Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Colonne di tecnologia di flusso attivo

Tecnologia di flusso attivo (AFT) colonne di cromatografia sono stati recentemente sviluppati per superare inefficienza in separazioni associati al flusso di eterogeneità ^1-6 e anche per consentire il rilevamento multiplex. In questa particolare comunicazione abbiamo dettaglio il processo operativo del parallelo segmentato di flusso (PSF) colonna con rilevazione multiplex. I vantaggi funzionali chiave della colonna PSF sono: (1) il flusso dalla regione centrale radiale del letto della colonna è isolata dalla regione periferica o parete di flusso, (2) il volume di fase mobile che deve essere elaborata da una rilevazione fonte è ridotta, e le fonti (3) di rilevazione può essere canalizzato per espandere le informazioni campione senza instillare ritardi di rilevazione attraverso ogni processo di rilevamento, o successivamente che richiede la suddivisione di un flusso di corrente post-colonna ^7,8. La caratteristica fondamentale nella progettazione della colonna PSF che consente undvantage di rilevamento multiplato è romanzo presa assieme raccordi e fritta. la figura 1 è una fotografia della colonna AFT rispetto ad una colonna convenzionale. È importante comprendere che il processo di scissione ottenuta utilizzando colonne flusso segmentato parallele non è la stessa corrente di flusso post-colonna splitting. In un flusso di flusso della colonna montante dividere l'intera banda campione dal bordo anteriore alle estremità della coda viene campionato ugualmente (cioè, assialmente), in tal modo, ogni flusso flusso è uguale rispetto all'efficienza e sensibilità; l'entità della sensibilità quindi diviso per le spaccature numerici. In PSF, tuttavia, i campioni processo di scissione banda radialmente, non assialmente. Come tale, i campioni delle porte centrali all'apice del picco – la regione più concentrata del picco. Così, la sensibilità ecco alto come il picco non è diluito dalla regione diffusa tailing. Il campione eluendo dalle porte periferiche non è così efficace come nel centrazona l, ma, dal momento che la banda viene campionato radialmente, piuttosto che assialmente, la larghezza del picco è più stretto sarebbe il caso di un processo di campionamento che divide il picco in direzione assiale, cioè, una scissione post-colonna. Quindi la sensibilità con un rivelatore dipendente dalla concentrazione non viene ridotta.

Nella colonna PSF, il raccordo di uscita comprende più porte di uscita ed all'interno di questo raccordo terminale è alloggiato un setto anulare. La parte interna di questo fritta canali anulari fuoriuscire colonna mediante la luce radiale scarico centrale, mentre la porzione radiale esterna dei canali di uscita di fritta fluire dalla colonna tramite le porte di uscita dell'aria periferiche o regione di parete. Le porzioni interna ed esterna della fritta di uscita sono separati da una barriera impermeabile che impedisce il flusso di mezzo tra queste regioni di flusso ^2. Come conseguenza di questo disegno flusso centrale flusso radiale attraverso il letto colonna viene separato dal flusso ins regione pareteide colonna. La porzione relativa di flusso da queste due regioni può essere variata a quasi qualsiasi rapporto desiderato attraverso la gestione della pressione al fine di ottimizzare vari aspetti funzionali della tecnologia delle colonne, come l'efficienza di separazione o la sensibilità di rilevazione. In sostanza, questo disegno stabilisce in modo efficace all'interno del formato più grande colonna di una colonna 'virtuale', con un diametro interno più stretto, e quindi alle funzioni per le colonne come una colonna muro-meno vero, superando colonna letto eterogeneità e gli effetti a parete ^9,10.

I principali vantaggi di colonne PSF sono miglioramenti dell'efficienza colonna, la minimizzazione del trattamento solvente per la sorgente di rilevamento (s) e consentendo il rilevamento multiplexati. Tuttavia, un ulteriore vantaggio è che, poiché il tailing e regioni fronteggia di qualsiasi banda vengono rimossi dalla eluizione complessiva profilo soluto a eluizione o rilevamento è presente in concentrazione superiore rispetto verrebbero altrimenti osservati per gli stessi solute iniezione e concentrazione di carico su una colonna convenzionale, a seconda del rapporto di segmentazione impiegato. Di conseguenza vi è spesso osservato un aumento di intensità del segnale per le separazioni condotti su colonne PSF ^2. Infatti, se il rapporto segmentazione è regolato in modo che il 25% delle uscite portate da ciascuna delle quattro porte di uscita, l'intensità del segnale che si osserva con ultravioletti (UV) di rilevamento mostra praticamente la stessa intensità di segnale come risulta utilizzando un convenzionale colonna in cui tutto (100%) della fase mobile viene analizzata ^7. Inoltre, la messa a punto del rapporto di uscita tra le regioni centrali e del flusso a parete permette l'efficienza della colonna da ottimizzare. I guadagni di efficienza colonna osservati utilizzando colonne AFT non può essere indicato un singolo valore, poiché questi guadagni di efficienza sono una funzione di tre fattori: (1) la portata, (2) il rapporto di segmentazione, e (3) il fattore di ritenzione del soluto . Tuttavia, guadagni di efficienza rispetto a convcolonne entional sono quasi sempre osservati, e talvolta questi guadagni sono più di 100% del numero di piatti teorici ^1,2. La possibilità di regolare il rapporto di segmentazione permette l'analista di adattare efficacemente il diametro della colonna 'virtuale', e questo è un fattore importante in relazione al processo di rilevamento. Ad esempio, un diametro (id) colonna virtuale 2.1 mm interno è stabilito da un 4.6 mm di colonna id fisica quando il rapporto segmentazione è il 21% della fase mobile eluizione dalla luce radiale uscita centrale. In queste condizioni, il 2.1 mm colonna id virtuale esegue con un'efficienza che può essere superiore al 70% maggiore della 2.1 mm di colonna id convenzionale, a seconda della portata, e soluti coefficiente di conservazione ^10.

La colonna disegno PSF corrente che viene utilizzato per il rilevamento multiplato incorpora una porta raccordo di uscita 4, ma la colonna può essere dotato di un 2-port end-montaggio anche, tuttavia, questo limita rilevamento to solo due rivelatori. Il funzionamento di base di queste colonne è, tuttavia, lo stesso, eccetto che quattro rivelatori possono essere accoppiati simultaneamente alla presa PSF colonna 4-port ampliando le possibilità di rilevamento multiplexati. Oltre a colonna tubo connettivo pre e post, gli unici requisiti supplementari per operare una colonna PSF è tubo che possono essere collegati alle porte di uscita periferici, e un mezzo con cui la quantità di fase mobile passa attraverso ciascun tubo può essere misurata, generalmente è una misura di massa o di una misurazione volumetrica. Per facilità di sintonizzazione, il diametro interno del tubo di flusso in uscita tutti dovrebbe essere lo stesso. Il rapporto di flusso tra le aperture di uscita centrali e periferiche radiali viene quindi variato attraverso l'utilizzo di gestione della pressione, semplicemente cambiando la lunghezza del tubo si trova alla uscita periferica raccordo, o la lunghezza del rilevatore tubo posto sulla porta radiale uscita centrale.

Multiplex Detection Uso di colonne PSF </strong>

Un importante vantaggio di colonne FPF è che ciascuna delle aperture di uscita di uscita può essere collegato direttamente a una sorgente di rilevamento, consentendo così la rilevazione multiplexati. In un sistema di rilevamento ben progettato una singola analisi con rilevamento multiplato può fornire informazioni sostanziali per quanto riguarda la natura dei componenti all'interno del campione. È importante sottolineare che prove distruttive e non distruttive possono essere condotti esattamente nello stesso momento, senza ritardo di rilevamento. Questo consente l'assegnazione di assoluto, ad esempio, antiossidanti utilizzando DPPH ^• reagente, con componenti osservate per eluire con la spettrometria di massa (MS) risposte di rilevamento ^7,11 UV e / o. Pertanto, quattro rivelatori indipendenti possono essere azionati simultaneamente con porzioni appropriate di flusso diretto di ciascun rivelatore attraverso uno dei quattro fori di uscita. Poiché il flusso attraverso queste porte può essere facilmente regolata la quantità di soluto raggiungere qualsiasi dei rilevatori può essere regolata per adattarsila sensibilità del rilevatore data sorgente. Va notato, tuttavia, che la migrazione soluto più efficiente è osservata attraverso la porta di uscita centrale radiale. Ciascuna delle porte periferiche offrono efficienza di separazione equivalente, che se impostato al 25% attraverso ogni porta, è solo leggermente meno efficiente di una colonna convenzionale. Come tale, è importante che il rivelatore quantitativa essere impostato per analizzare campione dalla luce radiale uscita centrale.

Quando si imposta una colonna PSF ai fini della rilevazione multiplexing ci sono una serie di considerazioni che devono essere fatte per ottenere risultati efficaci e di alta qualità; cioè dimensioni del tubo per ciascuna porta, scelta di quale porta per un tipo di rivelatore e regolazione del flusso.

Dimensioni del tubo per ogni porta

Nella cromatografia la lunghezza della tubazione della colonna montante svolge un ruolo cruciale nella efficienza e il rendimento della separazione. Grande Dead-volume come risultato di tubazione lunga o larga id dalla colonna di uscita al rilevatore si tradurrà in una perdita di efficienza, risoluzione e sensibilità. Così, adeguate dimensioni tubi devono essere utilizzati quando si imposta la colonna di PSF di raggiungere il massimo potenziale nella fornitura di separazione efficiente mentre fornendo i benefici di multiplexing.

Porta a Detector

La figura 2 è una illustrazione di un esempio di configurazione di rilevazione multiplex (Ultra Violet-visibile (U-Vis), spettrometro di massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) di rilevamento). L'illustrazione mostra il porto centrale è collegata al rivelatore MS, mentre il DPPH ^• e rivelatori UV-Vis sono attaccati alle porte periferiche. Poiché la MS è il rivelatore più sensibile dei tre, flusso di questo rivelatore è stato diretto dalla luce di uscita centrale. Come DPPH ^{• Rilevamento} è selettivo alla Presence di antiossidanti, e la meno sensibile e più tollerante a banda allargamento, affluiscono a questo rivelatore è stato diretto da una porta periferica. L'UV-Vis è un rivelatore secondaria 'generico', quindi fluire verso questo rivelatore è diretto da una seconda porta periferica.

Regolazione del flusso

Una volta che il tubo appropriata è stata collegata da una porta per rilevatore, la portata in uscita da ciascuno dei rivelatori può essere regolata al valore desiderato. Un modo semplice per misurare la quantità di portata in uscita ogni rivelatore è di valutare la quantità di fase mobile che eluisce attraverso ogni porta in un dato periodo di tempo. Il flusso percentuale può così essere determinato, ed i rapporti di flusso può essere regolato sia accorciare o allungare il tubo attaccato alla linea di uscita sui rivelatori di conseguenza per soddisfare le esigenze dei rivelatori di scelta. Diversi rivelatori hanno differenti esigenze di portata, per esempio, la cella di flusso diun rivelatore a fluorescenza (FLD) non viene portata limitata, ma la cura deve essere presa per evitare un eccesso di pressurizzazione della cella di flusso. Quindi il controllo del flusso attraverso il FLD è spesso ottenuta regolando la caduta di pressione attraverso gli altri rivelatori e il resto del flusso quindi attraversa il FLD. Un rivelatore sensibile alla quantità di flusso che viene consegnato è il MS. In generale, le attuali spettrometri di massa di fascia alta possono facilmente elaborare circa 1 a 1,5 ml / min di moderata acquosa fase mobile. Sopra tale portata, allagamento della sorgente può rendere i MS inutilizzabile. Tuttavia, la sensibilità di rilevazione nella maggior parte dei spettrometri di massa è beneficiato utilizzando portate inferiori; quindi le capacità di suddivisione dei flussi FPF sono estremamente utili per applicazioni che prevedono il rilevamento MS. Colonna alta flussi volumetrici possono essere utilizzati, ma con carichi bassi volumi trasportati al rivelatore MS. Regolazione del flusso al rivelatore MS, tuttavia, deve essere effettuato regolando la caduta di pressione primaMS rilevatore, piuttosto che pubblicare MS. Qui, l'uso di un tubo del diametro ristretto (0,1 mm id) è molto utile, come la pressione può essere facilmente regolata senza aggiungere volume morto appropriato.

A seconda del tipo di sensore della regolazione del rapporto di segmentazione può essere fatto rivelatore sia pre o post. Se un rilevatore non distruttivo, come viene usato UV-Vis, la percentuale di flusso sarebbe misurata e sintonizzato rilevatore postale. Se un singolo rivelatore distruttivo è utilizzato nel multiplex impostare la percentuale di flusso è determinato calcolando indietro rispetto ad altre percentuali di flusso porta. Se un rivelatore basato reagente viene utilizzato come DPPH ^• la percentuale portata viene misurata rilevatore post senza l'aggiunta di reagente; e se si utilizzano due o più rivelatori distruttive, allora il rapporto portata viene misurata pre-detector. Detection sistemi che possono richiedere strumentazione aggiuntiva, come DPPH ^•, avrà pressione di sistema supplementari che possono alterare il flussopercentuale volta collegato al sistema di rivelazione. Pertanto, un attento esame deve essere rivolta alla pressione del sistema di un rivelatore distruttivo, quando si regola la percentuale di flusso pre-detector. Indipendentemente dal rapporto portata impostata attraverso una delle porte, informazioni quantitative dovrebbe essere ottenuto tramite la normalizzazione appropriata. Una volta che i rapporti di flusso sono impostati, tuttavia, sono robusti, e non cambiano anche in condizioni di eluizione a gradiente ^7,

Il protocollo video dettagliato che accompagna questo manoscritto ha lo scopo di mostrare come utilizzare e ottimizzare un funzionamento colonna di PSF in una modalità multiplex di rilevamento.

Protocol

Nota: Questo protocollo contiene le istruzioni su come utilizzare una colonna di PSF in un sistema HPLC accoppiato con più rilevatori per il rilevamento multiplex. Il protocollo è stato scritto assumendo che il lettore abbia una conoscenza di base ed esperienza in cromatografia e diversi metodi di rilevamento HPLC. Attenzione: Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell'uso (ad esempio, scheda di sicurezza per metanolo). G…

Representative Results

Una analisi HPLC multiplexed è stata effettuata utilizzando una colonna AFT in modalità PSF (Figura 1) e configurato come illustrato nella figura 2. Questo tipo di configurazione ha permesso un campione di caffè da analizzare simultaneamente utilizzando UV-Vis, DPPH • e MS in totale Count Ion modalità (TIC). I composti del campione caffè che ha risposto a DPPH • potrebbero quindi essere facilmente abbinati agli UV-Vis e MS – risposte TIC b…

Discussion

Questo studio riguarda la caratterizzazione e la profilazione di caffè con HPLC con rilevamento multiplex impiegando una colonna parallela del flusso segmentato (FPF). Multiplexed HPLC utilizzando colonne PSF consente la caratterizzazione e identificazione di entità chimiche fondamentali riducendo la complessità dei dati del campione mentre ottenere un maggior grado di informazione specifica molecola in una frazione del tempo necessario utilizzando processi multi-rilevamento convenzionali. La colonna PSF permette non…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels