Un bioreattore Novel per l'alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

1Civil, Architectural, and Environmental Engineering, Drexel University, 2Chemical and Biomolecular Engineering, University of Pennsylvania
Published 12/25/2015
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Bioengineering

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Summary

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Price, J. R., Shieh, W. K., Sales, C. M. A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities. J. Vis. Exp. (106), e53443, doi:10.3791/53443 (2015).

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Abstract

Introduction

Reflui urbani è comunemente trattati con processo a fanghi attivi per ridurre i solidi sospesi (SS), richiesta di ossigeno biologica (BOD), azoto organico e inorganico, e fosforo 5,6. Il processo a fanghi attivi, un mezzo di depurazione secondario, comporta l'ossidazione del carbonio organico in una vasca di aerazione riempito con un liquido misto di refluo e riciclati microrganismi eterotrofi (comunemente indicato come fanghi attivi) 5-7. Il liquido misto quindi entra in una relativamente grande chiarificatore (decantatore) dove il fango si deposita per facilitare la raccolta, sia di essere smaltiti o riciclati al serbatoio di aerazione, mentre, acque reflue trattate chiarificata può continuare a trattamento terziario o disinfezione prima di essere rilasciato in acque riceventi 5-7. Separazione efficiente di acque reflue trattate e solidi (fanghi) nel chiarificatore secondario è essenziale per il corretto funzionamento di un erasistema di trattamento tewater, come ogni fanghi attivi continuare al di là dei chiarificatori aumenterà la BOD e SS nell'effluente 5-8.

Un certo numero di processi biologici alternative esistono per trattamento secondario delle acque reflue, che riducono o eliminano la necessità di grandi serbatoi chiarificatori, compresi crescita divisoria (biofilm) reattori, bioreattori a membrana (MBR), e reattori fanghi granulari. Nei reattori biofilm, la formazione di biofilm, in cui i microrganismi naturalmente aggregato e collegare come uno strato su una superficie solida, permette di ritenzione biomassa e accumulo senza la necessità di un serbatoio chiarire. Reattori biofilm possono essere classificati in tre tipi: i reattori a letto ricco, reattori a letto fluido, e la rotazione contattori biologici. Reattori a letto pranzo, come un percolatori e torri biologiche, utilizzano un stazionario superficie solida crescita 5,6. Reattori a letto fluidizzato (FBRs) dipendono dalla attacco dei microrganismi di particelle,come sabbia, carbone attivo granulare (GAC), o di perle di vetro, che sono tenuti in sospensione da un alto tasso di flusso verso l'alto 9,10. Rotazione reattori biologici dipendono biofilm formati sulla media associati ad un albero rotante che consentono il biofilm essere alternativamente esposte all'aria e il liquido viene trattata 5,6. MBR utilizzano unità di filtrazione a membrana, sia all'interno del bioreattore (configurazione sommerso) o esternamente tramite ricircolo (configurazione side-stream) 5,11. Le membrane servono per ottenere una buona separazione della biomassa e particelle solide dal liquido trattato 11,12. Reattori fango granulare sono reattori flusso verso l'alto in cui la formazione di granuli estremamente densi e ben sedimentazione di microrganismi si verifica quando sono esposti a elevato flusso verso l'alto dell'aria superficiale velocità vettoriale 13.

Come ulteriore alternativa al processo a fanghi attivi, un reattore upflow romanzo, ora chiamato un bioreattore ad alta densità (HDBR), era designed e costruito da vendite e Shieh (2006) per studiare la rimozione COD da fanghi attivi dai flussi di rifiuti sintetici in condizioni di scarsa F / M che sono noti per causare la formazione di cattiva decantazione fanghi (cioè, carica fanghi) 1,7,14. Il sistema utilizzato HDBR modificato reattori a letto fluido che in genere consistono di un reattore flusso verso l'alto e un serbatoio di riciclo esterno. Reattori a letto fluido sono in genere azionati con corrente di riciclo Portate abbastanza alto per mantenere il substrato di crescita biofilm sospeso ma bassi abbastanza in modo che il substrato biofilm coperte viene mantenuta. A differenza di reattori a letto fluido, il HDBR descritto nelle vendite e Shieh (2006) ha usato le portate del flusso di riciclaggio relativamente bassi che, insieme con aerazione esterna, impedito interruzione della zona di biomassa formata all'interno del reattore 1. Studi successivi hanno dimostrato la capacità di questo progetto del reattore di trattare con successo una serie di flussi di azoto utilizzando nitrificanti / batteri denitrificanti 3,4. In tutto stalloneies la formazione di una stabile, zona biomassa densa all'interno HDBR eliminato la necessità di un processo di flocculazione / sedimentazione esterno 1-4.

Come riportiamo qui, l'uso del HDBR crescere culture dense è stato anche testato in una configurazione photobioreactor (PBR) alla coltura delle alghe. Discutiamo i vantaggi e gli svantaggi di questo sistema reattore romanzo per la coltivazione delle alghe e le sue potenzialità per superare un grande ostacolo nella commercializzazione di biocarburanti algali associati alla raccolta di biomassa (ad esempio, una buona separazione solido-liquido 15,16). Il protocollo che segue illustra i passaggi necessari per assemblare, avvio, campione, e mantenere un HDBR con alghe come la comunità microbica di interesse. Saranno inoltre menzionate variazioni del protocollo di avvio e il funzionamento delle culture eterotrofi e nitrificazione / denitrificanti. Infine, saranno evidenziati i vantaggi generali, gli svantaggi e le incognite di questo disegno romanzo reattore.

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Protocol

1. Reattore Assemblea

  1. Disporre i componenti del reattore secondo lo schema di figura 1.
    1. Posizionare il reattore (R) su una piastra di miscelazione, aggiungere una ancoretta al reattore. Posizionare il serbatoio di riciclo (RT) accanto alla piastra di agitazione e reattore in modo che la porta effluente (superiore) del serbatoio è diretto verso il bordo del banco di laboratorio.
    2. Posizionare il contenitore degli scarti (W) sotto la porta di effluente (superiore) del serbatoio di riciclo (RT). Posizionare il serbatoio di alimentazione (FT) accanto al serbatoio di riciclo (RT).
      Nota: Il serbatoio di alimentazione ha una capacità totale di 5 L.
  2. Fissare il reattore (R) contro il ribaltamento con uno stand di dimensioni appropriate e morsetto. Allo stesso modo, fissare il serbatoio di riciclo (RT) per impedire il movimento.
  3. Inserire neoprene tubo della pompa peristaltica nel riciclo (Pompa A) e dei mangimi teste (pompa B) pompa. Fare riferimento alla tabella dei materiali per le specifiche tubi aggiuntivi. Installare le teste delle pompe sulle pompe con le viti Provided con gli accoppiatori.
  4. Collegare il tubo di pompa A per le porte sul reattore e la vasca di riciclo. Inserire l'estremità del tubo di pompa B nel serbatoio di alimentazione e il serbatoio di riciclo. Collegare la porta del reattore superiore al serbatoio di riciclo con la tubazione. Applicare fascette al tubo nei porti reattore.
    Nota: Le comunità fotosintetici possono beneficiare di illuminazione artificiale fornita da lampade.

2. Preparazione di soluzioni di riserva, Affluente / mangimi Solutions, e alghe Inoculant

  1. Preparare la soluzione minerale magazzino. Aggiungere quanto segue in un matraccio da 1 L con 500 ml di acqua deionizzata: 200 g di bicarbonato di sodio, 40 g di fosfato monobasico di potassio, 4 g di solfato di magnesio, 4 g di cloruro ferrico, 4 g di cloruro di calcio, 1 g di cloruro di rame, 1 g di cobalto cloruro esaidrato, 1 g di cloruro esaidrato di nichel, 1 g di solfato di zinco eptaidrato. Aggiungere ulteriori 400 ml di acqua deionizzata. Agitare con forza per favorire la dissoluzione dei sali. A seguito di dissoluzione di sali, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale di soluzione per 1 L.
  2. Preparare la soluzione di ammoniaca magazzino. In un matraccio tarato da 1 L, sciogliere 38.214 grammi di cloruro di ammonio in circa 900 ml di acqua deionizzata. Dopo la dissoluzione, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 1.000 ml.
    Nota: 1 ml di soluzione madre diluita a 1 L rendimenti a 10 mg L-1 NH 4 + -N soluzione.
  3. Preparare la soluzione di nitrato. In un matraccio tarato da 1 L, sciogliere 72,413 g di nitrato di potassio in circa 900 ml di acqua deionizzata. Dopo la dissoluzione, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 1.000 ml.
    Nota: 1 ml di soluzione madre diluita a 1 L ottiene un 10 mg L-1 NO 3 - -N soluzione.
  4. Preparare alimentazione soluzione / influente. Per fare una soluzione di alimentazione contenente 20 mg L -1 NH 4 + -N e 20 mg L -1 NO 3 - -N, diluire 2 ml di unasoluzione stock mmonia e 2 ml di nitrato di soluzione madre al volume totale 1 L. Prima della diluizione, aggiungere 0,5 ml soluzione minerale / L di soluzione compiuti. Preparare 5 L di influente in totale per avviare il reattore.
  5. Preparare il inoculante alghe.
    1. Raccogliere un grande volume (almeno 10 L) di acqua da un corpo idrico alghe contenente come un ruscello o stagno. Lasciare che le alghe di stabilirsi lasciando i campioni di acqua indisturbato per 24 ore.
    2. Decantare e scartare chiaro (non contenente alghe) acqua in cima dei campioni, lasciando una sospensione concentrata di alghe all'interno dei contenitori. Unire la sospensione di alghe da tutti i campioni in un contenitore e ripetere la decantazione e gradini decantazione.
    3. Misurare la biomassa all'interno del campione concentrato.
      1. Essiccare un filtro di carta vuoto (0,45 micron MCE filtro a vuoto) e alluminio pesare barca O / N in un forno che è stato impostato a 103 ° C Dopo raffreddamento in essiccatore per 30 minuti a RT misurare la combined massa del filtro e pesare barca.
      2. Filtro a vuoto 20 ml di sospensione concentrata di alghe e restituire il filtro e pesare barca a forno ad asciugare O / N.
      3. Misurare la massa combinata del filtro e pesare barca. Calcolare la densità della biomassa nel campione concentrato.
        Nota: Il volume totale di campione che gli investigatori dovranno raccogliere dipenderà corpo acqua di fonte.

3. Semina e avvio il reattore

  1. Aggiungere 750 ml di soluzione di alimentazione al reattore. Riempire il serbatoio di riciclo con 500 ml di soluzione di alimentazione.
  2. Utilizzare una lunga pipetta per aggiungere delicatamente una sospensione inoculare contenente 1,5 g di alghe vicino al fondo del reattore. Consentire l'inoculo di depositarsi sul fondo del reattore, garantisce questo mediante osservazione visiva, prima di procedere alla fase successiva.
  3. Una volta che le cellule si sono stabiliti, rimuovere i fermagli del tubo e accendere Pompa A per una portata lenta (10 Revolutions min -1/38 ml min -1). Aria intrappolata nel tubo sarà espulso nel reattore.
    Nota: L'aggiunta di 750 ml al reattore impedirà qualsiasi biomassa disturbati dalla pompa in uscita dal reattore. Spremere il tubo per assicurare che tutta l'aria è stata espulsa.
  4. Aggiungere gradualmente soluzione di alimentazione al serbatoio di riciclo come la soluzione viene pompata nel reattore. Continuare l'aggiunta fino sia il reattore e il serbatoio di riciclo sono a capacità e inizia effluenti uscire serbatoio riciclo tramite la porta superiore.
    Nota: Il volume di soluzione di carica da aggiungere al serbatoio di riciclo varierà con il volume del inoculante aggiunta al reattore.
  5. Versare la soluzione di alimentazione rimanente nel serbatoio di alimentazione.
  6. Impostare la pompa di ricircolo (Pompa A) a 19 giri min -1, che stabilisce un flusso di riciclo del 72,5 ml min -1. Osservare le alghe cominciano a soppalco dal fondo del reattore. Utilizzando le gradazioni sul reattore, determinare il bi alghealtezza zona omass. Assicurarsi che l'altezza è costante prima di procedere alla fase successiva.
  7. Accendere la piastra di miscelazione a velocità molto bassa; un ambiente di 1 o 2 è opportuno iniziare. La barra di miscelazione aiuterà a loft ulteriore biomassa, ma miscelazione aggressivo causerà alghe per lasciare il reattore, inserire il serbatoio di riciclo, e lasciare in effluenti. Impostare miscelazione velocità ad un ambiente necessario per stabilire un confine netto alghe all'interno del reattore (Figura 2A); zona biomassa algale dovrebbe essere di circa 10-15 cm di altezza.
  8. Avviare la pompa di alimentazione dopo aver osservato un chiaro confine tra la spina algale e il fluido del reattore. Impostare la pompa 25 giri min -1, che stabilisce un flusso di 1,5 ml min -1. Osservare l'uscita del fluido del reattore porto effluente dovuta alla gravità e spostamento causato dal flusso entrante in entrata.

4. Raccolta e analisi

  1. Svolgere attività di raccolta dei campioni prio per eseguire la manutenzione del sistema reattore. Raccogliere 20 ml di campioni di effluenti e influenti quotidiano. Raccogliere campioni effluenti all'interno della vasca di riciclo. Raccogliere campioni influenti direttamente dal serbatoio di alimentazione.
  2. Campioni del filtro di vuoto per rimuovere i solidi prima di archiviazione e l'analisi sospesi.
  3. Conservare influente ed effluente campioni a -20 ° C fino ad ulteriore analisi. Limitare il numero di cicli di scongelamento congelare i campioni sono sottoposti. Se necessario, i campioni possono essere suddivisi in aliquote per mantenere l'integrità del campione.
  4. Effettuare analisi campione per nitrati, nitriti, ammoniaca e utilizzando tecniche standard 17.
    Nota: Gli autori hanno utilizzato cromatografia ionica (IC) per produrre i risultati presentati nel presente documento. Fare riferimento alla tabella dei materiali per la specifica.

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Representative Results

Il HDBR stato usato per coltivare le alghe in diversi rapporti di concentrazione influente ammoniaca e nitrati, pur mantenendo un contenuto di azoto totale nel mangime a 40 mg -NL -1. Influente e campioni effluenti sono stati presi tutti i giorni; campioni di densità di biomassa sono stati prelevati all'inizio e alla fine di ogni condizione. Il reattore sono voluti in media 3-5 giorni per raggiungere l'equilibrio di stato stazionario dopo sono state modificate le condizioni. Su una vasta gamma di condizioni influenti una zona distinta biomassa risultato, come osservato studi precedenti (Figura 2). La coltura di alghe nel HDBR è stato trovato per rimuovere una media del 18,4% del totale delle specie azotate nei mangimi (n = 44). All'interno della zona biomassa totale biomassa algale e biomassa densità erano coerenti nel corso di questo studio.

La rimozione di NH 4 + e NO 3 - sono tracciati rispetto NH 4 + e NO 3 - feComposizione ed in figura 3. Un semplice modello di regressione lineare è stato utilizzato per valutare l'importanza dei rapporti tra la rimozione delle specie N e la composizione dei mangimi 18-20. La rimozione di ammoniaca è stata osservata in tutte le gamme di NH 4 + e NO 3 - Composizione (Figure 3A e 3B Figura, rispettivamente). Né NH 4 + né NO 3 - composizione dell'alimentazione influenzato la rimozione di NH 4 + sulle condizioni testate (n = 44, p = 0,993 e n = 44, p = 0,610, rispettivamente). D'altra parte, la rimozione di NO 3 - è risultato essere correlato negativamente con NH 4 + composizione dell'alimentazione (n = 44, p = 0,000) (Figura 3C) e varia positivamente con NO 3 - composizione dell'alimentazione (n = 44, p = 0.000) (Figura 3D).

NO 3 - è stato osservato ad accumulare (negatrimozione ive) all'interno del reattore per la maggior parte delle composizioni influenti (34 su 44 campioni). NO 3 - rimozione è stata osservata solo quando le concentrazioni NH 4 + alimentazione erano al di sotto di 10 mg -NL -1 e NO 3 - Le concentrazioni di alimentazione sono stati superiori a 15 mg -NL -1. L'ossigeno, che viene aggiunto al reattore tramite aerazione nel serbatoio di riciclo esterno e dalle alghe, può servire come un accettore di elettroni per i batteri ammoniaca e nitriti ossidanti (AOB e NOB rispettivamente). Se le condizioni aerobiche dominano all'interno del reattore attraverso le portate di alta riciclo, i batteri che possono eseguire dissimulativo (eterotrofi) denitrificazione preferiranno utilizzare l'ossigeno come accettore di elettroni 4. Se il tasso di NO 3 - la produzione e l'input dal feed supera la conversione di assimilazione di NO 3 - azoto organico o denitrificazione dissimulativo, NO 3 - può 'accumulote nel reattore. La rimozione di NH 4 + e l'accumulo di NO 3 - suggerisce che AOB e NOB sono presenti e attivi all'interno della comunità come le alghe non sono noti per catalizzare la conversione di NH 4 + NO 3 -. Questi risultati dimostrano la possibilità di utilizzare questo sistema di reattori per studiare la dinamica di flusso di azoto e cinetica in una comunità algale-batterica mista.

Gli autori hanno mantenuto con successo le comunità algali sani in questi HDBRs per oltre un anno. Due arresti reattore, tuttavia, si sono verificati dall'inizio di questo progetto, sia come risultato di drastici cambiamenti alla composizione influente. Il primo è stato il risultato di una variazione dei rapporti di specie di azoto con il flusso totale di azoto mantenimento costante; NH 4 + è stato eliminato dal feed e NO 3 - le concentrazioni sono stati aumentati per compensare. Il secondo incidente si è verificato a seguito di cutting il flusso dell'azoto totale del 75 per cento, da 40 mg -NL -1 a 10 mg -NL -1 (Figura 4). In entrambi i casi è stata osservata bordo zona biomassa distinti a deteriorarsi nel corso di due o tre giorni in coincidenza con un forte aumento solidi sospesi nell'effluente (Figura 4). Effluenti solidi sospesi aumentata ad un massimo di 6 giorni dopo il cambiamento mangime reattore perso biomassa (Figura 4). Dopo l'incidente di solidi sospesi nell'effluente rimasta elevata (circa 0,22 g SS L -1) e nessuna nuova biomassa è stata osservata ad accumularsi all'interno del reattore, impedendo la continuazione dell'esperimento. Il disegno corrente manca di un meccanismo di sicurezza per trattenere culture se non rimangono ben-flocculazione.

Figura 1
Figura 1. Schema di un bioreattore ad alta densità (HDBR) (non to scala). Reactor (R) è composto da un 1.000 ml cilindro graduato con porte (portagomma, diametro esterno 3/8 "), installati presso i 100 ml e 1000 ml livelli. fluido del reattore viene pompato attraverso il reattore con pompa peristaltica A (PA), entrando nella parte inferiore del reattore e fluisce verso l'alto attraverso la zona di biomassa (BZ) verso la porta superiore. uscite fluido del reattore al porta superiore ed è diretto al serbatoio di riciclo (RT) per gravità. La RT composta da un bicchiere di vetro da 600 ml,. ha due porte installato, uno situato sul fondo del bicchiere e l'altro a fluido 500 ml marchio reattore viene restituito al reattore tramite la porta inferiore (e PA) foglie effluenti. il reattore tramite la porta superiore della RT e viene raccolta in un contenitore di rifiuti (W). aerazione diffusivo è previsto nel RT con l'uso di un aeratore (A). Il processo di aerazione aziona anche miscelazione all'interno del MV. pompa peristaltica B (PB) batte affluente da un serbatoio contenente avanzamento / influent (FT) nel RT.

Figura 2
Figura 2. Esempi di separazione fluido biomassa / reattore all'interno di un bioreattore ad alta densità (HDBR). Pannello A mostra una comunità algali ad alta densità (2,83 g SS L -1) viene coltivato all'interno di un HDBR. Un confine distinta si verifica quando la velocità di sedimentazione della comunità microbica fotosintetica supera quella del fluido del reattore. Pannello B mostra la matrice microbica formata da fango attivo nelle condizioni di riciclo discusse in vendite e Shieh (2006) 1. Pannello C mostra lievito in coltura su un influente composto di glucosio per la produzione di etanolo tramite fermentazione (risultati non pubblicati). In tutti questi tre configurazioni reattore progettazione romanzo reattore deve eliminated il bisogno di un chiarimento separato o processo di stabilirsi nel sistema del reattore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
. Figura 3 Illustrazione di NH 4 + e NO 3 -. Asportazione rispetto composizione influent concentrazione totale influent N è stata mantenuta a 40 mg -NL -1 per tutta la durata dello studio. (A) NH 4 + concentrazione nel mangime è tracciata contro la rimozione di NH 4 +; vi era alcun effetto significativo (n = 44, p = 0,993). (B) NO 3 - concentrazione nel mangime è tracciata contro la rimozione di NH 4 +; non vi era alcun effetto significativo (n = 44, p = 0.610).(C) NO 3 - rimozione è risultata significativamente e negativamente correlate a NH 4 + concentrazioni mangimi (n = 44, p = 0,000). (D) NO 3 - rimozione era significativamente e positivamente correlata alla NO 3 -. Le concentrazioni di avanzamento (n = 44, p = 0.000). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questo figura.

Figura 4
Figura 4. solidi Aumento effluente sospesi in risposta a diminuire in modo significativo il flusso di azoto attraverso il reattore. Tenore di azoto Influent è stata ridotta da 40 mg -NL -1 . 10 mg -NL -1 (al tempo 0 in questa figura, indicata anche con la linea verticale) Degrado della zona biomassa distinta è stata osservata dopo 2 giorni; dopo 3 giorni perdita di biomassa era facilmente osservabile. Un aumento significativo della SS effluenti è stata osservata dopo giorni dopo la modifica è stata emanata e massima SS effluenti avvenuta dopo 6 giorni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Micrografie evidenziando struttura porosa e floc incastro batteri filamentosi. Due Micrografie espositrici la struttura porosa formata da batteri eterotrofi (fanghi attivati). Batteri filamentosi colmare lo spazio tra fiocchi, incastro in fiocchi alla zona biomassa stabilizzata.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53443/53443fig5large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questa sezione inizia con una discussione di variazioni di protocollo necessari per affrontare eventuali questioni operative, nonché utilizzando diverse comunità microbiche. La forza di questo disegno reattore saranno discussi, tra cui la possibilità di governare il controllo del flusso di ossigeno e la formazione di fiocchi alta densità all'interno del reattore. Saranno inoltre menzionate le sfide attuali e le possibili vie di studio.

Protocollo sfumature e variazioni
Il funzionamento del HDBRs per la coltivazione di diversi tipi di colture richiede lievi variazioni protocollo operativo, a seconda della specie in esame. È necessario miscelazione sufficiente e l'espansione della zona biomassa algale per aumentare l'esposizione di tutte flocculi per illuminare e attivare la fotosintesi. Sospensione di biomassa algale all'interno del reattore è guidato da una combinazione di tasso di riciclo del reattore e velocità di miscelazione bar. Si deve prestare attenzione nella scelta delle caratteristiche di funzionamentodi entrambi, in modo tale che vi sia adeguata distanza tra la zona di biomassa algale biologicamente attivo e la porta nella parte superiore del reattore, come qualsiasi biomassa che lascia il reattore può essere perso nell'effluente attraverso la porta superiore del serbatoio di riciclo. Se la biomassa viene osservata lasciando nell'effluente, un filtro può essere montato alla porta superiore del serbatoio di riciclo. Un tappo di lana di vetro può essere utilizzato come filtro. Come il filtro si accumula biomassa avrà bisogno di essere cambiato. Se si usa un filtro, solidi sospesi campioni devono essere prelevati a valle del filtro in aggiunta al fluido del reattore nel serbatoio di riciclo per ottenere il corretto bilancio di massa; biomassa accumulata nel filtro deve essere rappresentato. In alcune condizioni di funzionamento con le alghe e lievito nella zona biomassa non sempre porta a liquido chiarificato, anche quando la comunità è sana. In questi casi vi è una sospensione diluita di cellule evidenti sopra della zona biomassa e nel serbatoio di riciclo. Noi hypothesize che nelle comunità algali e lievito che sono state coltivate in HDBR finora non contengono i batteri filamentosi a per il, interblocco zone stabile biomassa come visto in eterotrofi e la nitrificazione / denitrificazione colture batteriche (figura 5). Pertanto, se l'obiettivo è quello di impedire la fuoriuscita di cellule nell'effluente, come è il caso con alghe e lievito, può essere necessario utilizzare un dispositivo di filtrazione a membrana o al porto effluente.

Una fonte inaspettata di biomassa disturbo, che potrebbe influire negativamente la separazione solido-liquido del HDBR, è l'accumulo di bolle all'interno delle linee della pompa di riciclo. Queste bolle sono un prodotto di aerazione nel serbatoio di riciclo. Si deve prestare attenzione ad eliminare regolarmente eventuali accumuli di gas all'interno del tubo. Comprimendo il tubo nella direzione del flusso del fluido accelererà questo processo e serve anche per rimuovere qualsiasi biomassa che si è bloccata all'interno del tubo. Poiché le cellule in queste culture tendono ad aggregarsi in fiocchi, essi hanno anche una tendenza quando viene rilasciato dalla zona biomassa di aderire e colonizzare le pareti del HDBR. Pertanto, se gli investigatori notano l'adesione della biomassa alle pareti interne del serbatoio reattore e riciclo, si dovrebbe usare una pipetta o una spazzola vetro sterilizzate disturbare ed evitare un'eccessiva crescita biofilm sulle pareti del reattore.

Il protocollo sopra descritto deve essere modificato quando i microrganismi eterotrofi o nitrificanti / batteri denitrificanti sono la comunità di interessi. Per esempio, 4 g di microrganismi eterotrofi (misurato come VSS) è stato utilizzato per inizializzare il reattore, come descritto da vendite e Shieh 1. Quando si studiano ammoniaca e batteri ossidanti nitriti, 2 g di arricchito AOB / NOB è stato utilizzato come descritto nel Nootong e Shieh 2 e Ramanathan et al. 4, e sviluppato in appendice a quel manoscritto 21. La quantità esatta di inoculoper avviare il reattore può variare e veramente dipende dalla quantità di inoculo sorgente disponibile e il volume effettivo del reattore utilizzato. Per evitare perturbazioni biomassa, l'uso di una ancoretta è scoraggiato quando si utilizzano queste culture-mat formatura.

Manipolazione di caratteristiche idrauliche
Un vantaggio principale del disegno HDBR è la capacità di controllare le velocità di avanzamento e flusso di riciclo indipendentemente l'uno dall'altro. Gli investigatori possono indirizzare tassi di carico specifici, riciclare i tassi, o riciclare rapporti. Ad esempio, studiando le prestazioni del reattore utilizzanti fanghi attivi per rimuovere COD dalle acque reflue sintetica, il rapporto di riciclo variato 3,5-21,5 1. Gli studi iniziali del reattore utilizzando nitrificanti autotrofa / batteri denitrificanti hanno indicato che le zone di biomassa stabili potrebbero essere mantenuti in rapporti di riciclo di 2,5-24,3 3. Queste stime hanno dimostrato di essere conservatore come sono stati riscontrati problemi quando si aumenta riciclo ratios fino a 43 in uno studio di follow up 21. La capacità di operare ad alti rapporti di riciclo, e quindi alti tassi di riciclo, è utile per studiare gli effetti del taglio fluido sulla stabilità e le caratteristiche della zona biomassa. In alcuni casi, come ad esempio la coltivazione delle alghe, la creazione e il mantenimento di una matrice biomassa non è un requisito e alti tassi di riciclo e di livello sono necessari per assistere la sospensione della colonna algale. Questo disegno reattore è in grado di facilitare la sospensione assistito da tassi elevati di riciclo (49.3 in questo studio), a condizione che gli investigatori sono in grado di mantenere una distinta interfaccia biomassa / effluente all'interno del reattore. Nei casi in cui il rapporto di riciclo è elevata, le caratteristiche idrauliche del reattore dell'intero sistema HDBR comportano più simile a completamente reattori misti (CMFR) rispetto ad un reattore a flusso a pistone (PFR), e permette quindi l'investigatore esaminare culture su uno spettro di idraulica caratteristiche di mescolamento in un unico sistema di riciclo a portataLSO gioca un ruolo nel flusso, trasferimento di massa, e la distribuzione delle specie gassose disciolte in tutto il reattore, come descritto di seguito.

Controllo di O 2 flusso da e degasaggio nel serbatoio di riciclo
Studiando processi nitrificazione / denitrificazione combinati, sono state osservate concentrazioni di ossigeno disciolto deve essere rapidamente impoverito nelle porzioni più basse della zona biomassa attivo come nitrificazione stata effettuata 2-4, parallelo precedenti studi rimozione COD 1; questo può suggerire che il regime di flusso all'interno del flusso biomassa assomiglia a quella di un PFR 1. Con la zona superiore biomassa diventare anossica, denitrificazione è stata effettuata, con la conseguente eliminazione dell'azoto disciolto dal 2,3 effluente del reattore. Queste osservazioni dimostrano che la combinazione di aerazione esterna nel serbatoio di riciclo, in combinazione con la capacità di controllare il flusso di ossigeno al serbatoio upflow, tramite manipolazione del riciclorate, consente gradienti di ossigeno per sviluppare all'interno flocculi e lungo la lunghezza della zona di biomassa, consentendo aerobici, anaerobici e anossici reazioni a verificarsi in un unico serbatoio. Come molte reazioni di pulizia biologica dipendono o sono inibiti dall'ossigeno, questo reattore permette un modo più semplice per controllare i tassi di massa di ossigeno in bioreattori; possibilmente consentendo pratiche di aerazione più efficiente. Come aerazione è uno dei più alti costi energetici trattamento delle acque reflue, questo può servire a ridurre i costi operativi per i comuni 22,23.

Il controllo del flusso di ossigeno attraverso un reattore non è solo una preoccupazione per i batteri eterotrofi e chemioautotrofi. Energia di eccitazione in eccesso (EEE) è la algale surplus di energia luce le cellule sono esposte a, e si traduce in ossigeno (O 2) è ridotto a superossido (O 2 -) con gli elettroni in eccesso deviati dal fotosistema I o II (PSI e PSII) 24. Anioni superossido possono causare significant danni fisiologici nei sistemi algali. Esiste un quadro cellulare per individuare e neutralizzare O 2 - prima che il danno può verificarsi a componenti cellulari, ma in cellule altamente stressate specie reattive dell'ossigeno (ROS) può ancora formare 24-28. Controllando la velocità di ricircolo e l'aerazione nel serbatoio di riciclo, gli investigatori potrebbero essere in grado di affrontare i problemi derivanti da eccesso di ossigeno e la tossicità può indurre in colture algali, e possono aumentare ulteriormente la crescita di alghe in colture ad alta densità, in particolare nei casi dove la luce supplementare viene fornito mediante l'utilizzo di lampade.

Formazione di fiocchi e / o zona biomassa porta a macro diverse e microambienti
Una delle caratteristiche più uniche di questo disegno reattore è l'eliminazione di un serbatoio chiarificatrice. Ipotizziamo che la buona separazione solido-liquido che si ottiene in HDBRs può essere attribuita a formazione di flocculi alta densità (cioè, lacaso con alghe), o la formazione di una stalla, matrice porosa di fiocchi incastro e microrganismi filamentosi lungo (cioè, con il eterotrofi e nitrificanti / denitrificanti culture) 1-4,7,16 (Figura 5). La formazione e la stabilità di fiocchi dipende da un certo numero di caratteristiche fisiche, chimiche e fattori biologici 7,13,29-31. Infatti, la formazione di fiocchi è l'obiettivo primario di start-up e dipende sufficiente miscelazione (forza di taglio gradienti) per aumentare collisioni tra i sospesa inoculante 13,30 ma anche dalla presenza di ben flocculanti microrganismi che producono composti (flocculanti ) che consentono alle cellule di aggregare 31,32. In questi reattori scala di laboratorio, abbiamo trovato che la miscelazione sufficiente per flocculazione può essere eseguita dal profilo di velocità dall'alto o un dispositivo di miscelazione, ad esempio una ancoretta, situata nella parte inferiore del reattore. Per colture che necessitano di ossigeno, il serbatoio di riciclo esterno può be utilizzato come un serbatoio di trasferimento gas esterno (sia per l'aerazione o strippaggio di gas, ad esempio per la rimozione di ossigeno prodotto dalle reazioni fotosintesi). Il vantaggio di aerazione esterna impedisce eccesso miscelazione e bolle d'aria venga a contatto con fiocchi e rompendo loro parte. In alcuni casi, con le colture eterotrofi e nitrificanti / denitrificanti che formavano una stalla, matrice porosa, quando sono stati trovati per entrare nel reattore si trovassero spezzando parti della matrice o diventare trascinato all'interno delle sezioni della matrice causando loro di bolle di gas galleggiare all'inizio del reattore. Pertanto, il funzionamento del serbatoio trasferimento di gas esterno per evitare bolle nel reattore tramite la linea di ricircolo è fondamentale per mantenere una buona separazione solido-liquido del sistema.

Potenziali indicazioni HDBR
Studi reattore da banco, in particolare quelli destinati alla PBR, sono spesso focalizzate verso la raccolta dei dati cinetici per un particolare microspecie BIAL o comunità 1,3,4,33,34. Storicamente molti studi vengono effettuati su colture algali axeniche o antibatterici trattati nonostante crescenti prove dell'importanza di interspecie interazioni tra alghe e comunità batteriche 35,36. Studi di colture miste promettono di produrre conclusioni nuove e penetranti su come queste relazioni interspecie lavorano 35-38. Recenti studi di culture miste si è ampliata per includere l'analisi del campione con gli strumenti di biologia molecolare come la reazione a catena della polimerasi (qPCR) per quantificare alghe e la crescita batterica tassi 33,34. Analisi metagenomica e metatranscriptomic è stato utilizzato per chiarire ulteriori informazioni su come alghe e batteri interagiscono sia in ecosistemi artificiali e naturali 39,40. Oltre alle indagini molecolari delle colture microbiche in HDBRs, studi di microscopia esaminare la dimensione, la struttura e l'organizzazione dei fiocchi e la matrice porosa biologica delzona biomassa potrebbe fornire preziose informazioni sulla capacità HDBRs di promuovere la buona separazione solido-liquido.

Finora, solo una piccola gamma di volumi di reattori e di rapporti di riciclo sono stati studiati con il design HDBR. Come tale, le prestazioni dei reattori per applicazioni in scala up è attualmente sconosciuto. Ciascuno dei sistemi di reattori testati sono meno di 2 L di volume e composto di vetro. Poiché questi reattori non sono spenti i componenti scaffale e devono essere costruiti da uno specialista vetreria di laboratorio aumenta la dimensione dei reattori in vetro può essere difficile in quanto i pezzi di partenza devono essere attentamente selezionati per lo spessore della parete del caso (la corrispondenza privata: K. Carraro, 2014). Grande vetreria corre anche un rischio più elevato di essere rotto o danneggiato in confronto con un metallo, plastica, o reattore calcestruzzo. Costruire reattori più grandi con metallo o plastica per esperimenti da banco può essere un'opzione, ma la vitalità di questa opzione è ancora da indagare. Inoltre tha uso di materiali opachi o traslucidi possono ostacolare l'osservazione visiva dei reattori in esame e complicherebbe il funzionamento di questi reattori in una configurazione PBR.

Questo manoscritto ha delineato le montaggio, messa in servizio, e le procedure operative per operare un bioreattore ad alta densità (HDBR). Il lavoro precedente ha stabilito la capacità HDBRs per rimuovere sia COD e specie azotate utilizzando batteri eterotrofi e chemioautotrofi 1-4. Qui gli autori dimostrano la capacità di HDBRs per la coltura di alta densità comunità algali e la rimozione delle specie azotate da un flusso di rifiuti sintetici. A seguito delle osservazioni precedenti, una zona di biomassa stabile era formata da alghe, e buon funzionamento del reattore senza un processo di chiarimento è stato raggiunto durante la rimozione di 18,4% del totale delle specie azotate dalla influente. La conversione tra le specie di azoto (NH 4 + NO 3 -) è stata osservata, permettendogli autori a suggerire la presenza e l'attività di AOB e NOB. I risultati presentati in questo manoscritto dalla dimostrazione corrente con alghe e studi precedenti che utilizzano il sistema di supporto ulteriore utilizzo HDBR, nonché ricerca e sviluppo, di questo disegno reattore per alta densità coltura di microrganismi per una varietà di applicazioni ambientali e industriali.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aeration stone Alita AS-3015C
Aerator Top Fin Air-1000
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434
Anion analysis column Shodex IC SI-52 4E
Beaker (600 ml) Corning Pyrex 1000-600 Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 ml levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670
Cation analysis column Shodex IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 222011
Ferric chloride Sigma Aldrich 157740
Filter (vacuum) Fisherbrand 09-719-2E 0.45 μm membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1,000 ml) Corning Pyrex 3025-1L Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 ml, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC Shimadzu Prominence
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M2643
Masterflex L/S variable speed drive Masterflex 07553-50 Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate Sigma Aldrich N6136
Potassium nitrate Sigma Aldrich P8291
(Monobasic) Potassium phosphate Sigma Aldrich P5655
Pump head Masterflex 07018-20 Recycle pump head
Pump head Masterflex 07013-20 Feed pump head
Pump tubing Masterflex 6404-18 Recycle pump tubing
Pump tubing Masterflex 6404-13 Feed pump tubing
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251

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References

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