로 유리 산 (도 2d)을 수득 지방산 메틸 에스테르를 가수 분해에 NaOH를 생성한다. 따라서 분석을 복잡 메틸 에스터 및 TMSI 에스테르 유도체 : 두 개의 피크는 각각 지방산 대 존재할 수 있기 때문에 바람직하지 않은 부반응이다. 무수 시약을 사용하여 비누화와 경쟁 보조 용매로서 메틸 아세테이트를 첨가 가수 분해 (도 2D)를 방지하는 것이 중요한 단계이다.

각질과 suberin 1 26 % 글리세롤 (4) 사이에 포함되어 있습니다. 그러나,이 단량체는이 프로토콜에서 설명한 실험 조건에 의해 검출되지 않을 것이다. 글리세롤은 지방산 메틸 에스테르 계 단량체와 달리, 수성 용매 세척 단계에서 제거 될 것이고, 고 친수성이고. 이러한 제한도다른 각질 해중합 방법하지만 글리세롤 pplies는 효소 방법을 사용하여 에스테르 교환 반응 후의 수층으로 결정될 수있다. 대안 적으로,이 온화한 조건을 이용하여 정량화 할 수있다 (예., 0.05 M에 NaOMe) 상기 물 추출없이 모든 단량체를 검출하는, 글리세롤 정량 목적 .Although 유용한 글리세롤 (19, 20)를 포함하여, 온화한 조건은 일반적으로 각질의 불완전한 탈 중합을주고 suberin.

불꽃 이온화 검출기 (FID)에 결합 GC 사용할 경우 대표적인 샘플의 피크는 GC / MS에 의해 식별 된 후, 모든 복제는 정량 목적이 기기에서 분석 될 수있다. 보존 지수가 공지되어있는 경우 또는, GC / FID 트레이스에 단량체가 식별 될 수있다. 불꽃 이온화 검출기가 크고 작은 샘플 성분의 정량 중요 특히 높은 감도와 비례의 넓은 범위를 갖는다단일 실행에. 또한, 강력하고 유지하며 15을 조작하기 쉽다.

설명 된 프로토콜은 하나 이상의 지질 에스테르 단량체 조성물 상이 돌연변이 화학적 특성을 허용 식물 지질 에스테르 단량체의 신뢰성 및 재현성 분리, 식별 및 정량화를 허용한다. 절차가 쉽게 뿌리, 종자, 잎, 줄기, 꽃 등 다양한 식물 재료의 작은 벌크 수량 모두를 처리하도록 구성 될 수있다, 확장 가능하다. 많은 종에서 지질 에스테르 단량체의 질량 스펙트럼 데이터는, 21-26. 예를 게시하고 다른 조직 및 / 또는 종이 프로토콜을 채택 할 때 알려지지 단량체를 식별하는 데 가치있는 자원을 구성하고있다. 이 방법은 고등 식물 지질의 생합성 에스테르, 규제, 및 분포 연구에 적용 할 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2-propanol Fisher Scientific BPA451-4 Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421500
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102 Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) Sigma-Aldrich 15222 Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT) Sigma-Aldrich 101162 Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous Fisher Scientific C614-3 Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) Acros Organics 219090020 Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane) Fisher Scientific C6074 Organic solvent
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401212 Acidification agent
Helium carrier gas, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1046 Carrier gas, GC/MS
Heptane Fisher Scientific H3501 Organic solvent
Hexanes Fisher Scientific H3024 Organic solvent
Methanol Fisher Scientific A4124 Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate Sigma-Aldrich 296996 Organic solvent
Methyl heptadecanoate Sigma-Aldrich H4515 Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane) Fisher Scientific D374 Organic solvent
Nitrogen, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1044 Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone Fluka 76530 Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 Co-solvent for derivatization
Sodium chloride Fisher Scientific BP358212 Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%) Sigma-Aldrich 156256 Nucleophile
Toluene FIsher Scientific T2904 Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX Premier Tech Horticulture Ltd Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Purdue Methods for Arabidopsis Growth. 
PermaNest Humidity Dome  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-20125
GC vial caps National Scientific C400051A
GC vial microinserts National Scientific C4011631
GC vials National Scientific C40001
Disposable pasteur pipets Fisher Scientific 1367820B
Flasks Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge Beckman Coulter
Analytic balance Fisher Scientific
Belly dancer A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column J&W Scientific, CA, USA;  30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer Thermo Scientific
Heat block Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph Thermo Scientific
Two-stage regulator Air Liquide Q1-318B-580
Vacuum desiccator Fisher Scientific
Vortex mixer Fisher Scientific

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References

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