Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Chemistry

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Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

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Abstract

Introduction

Colonne di tecnologia di flusso attivo

Tecnologia di flusso attivo (AFT) colonne di cromatografia sono stati recentemente sviluppati per superare inefficienza in separazioni associati al flusso di eterogeneità 1-6 e anche per consentire il rilevamento multiplex. In questa particolare comunicazione abbiamo dettaglio il processo operativo del parallelo segmentato di flusso (PSF) colonna con rilevazione multiplex. I vantaggi funzionali chiave della colonna PSF sono: (1) il flusso dalla regione centrale radiale del letto della colonna è isolata dalla regione periferica o parete di flusso, (2) il volume di fase mobile che deve essere elaborata da una rilevazione fonte è ridotta, e le fonti (3) di rilevazione può essere canalizzato per espandere le informazioni campione senza instillare ritardi di rilevazione attraverso ogni processo di rilevamento, o successivamente che richiede la suddivisione di un flusso di corrente post-colonna 7,8. La caratteristica fondamentale nella progettazione della colonna PSF che consente undvantage di rilevamento multiplato è romanzo presa assieme raccordi e fritta. la figura 1 è una fotografia della colonna AFT rispetto ad una colonna convenzionale. È importante comprendere che il processo di scissione ottenuta utilizzando colonne flusso segmentato parallele non è la stessa corrente di flusso post-colonna splitting. In un flusso di flusso della colonna montante dividere l'intera banda campione dal bordo anteriore alle estremità della coda viene campionato ugualmente (cioè, assialmente), in tal modo, ogni flusso flusso è uguale rispetto all'efficienza e sensibilità; l'entità della sensibilità quindi diviso per le spaccature numerici. In PSF, tuttavia, i campioni processo di scissione banda radialmente, non assialmente. Come tale, i campioni delle porte centrali all'apice del picco - la regione più concentrata del picco. Così, la sensibilità ecco alto come il picco non è diluito dalla regione diffusa tailing. Il campione eluendo dalle porte periferiche non è così efficace come nel centrazona l, ma, dal momento che la banda viene campionato radialmente, piuttosto che assialmente, la larghezza del picco è più stretto sarebbe il caso di un processo di campionamento che divide il picco in direzione assiale, cioè, una scissione post-colonna. Quindi la sensibilità con un rivelatore dipendente dalla concentrazione non viene ridotta.

Nella colonna PSF, il raccordo di uscita comprende più porte di uscita ed all'interno di questo raccordo terminale è alloggiato un setto anulare. La parte interna di questo fritta canali anulari fuoriuscire colonna mediante la luce radiale scarico centrale, mentre la porzione radiale esterna dei canali di uscita di fritta fluire dalla colonna tramite le porte di uscita dell'aria periferiche o regione di parete. Le porzioni interna ed esterna della fritta di uscita sono separati da una barriera impermeabile che impedisce il flusso di mezzo tra queste regioni di flusso 2. Come conseguenza di questo disegno flusso centrale flusso radiale attraverso il letto colonna viene separato dal flusso ins regione pareteide colonna. La porzione relativa di flusso da queste due regioni può essere variata a quasi qualsiasi rapporto desiderato attraverso la gestione della pressione al fine di ottimizzare vari aspetti funzionali della tecnologia delle colonne, come l'efficienza di separazione o la sensibilità di rilevazione. In sostanza, questo disegno stabilisce in modo efficace all'interno del formato più grande colonna di una colonna 'virtuale', con un diametro interno più stretto, e quindi alle funzioni per le colonne come una colonna muro-meno vero, superando colonna letto eterogeneità e gli effetti a parete 9,10.

I principali vantaggi di colonne PSF sono miglioramenti dell'efficienza colonna, la minimizzazione del trattamento solvente per la sorgente di rilevamento (s) e consentendo il rilevamento multiplexati. Tuttavia, un ulteriore vantaggio è che, poiché il tailing e regioni fronteggia di qualsiasi banda vengono rimossi dalla eluizione complessiva profilo soluto a eluizione o rilevamento è presente in concentrazione superiore rispetto verrebbero altrimenti osservati per gli stessi solute iniezione e concentrazione di carico su una colonna convenzionale, a seconda del rapporto di segmentazione impiegato. Di conseguenza vi è spesso osservato un aumento di intensità del segnale per le separazioni condotti su colonne PSF 2. Infatti, se il rapporto segmentazione è regolato in modo che il 25% delle uscite portate da ciascuna delle quattro porte di uscita, l'intensità del segnale che si osserva con ultravioletti (UV) di rilevamento mostra praticamente la stessa intensità di segnale come risulta utilizzando un convenzionale colonna in cui tutto (100%) della fase mobile viene analizzata 7. Inoltre, la messa a punto del rapporto di uscita tra le regioni centrali e del flusso a parete permette l'efficienza della colonna da ottimizzare. I guadagni di efficienza colonna osservati utilizzando colonne AFT non può essere indicato un singolo valore, poiché questi guadagni di efficienza sono una funzione di tre fattori: (1) la portata, (2) il rapporto di segmentazione, e (3) il fattore di ritenzione del soluto . Tuttavia, guadagni di efficienza rispetto a convcolonne entional sono quasi sempre osservati, e talvolta questi guadagni sono più di 100% del numero di piatti teorici 1,2. La possibilità di regolare il rapporto di segmentazione permette l'analista di adattare efficacemente il diametro della colonna 'virtuale', e questo è un fattore importante in relazione al processo di rilevamento. Ad esempio, un diametro (id) colonna virtuale 2.1 mm interno è stabilito da un 4.6 mm di colonna id fisica quando il rapporto segmentazione è il 21% della fase mobile eluizione dalla luce radiale uscita centrale. In queste condizioni, il 2.1 mm colonna id virtuale esegue con un'efficienza che può essere superiore al 70% maggiore della 2.1 mm di colonna id convenzionale, a seconda della portata, e soluti coefficiente di conservazione 10.

La colonna disegno PSF corrente che viene utilizzato per il rilevamento multiplato incorpora una porta raccordo di uscita 4, ma la colonna può essere dotato di un 2-port end-montaggio anche, tuttavia, questo limita rilevamento to solo due rivelatori. Il funzionamento di base di queste colonne è, tuttavia, lo stesso, eccetto che quattro rivelatori possono essere accoppiati simultaneamente alla presa PSF colonna 4-port ampliando le possibilità di rilevamento multiplexati. Oltre a colonna tubo connettivo pre e post, gli unici requisiti supplementari per operare una colonna PSF è tubo che possono essere collegati alle porte di uscita periferici, e un mezzo con cui la quantità di fase mobile passa attraverso ciascun tubo può essere misurata, generalmente è una misura di massa o di una misurazione volumetrica. Per facilità di sintonizzazione, il diametro interno del tubo di flusso in uscita tutti dovrebbe essere lo stesso. Il rapporto di flusso tra le aperture di uscita centrali e periferiche radiali viene quindi variato attraverso l'utilizzo di gestione della pressione, semplicemente cambiando la lunghezza del tubo si trova alla uscita periferica raccordo, o la lunghezza del rilevatore tubo posto sulla porta radiale uscita centrale.

Multiplex Detection Uso di colonne PSF

Un importante vantaggio di colonne FPF è che ciascuna delle aperture di uscita di uscita può essere collegato direttamente a una sorgente di rilevamento, consentendo così la rilevazione multiplexati. In un sistema di rilevamento ben progettato una singola analisi con rilevamento multiplato può fornire informazioni sostanziali per quanto riguarda la natura dei componenti all'interno del campione. È importante sottolineare che prove distruttive e non distruttive possono essere condotti esattamente nello stesso momento, senza ritardo di rilevamento. Questo consente l'assegnazione di assoluto, ad esempio, antiossidanti utilizzando DPPH reagente, con componenti osservate per eluire con la spettrometria di massa (MS) risposte di rilevamento 7,11 UV e / o. Pertanto, quattro rivelatori indipendenti possono essere azionati simultaneamente con porzioni appropriate di flusso diretto di ciascun rivelatore attraverso uno dei quattro fori di uscita. Poiché il flusso attraverso queste porte può essere facilmente regolata la quantità di soluto raggiungere qualsiasi dei rilevatori può essere regolata per adattarsila sensibilità del rilevatore data sorgente. Va notato, tuttavia, che la migrazione soluto più efficiente è osservata attraverso la porta di uscita centrale radiale. Ciascuna delle porte periferiche offrono efficienza di separazione equivalente, che se impostato al 25% attraverso ogni porta, è solo leggermente meno efficiente di una colonna convenzionale. Come tale, è importante che il rivelatore quantitativa essere impostato per analizzare campione dalla luce radiale uscita centrale.

Quando si imposta una colonna PSF ai fini della rilevazione multiplexing ci sono una serie di considerazioni che devono essere fatte per ottenere risultati efficaci e di alta qualità; cioè dimensioni del tubo per ciascuna porta, scelta di quale porta per un tipo di rivelatore e regolazione del flusso.

Dimensioni del tubo per ogni porta

Nella cromatografia la lunghezza della tubazione della colonna montante svolge un ruolo cruciale nella efficienza e il rendimento della separazione. Grande Dead-volume come risultato di tubazione lunga o larga id dalla colonna di uscita al rilevatore si tradurrà in una perdita di efficienza, risoluzione e sensibilità. Così, adeguate dimensioni tubi devono essere utilizzati quando si imposta la colonna di PSF di raggiungere il massimo potenziale nella fornitura di separazione efficiente mentre fornendo i benefici di multiplexing.

Porta a Detector

La figura 2 è una illustrazione di un esempio di configurazione di rilevazione multiplex (Ultra Violet-visibile (U-Vis), spettrometro di massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH •) di rilevamento). L'illustrazione mostra il porto centrale è collegata al rivelatore MS, mentre il DPPH e rivelatori UV-Vis sono attaccati alle porte periferiche. Poiché la MS è il rivelatore più sensibile dei tre, flusso di questo rivelatore è stato diretto dalla luce di uscita centrale. Come DPPH • Rilevamento è selettivo alla Presence di antiossidanti, e la meno sensibile e più tollerante a banda allargamento, affluiscono a questo rivelatore è stato diretto da una porta periferica. L'UV-Vis è un rivelatore secondaria 'generico', quindi fluire verso questo rivelatore è diretto da una seconda porta periferica.

Regolazione del flusso

Una volta che il tubo appropriata è stata collegata da una porta per rilevatore, la portata in uscita da ciascuno dei rivelatori può essere regolata al valore desiderato. Un modo semplice per misurare la quantità di portata in uscita ogni rivelatore è di valutare la quantità di fase mobile che eluisce attraverso ogni porta in un dato periodo di tempo. Il flusso percentuale può così essere determinato, ed i rapporti di flusso può essere regolato sia accorciare o allungare il tubo attaccato alla linea di uscita sui rivelatori di conseguenza per soddisfare le esigenze dei rivelatori di scelta. Diversi rivelatori hanno differenti esigenze di portata, per esempio, la cella di flusso diun rivelatore a fluorescenza (FLD) non viene portata limitata, ma la cura deve essere presa per evitare un eccesso di pressurizzazione della cella di flusso. Quindi il controllo del flusso attraverso il FLD è spesso ottenuta regolando la caduta di pressione attraverso gli altri rivelatori e il resto del flusso quindi attraversa il FLD. Un rivelatore sensibile alla quantità di flusso che viene consegnato è il MS. In generale, le attuali spettrometri di massa di fascia alta possono facilmente elaborare circa 1 a 1,5 ml / min di moderata acquosa fase mobile. Sopra tale portata, allagamento della sorgente può rendere i MS inutilizzabile. Tuttavia, la sensibilità di rilevazione nella maggior parte dei spettrometri di massa è beneficiato utilizzando portate inferiori; quindi le capacità di suddivisione dei flussi FPF sono estremamente utili per applicazioni che prevedono il rilevamento MS. Colonna alta flussi volumetrici possono essere utilizzati, ma con carichi bassi volumi trasportati al rivelatore MS. Regolazione del flusso al rivelatore MS, tuttavia, deve essere effettuato regolando la caduta di pressione primaMS rilevatore, piuttosto che pubblicare MS. Qui, l'uso di un tubo del diametro ristretto (0,1 mm id) è molto utile, come la pressione può essere facilmente regolata senza aggiungere volume morto appropriato.

A seconda del tipo di sensore della regolazione del rapporto di segmentazione può essere fatto rivelatore sia pre o post. Se un rilevatore non distruttivo, come viene usato UV-Vis, la percentuale di flusso sarebbe misurata e sintonizzato rilevatore postale. Se un singolo rivelatore distruttivo è utilizzato nel multiplex impostare la percentuale di flusso è determinato calcolando indietro rispetto ad altre percentuali di flusso porta. Se un rivelatore basato reagente viene utilizzato come DPPH la percentuale portata viene misurata rilevatore post senza l'aggiunta di reagente; e se si utilizzano due o più rivelatori distruttive, allora il rapporto portata viene misurata pre-detector. Detection sistemi che possono richiedere strumentazione aggiuntiva, come DPPH •, avrà pressione di sistema supplementari che possono alterare il flussopercentuale volta collegato al sistema di rivelazione. Pertanto, un attento esame deve essere rivolta alla pressione del sistema di un rivelatore distruttivo, quando si regola la percentuale di flusso pre-detector. Indipendentemente dal rapporto portata impostata attraverso una delle porte, informazioni quantitative dovrebbe essere ottenuto tramite la normalizzazione appropriata. Una volta che i rapporti di flusso sono impostati, tuttavia, sono robusti, e non cambiano anche in condizioni di eluizione a gradiente 7,

Il protocollo video dettagliato che accompagna questo manoscritto ha lo scopo di mostrare come utilizzare e ottimizzare un funzionamento colonna di PSF in una modalità multiplex di rilevamento.

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Protocol

Nota: Questo protocollo contiene le istruzioni su come utilizzare una colonna di PSF in un sistema HPLC accoppiato con più rilevatori per il rilevamento multiplex. Il protocollo è stato scritto assumendo che il lettore abbia una conoscenza di base ed esperienza in cromatografia e diversi metodi di rilevamento HPLC.

Attenzione: Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell'uso (ad esempio, scheda di sicurezza per metanolo). Garantire l'uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si maneggiano i solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) eluente. Garantire un uso appropriato di misure tecniche di HPLC, analitico equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l'uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse).

1. Configurazione dello strumento HPLC

  1. Preparare lo strumento HPLC con acqua ultrapura (ad esempio, 100% acqua Milli-Q) per line A e 100% di metanolo per la linea B come fase mobile e spurgare le pompe secondo il requisito produttore. Se uno dei rivelatori usati è MS, come qui, aggiungere 0,1% di acido formico per entrambe le fasi mobili A e B.
  2. Impostare la HPLC componenti e rivelatori strumentali come illustrato in figura 2. Ciò richiede comoda posizione dei rivelatori relativi alla colonna in modo da ridurre al minimo il volume morto tra il rivelatore e colonna. La flessibilità nella configurazione del sistema HPLC è desiderabile.

2. Configurazione di UV-Vis e rivelatori MS

  1. Impostare il rivelatore UV-Vis per la lunghezza d'onda desiderata in base al campione di interesse (ad esempio, 280 nm).
  2. Impostare il rivelatore MS in modalità positiva per il conte Total Ion (TIC) analisi con il metodo di rilevazione Scansione completa. Anche regolare i seguenti parametri: MS conseguenza vaporizzatore temperatura 500 ° C, temperatura di 350 ° C capillare, gas guaina fissato a un tasso di 60 unità, il flusso di gas ausiliario40 e spazzare flusso di gas a 5 unità, e la tensione a spruzzo 3.5 kV. Queste impostazioni possono essere regolate in seguito per esigenze specifiche degli utenti dipendenti del campione analizzato.

3. Preparazione del 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl Radicale (DPPH •) reagente Configurazione di DPPH sistema di rilevazione

  1. Pesare 25 mg di DPPH e sciogliere in 250 ml di metanolo in un pallone tarato.
  2. Aggiungere 250 ml di acido formico per il DPPH reagente. Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
  3. Sonicare il pallone contenente il DPPH reagente per 10 min.
  4. Spurgare il DPPH pompa con il preparato DPPH reagente secondo il requisito del produttore.
  5. Impostare il sistema DPPH secondo la figura 2 collegando la linea di pompa all'ingresso di un T-pezzo.
  6. Allegare una bobina reazione microlitri 100 a the uscita del raccordo a T e collegare l'altra estremità della bobina reazione al rivelatore.
  7. Encase la bobina di reazione in un riscaldatore colonna e impostare la temperatura del riscaldatore colonna 60 ° C.
  8. Impostare il DPPH rivelatore UV-Vis a 520 nm.

4. Configurazione di FPF Colonna

  1. Collegare l'ingresso della colonna PSF allo strumento HPLC.
  2. Collegare la porta centrale per il rivelatore MS, utilizzando una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
  3. Collegare una porta periferica al rivelatore UV-Vis con una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
  4. Collegare un'altra porta periferica alla T-pezzo del sistema di rilevamento DPPH usando una lunghezza di 15 cm di 0,13 mm id tubo.
  5. Bloccare la porta periferica non utilizzata con un tappo di colonna.
  6. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea B - 100% metanolo (0,1% di acido formico).
  7. Equilibrare la colonna con il 100% di metanolo cellulare phase per 20 minuti per un 4,6 millimetri id x 250 mm di lunghezza della colonna. Questo tempo è scalato in base alle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.

5. Mettere a punto il Colonna FPF per la rilevazione Multiplexed

  1. Misurare la massa di almeno due recipienti di raccolta vuoti (uno per la porta collegata al rivelatore UV-Vis e uno per il DPPH detector) usando una bilancia analitica.
  2. Raccogliere fase mobile dalla UV-Vis e le porte DPPH in due, recipienti separati di raccolta pre-pesati (5.1). Registrare il periodo di tempo per la raccolta. Raccogliere almeno 500 mg di solvente in ciascun recipiente.
  3. Pesare i vasi di raccolta e determinare la massa di fase mobile. Data la densità del metanolo è 0,791 g ml -1, determinare il volume di fase mobile raccolti da ciascuna porta.
  4. Per differenza, cioè, pompa portata nominale impostato meno la portata attraverso il DPPH e UV-Vis Detectoluci di flusso r, determinano la portata al rivelatore MS. Esprimere ogni proporzione flusso come percentuale del flusso totale.
    Nota: Idealmente, le percentuali di flusso: la MS è 18% della portata totale, al UV-Vis 22%, al DPPH rilevatore 60%.
  5. Altrimenti, regolare le percentuali di flusso cambiando la contropressione sul rivelatore UV-Vis. Ad esempio, se il flusso di UV-Vis è troppo elevata, ridurre la proporzione aggiungendo aggiungere una sezione 15 cm di 0,13 mm id tubo all'uscita del rivelatore UV-Vis. Quindi ripetere i passaggi da 5.1 a 5.5.

6. finali condizioni di impostazione

  1. Impostare la portata della pompa DPPH reagente la stessa portata in uscita dal foro d'uscita collegato al DPPH rilevatore.
    Nota: La colonna PSF multiplex con UV-Vis, DPPH e MS è ora pronto per l'analisi.

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Representative Results

Una analisi HPLC multiplexed è stata effettuata utilizzando una colonna AFT in modalità PSF (Figura 1) e configurato come illustrato nella figura 2. Questo tipo di configurazione ha permesso un campione di caffè da analizzare simultaneamente utilizzando UV-Vis, DPPH e MS in totale Count Ion modalità (TIC). I composti del campione caffè che ha risposto a DPPH potrebbero quindi essere facilmente abbinati agli UV-Vis e MS - risposte TIC basati sull'allineamento del tempo di ritenzione, come illustrato in figura 3, dal momento che i cromatogrammi sono stati registrati simultaneamente. Quando una risposta positiva è stata osservata dal rivelatore MS-TIC, la massa molecolare del picco è stato registrato. Tabella 1 elenca i tempi di ritenzione dei DPPH picchi, e la risposta di tali picchi in UV-Vis e / o MS rilevatore, che pertanto previsto la massa molecolare. La facilità in corrispondenza picchi tra i processi di rilevazione diverse consentito per afmodulo ast e più efficiente di screening e caratterizzazione di un campione complesso, come il caffè.

Figura 1
Figura 1. L'immagine di colonna Attivo Flow Technology rispetto ad una colonna convenzionale. La colonna AFT è dotato di un raccordo di uscita quattro porte che ospita la fritta anulare consentendo picco campionamento attraverso la sezione trasversale radiale di una banda di esempio. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Un esempio illustrazione di un accordo di HPLC multiplex, utilizzando una colonna PSF con DPPH •, rivelatori MS UV-Vis e. Ogni Detecto r è collegata a una porta di uscita separata. In questo caso l'MS viene utilizzato per la quantificazione ed è impostato per raccogliere campioni dalla luce radiale scarico centrale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. I cromatogrammi di un campione caffè analizzato mediante un sistema HPLC multiplato, utilizzando una colonna PSF con DPPH •, UV-Vis e rivelatori MS: (a) DPPH 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Ogni traccia rivelatore è perfettamente coincidenti nel tempo, in modo che nessun regolazione dell'offset è necessaria al fine di compensare il tempo morto tra ogni rivelatore.Arget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

">
Caffè DPPH risposta di picco e di massa
DPPH Picco Tempo di ritenzione DPPH UV-Vis MS - TIC Risposta Massa
(min) Risposta Risposta
1 6.74 123.84
2 </ td> 7.54 125.83
3 8.94 No No -
4 10.05 No 135.83
5 13.15 No No -
6 16.22 No No -
7 18.14 126.82
8 19.4 162,81
9 20.46 187,89
10 24.71 162,81
11 26.27 162,8
12 26.97 194,87
13 31.84 162,8
14 32.02 162,78
15 32.56 176,82
16 33.94 176.83
17 41.26 No -
18 42.72 No 284,93
19 46.07 190,83
20 49.21 162,75

Tabella 1. Rilevato DPPH picchi di risposta ai raggi UV-Vis e MS - TIC.

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Discussion

Questo studio riguarda la caratterizzazione e la profilazione di caffè con HPLC con rilevamento multiplex impiegando una colonna parallela del flusso segmentato (FPF). Multiplexed HPLC utilizzando colonne PSF consente la caratterizzazione e identificazione di entità chimiche fondamentali riducendo la complessità dei dati del campione mentre ottenere un maggior grado di informazione specifica molecola in una frazione del tempo necessario utilizzando processi multi-rilevamento convenzionali. La colonna PSF permette non solo una piattaforma per il rilevamento multiplexed, ma anche la combinazione di entrambi i rivelatori distruttive e non distruttive, senza volume nocivo addizionale e il tubo. DPPH, UV-Vis e MS (TIC) sono multiplexati per l'analisi di caffè espresso.

Una colonna PSF 4 porte è stato utilizzato per l'analisi multiplex di caffè con i tre diversi rilevatori. La porta centrale all'uscita della colonna PSF era collegata al rivelatore MS e due del threporte periferiche e sono collegati a un sistema di rilevazione DPPH o un rivelatore UV-Vis. La terza porta periferica non è stato utilizzato e quindi bloccato con un tappo di colonna, ma questo potrebbe essere usato per la raccolta di campioni, o per un altro rivelatore. Il processo di ottimizzazione di questo set multiplex up era specifica per il rilevatore, dove la misurazione del flusso di segmentazione si è verificato dopo il rivelatore per DPPH sistemi di rilevazione UV-Vis e. Poiché la MS è un rivelatore distruttiva, la percentuale di flusso è stata determinata per differenza (portata nominale totale meno il flusso dalle altre porte di uscita).

In questo studio, l'analisi caffè con il DPPH reagente ha provocato 20 picchi ben risolti, di cui 13 anche mostrato una risposta nei rivelatori UV-Vis e MS. La figura 3 confronta cromatogrammi ottenuti da ciascun rilevatore. Ci sono quattro regioni che hanno lo stesso profilo cromatografico all'interno di ciascuncromatogramma, indicato dalle caselle rosse. In queste caselle, dove UV-Vis e MS ha mostrato poca risposta a questi composti, c'è stata una forte risposta da parte DPPH rivelatore. Quattro componenti che hanno risposto al DPPH reagente non sono stati rilevati mediante rivelatori UV-Vis o MS e tre i componenti che hanno risposto al DPPH reagente dato alcuna risposta UV-Vis o MS affatto. La massa molecolare dei componenti che hanno risposto alle MS sono registrati nella Tabella 1. Il componente che eluito a 10 min avuto un forte DPPH risposta, con nessuna risposta dal rivelatore UV-Vis e solo una piccola risposta dal rivelatore MS .

L'accoppiamento di una colonna AFT in modalità FPF ha dato la possibilità di eseguire più rivelatori in modalità multiplex, dove sono stati eseguiti simultaneamente tutti i rilevatori a prescindere di requisiti HPLC-rivelatore in una singola iniezione e la separazione di questo complesso sample. Il multi-port fine progettazione montaggio della colonna AFT offre il vantaggio di fornire opportunità per i processi di rilevamento multiplexing, ottenendo informazioni dettagliate del campione e l'affidabilità assoluta nell'assegnazione di componenti tra ogni modalità di rilevamento. Rilevazione Multiplexed con colonne di FPF ha fornito una grande quantità di informazioni sul campione, tre rivelatori gestite contemporaneamente entro il tempo di funzionamento richiesto per un singolo rivelatore. La corrispondenza esatta di tempo di ritenzione dei picchi all'interno di ogni modalità di rilevazione è stato possibile. Due dei rivelatori utilizzati erano rivelatori distruttivi.

Le capacità di multiplexing di una colonna PSF è tuttavia limitato dai componenti strumentali HPLC disponibili e strumentazione di rilevamento. La tecnica richiede più metodi di rilevazione e le necessarie componenti aggiuntivi per ogni specifica modalità di rilevazione, ad esempio, pompe, bobine di reazione, riscaldatori ecc Il vantaggio principale di rilevamento multiplexing utilizzando una colonna PSF è la reduction in tempo di analisi fino a quattro volte (se si utilizzano 4 rivelatori) che minimizza la variabilità campione tra analisi per ogni singola modalità di rilevamento. Inoltre, assegnando le relazioni tra i componenti all'interno del campione rilevato da un sensore all'altro è molto più semplice e meno soggetta a errore che se ciascun rivelatore sono stati impiegati separatamente. Questo evita mancata corrispondenza assegnazioni dei componenti, che spesso è un problema nell'analisi di campioni complessi.

È importante ribadire che la quantificazione dovrebbe essere basata sul rivelatore situato sulla porta di uscita radiale centrale fin qui efficienza di separazione è la più elevata, quindi, gli effetti di picco tailing sono minimi e quantificazione è quindi più precisa. La segmentazione del flusso ha dimostrato di essere solida attraverso analisi, ma anche così, è buona pratica di laboratorio per mantenere la standardizzazione regolare. Quindi in ogni lavoro quantitativa è importante eseguire gli standard a seconda dei casi. Se un rivelatore viene utilizzato puroly come mezzo per comprendere la complessità del campione attraverso rappresentazione visiva dei costituenti del campione, la quantificazione può non essere necessaria, come nel caso qui per il protocollo di rilevamento risposta antiossidante.

Abbiamo dimostrato qui un esempio di rilevazione tripla, UV, MS e il rilevamento reattivo antiossidante. Sistemi di rilevamento multiplex che utilizzano colonne AFT può essere utilizzato in quasi tutte le situazioni in cui un analisti richiede informazioni sul campione multidimensionale e questo comporta protocolli di rilevamento multipli. Utilizzando colonne AFT notevolmente semplificare e velocizzare il processo di caratterizzazioni campione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

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References

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