Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

1School of Science and Health, University of Western Sydney
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Columnas Tecnología Flow Activo

Tecnología de flujo activo (AFT) columnas de cromatografía fueron desarrollados recientemente para superar la ineficiencia en las separaciones asociados a la heterogeneidad del flujo 1-6 y también para permitir la detección de multiplexado. En esta comunicación detalle que en particular el proceso operativo del paralelo segmentado flujo (PSF) columna con detección de multiplexado. Las ventajas funcionales clave de la columna de la PSF son: (1) el flujo desde la región central radial del lecho de la columna está aislada de la región periférica o la pared del flujo, (2) el volumen de fase móvil que debe ser procesada por una detección fuente se reduce, y las fuentes (3) de detección puede ser multiplexada para expandir información de la muestra sin infundir retrasos de detección a través de cada proceso de detección, o posteriormente que requiere la división de una corriente de flujo post-columna 7,8. La característica clave en el diseño de la columna de fibras discontinuas de poliéster que permite que la unaVentaja de la detección multiplexada es la novela de salida montaje de empalme y frita. La figura 1 es una fotografía de la columna AFT en comparación con una columna convencional. Es importante entender que el proceso de división obtuvo utilizando columnas de flujo segmentado paralelo no es la misma que la división de corriente de flujo post-columna. En una corriente de flujo post-columna dividir toda la banda de muestra desde el borde de ataque a las extremidades de la cola es igualmente incluidos en la muestra (es decir, axialmente), de ese modo, cada corriente de flujo es igual con respecto a la eficiencia y sensibilidad; la magnitud de la sensibilidad de este modo se divide por las divisiones de números. En PSF, sin embargo, las muestras de proceso de división de la banda radialmente, no axialmente. Como tal, las muestras de puertos centrales del vértice del pico - la región más concentrada del pico. Por lo tanto, la sensibilidad es más alta aquí como el pico no se diluye por la región difusa tizón. La muestra se eluye de los puertos periféricos no es tan eficiente como en el Centrazona l, pero, ya que la banda se muestrea radialmente, en lugar de axialmente, la anchura del pico es más estrecha que sería el caso para un proceso de muestreo que divide el pico en la dirección axial, es decir, una fracción de post-columna. Por lo tanto la sensibilidad de un detector dependiente de la concentración no se reduce.

En la columna de la PSF, el racor de salida comprende múltiples puertos de salida y en el interior de esta final apropiado se aloja una frita anular. La porción interior de este anulares canales de frita fluya hacia fuera de la columna a través del puerto de salida radial central, mientras que la porción radial exterior de los canales de frita de salida fluya hacia fuera de la columna a través de los puertos de flujo de salida periféricas o región de la pared. Las porciones interior y exterior de la frita de salida están separados por una barrera impermeable que impide el flujo transversal entre estas regiones de flujo 2. Como consecuencia de este diseño, la corriente de flujo radial central a través del lecho de la columna se separa de los ins de flujo región de paredide la columna. La porción relativa de flujo de estas dos regiones puede ser variada para casi cualquier relación deseada mediante la gestión de la presión con el fin de optimizar varios aspectos funcionales de la tecnología de la columna, como la eficiencia de separación o sensibilidad de detección. En esencia, este diseño establece con eficacia dentro de la columna de la mayor formato de una columna "virtual", que tiene un diámetro interno más estrecho, y por lo tanto las funciones de columna como una columna verdadera pared de menos, la superación de la columna heterogeneidad de cama y los efectos de pared 9,10.

Los principales beneficios de columnas PSF son mejoras en la eficiencia de la columna, la minimización del procesamiento disolvente para la fuente (s) de detección y que permite la detección multiplexada. Sin embargo, una ventaja añadida es que desde el tizón y regiones al frente de cualquier banda se eliminan de la elución global perfil del soluto en la elución o detección está presente en una concentración mayor que de lo contrario se observa para los mismos solute inyección y la carga de la concentración en una columna convencional, dependiendo de la relación de segmentación empleada. Como consecuencia de ello, se observa a menudo una ganancia en la intensidad de la señal para separaciones realizadas en columnas PSF 2. De hecho, si la relación de segmentación se ajusta de tal manera que 25% de las salidas de flujo de cada uno de los cuatro puertos de salida, la intensidad de la señal que se observa usando violeta (UV) de detección Ultra muestra prácticamente la misma intensidad de la señal exacta como aparente utilizando una convencional columna donde se analiza la totalidad (100%) de la fase móvil 7. Por otra parte, el ajuste fino de la relación entre la toma de las regiones del centro y de la pared de flujo permite que la eficiencia de la columna que se ha optimizado. Las ganancias en eficiencia de la columna observaron utilizando columnas AFT no se puede afirmar a un solo valor, ya que estos aumentos de la eficiencia son una función de tres factores: (1) la velocidad de flujo, (2) la relación de segmentación, y (3) el factor de retención de soluto . Sin embargo, las ganancias en eficiencia en comparación con convcolumnas entional casi siempre se observaron, y, a veces estas ganancias son más de 100% en el número de platos teóricos 1,2. La capacidad de ajustar la relación de segmentación permite que el analista para adaptar efectivamente el diámetro de la columna "virtual", y esto es un factor importante en relación con el proceso de detección. Por ejemplo, un 2,1 mm de diámetro (id) la columna virtual interna se establece a partir de una columna ID física 4,6 mm cuando la relación de segmentación es 21% de la fase móvil, eluyendo desde el puerto de salida radial central. En estas condiciones, la columna ID de 2,1 mm virtual realiza con una eficiencia que puede ser más de 70% mayor que la columna ID de 2,1 mm convencional, dependiendo de la tasa de flujo, y el factor de retención de soluto 10.

El diseño de la columna PSF actual que se utiliza para la detección multiplexada incorpora un 4-puerto de salida apropiado, pero la columna se puede equipar con un 2-puerto de herraje final también, sin embargo, esto limita la detección to sólo dos detectores. El funcionamiento básico de estas columnas es, sin embargo, la misma, excepto que los cuatro detectores se pueden acoplar simultáneamente a la columna de fibras discontinuas de poliéster de 4 orificio de salida de ampliar el alcance para la detección multiplexada. Aparte de tubo conectivo columna antes y después, los únicos requisitos adicionales para operar una columna de fibras discontinuas de poliéster se tubería que se puede conectar a los puertos de salida periféricos, y un medio por el cual la cantidad de fase móvil pasa a través de cada tubo se puede medir, típicamente una medición de la masa o una medición volumétrica. Para facilitar la afinación, el diámetro interno de todos los tubos de flujo de salida debe ser el mismo. La relación de flujo entre los puertos de salida centrales periféricas y radiales se varía entonces a través de la utilización de gestión de la presión, simplemente cambiando la longitud de la tubería se encuentra en la salida periférica ajustada, o la longitud del detector de post tubo en el puerto radial salida central.

Detección multiplexado utilizando columnas PSF

Una ventaja importante de columnas PSF es que cada uno de los puertos de salida de salida se puede conectar directamente a una fuente de detección, permitiendo así la detección multiplexada. En un sistema de detección bien diseñado un solo análisis con detección multiplexada puede proporcionar información sustancial en lo que respecta a la naturaleza de los componentes dentro de la muestra. Es importante destacar que, ensayos destructivos y no destructivos pueden llevarse a cabo exactamente en el mismo momento, sin retardo de detección. Esto permite la asignación absoluta de, por ejemplo, anti-oxidantes utilizando DPPH reactivo, con componentes observaron para eluir con UV y / o espectrometría de masas (MS) las respuestas de detección de 7,11. Por lo tanto, cuatro detectores independientes pueden ser operados simultáneamente con porciones apropiadas de flujo dirigido a cada detector a través de cualquiera de los cuatro puertos de salida. Puesto que el flujo a través de estos puertos se puede ajustar fácilmente la cantidad de soluto de alcanzar cualquiera de los detectores se pueden ajustar para adaptarsela sensibilidad del detector de fuente dada. Cabe señalar, sin embargo, que la migración de soluto más eficiente se observa a través del puerto de salida radial central. Cada uno de los puertos periféricos ofrecen eficiencia de separación equivalente, que cuando se establece en 25% a través de cada puerto, es sólo ligeramente menos eficiente que una columna convencional. Como tal, es importante que el detector cuantitativo configurarse para analizar la muestra desde el puerto de salida radial central.

Cuando la creación de una columna de fibras discontinuas de poliéster con el propósito de detección de multiplexado hay un número de consideraciones que deben hacerse para lograr resultados eficientes y de alta calidad; es decir dimensiones de los tubos para cada puerto, la elección de qué puerto para un tipo de detector y el ajuste de flujo.

Tubo Dimensiones para cada puerto

En la cromatografía de la longitud del tubo de la columna posterior juega un papel crucial en la eficiencia y el rendimiento de la separación. Gran dead-volumen como resultado de un largo o ancho tubo de salida de la columna ID de detector se traducirá en una pérdida de eficiencia, resolución y sensibilidad. Por lo tanto, las dimensiones de tubos apropiados deben ser utilizados al configurar la columna de la PSF para alcanzar el máximo potencial en el suministro de separación eficiente al tiempo que proporciona los beneficios de multiplexación.

Puerto de detector

La figura 2 es una ilustración de una configuración de ejemplo de detección de multiplexado (Violet-Visible Ultra (U-Vis), espectrómetro de masas (MS) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detección). La ilustración muestra el puerto central está unido al detector MS, mientras que el DPPH y detectores de UV-Vis se adjuntan a los puertos periféricos. Puesto que la MS es el detector más sensible de los tres, fluir a este detector fue dirigido desde el orificio de salida central. Como DPPH • Detección es selectivo a la presence de antioxidantes, y la menos sensible y más tolerante al ensanchamiento de las bandas, el flujo a este detector fue dirigido desde un puerto periférico. El UV-Vis era un detector secundario "genérico", por lo que fluya a este detector fue dirigido desde un segundo puerto de periféricos.

Ajuste de Flujo

Una vez que el tubo apropiado se ha unido desde un puerto de detector, el flujo que sale de cada uno de los detectores se puede ajustar a la cantidad requerida. Una forma sencilla de medir la cantidad de la salida de cada detector de flujo es pesar la cantidad de fase móvil que eluye a través de cada puerto durante un período determinado de tiempo. El flujo de porcentaje de este modo se puede determinar, y las relaciones de flujo se puede ajustar por cualquiera acortando o alargando el tubo conectado a la línea de toma de corriente de los detectores en consecuencia para adaptarse a los requisitos de los detectores de elección. Diferentes detectores tienen diferentes requisitos de flujo, por ejemplo, la celda de flujo deun detector de fluorescencia (FLD) no es la tasa de flujo limitada, pero se debe tener cuidado para evitar la sobre-presurización de la celda de flujo. Por lo tanto el control de flujo a través del FLD generalmente se logra mediante el ajuste de la caída de presión a través de los otros detectores y el resto del flujo entonces pasa a través de la FLD. Un detector que es sensible a la cantidad de flujo que se entrega es la MS. Generalmente, espectrómetros de masas actuales de gama alta pueden procesar fácilmente alrededor de 1 a 1,5 ml / min de fase móvil acuosa moderadamente. Por encima de esta velocidad de flujo, inundación de la fuente puede hacer que los MS inoperable. Sin embargo, la sensibilidad de detección en la mayoría de los espectrómetros de masas se benefició con caudales inferiores; por lo tanto, la capacidad de división de flujo PSF son extremadamente útiles para aplicaciones que implican la detección MS. Caudales volumétricos de alta de la columna se pueden utilizar, pero con cargas de bajo volumen transportado al detector MS. Afinación del flujo al detector MS, sin embargo, se debe hacer mediante el ajuste de la caída de presión antes de laDetector de MS, en lugar de colocar la EM. Aquí, el uso de mangueras de diámetro interior estrecho (0,1 mm id) es muy útil, ya que la presión se puede ajustar fácilmente sin añadir volumen muerto apropiado.

Dependiendo del tipo de detector el ajuste de la relación de segmentación puede hacerse detector ya sea pre o post. Si un detector no destructivo, como se usa UV-Vis, el porcentaje de flujo sería medido y ajustado detector de correos. Si un solo detector destructiva se utiliza en el multiplex establecer el porcentaje de flujo se determina por el cálculo de la espalda con respecto a otros porcentajes de flujo de puerto. Si un detector basado reactivo se utiliza como DPPH •, el porcentaje de flujo se mide detector puesto de trabajo sin la adición de reactivo; y si se utilizan dos o más destructivas detectores, entonces la relación de flujo se mide pre-detector. Sistemas que pueden requerir instrumentación adicional, tales DPPH Detección, tendrá la presión del sistema adicional que puede alterar el flujoporcentaje una vez conectado al sistema de detección. Por lo tanto, la consideración cuidadosa se debe prestar a la presión del sistema de un detector destructiva, al ajustar el porcentaje de flujo pre-detector. Independientemente de la relación de flujo que se establece a través de cualquiera de los puertos, la información cuantitativa se debe obtener mediante la normalización adecuada. Una vez que las relaciones de flujo se establecen, sin embargo, son robustos, y no cambian incluso bajo condiciones de elución de gradiente de 7,

El protocolo de vídeo detallado que acompaña este manuscrito tiene la intención de mostrar cómo usar y ajustar un funcionamiento columna de fibras discontinuas de poliéster en un modo multiplexado de detección.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: Este protocolo contiene instrucciones sobre cómo utilizar una columna de fibras discontinuas de poliéster en un sistema HPLC junto con múltiples detectores para la detección de multiplexado. El protocolo se ha escrito asumiendo que el lector tiene conocimientos básicos y experiencia en cromatografía y diversos métodos de detección de HPLC.

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) para todos los materiales y los reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegúrese de que el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manejar disolventes y High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluyente. Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, el equilibrio y el detector de la instrumentación analítica, y asegurar el uso de equipos de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados).

1. Configuración de HPLC Instrumento

  1. Preparar el instrumento HPLC con agua ultrapura (por ejemplo, el 100% de agua Milli-Q) para line A y 100% de metanol para la línea B como fase móvil y purgar las bombas según el requisito del fabricante. Si uno de los detectores usados ​​es MS, ya que es aquí, añadir ácido fórmico 0,1% a ambas fases móviles A y B.
  2. Configurar el HPLC componentes instrumentales y detectores como se ilustra en la Figura 2. Esto requiere la colocación conveniente de detectores relativos a la columna para minimizar el volumen muerto entre el detector y la columna. La flexibilidad en la configuración del sistema HPLC es deseable.

2. Configuración de la radiación UV-Vis y MS Detectores

  1. Ajuste el detector de UV-Vis a la longitud de onda deseada depende de la muestra de interés (por ejemplo, 280 nm).
  2. Ajuste el detector de MS en modo positivo para el conde de iones totales (TIC) análisis según el método de detección de Análisis completo. También ajustar los siguientes parámetros de MS en consecuencia: temperatura del vaporizador 500 ° C, temperatura del capilar 350 ° C, gas vaina fijado en una tasa de 60 unidades, el flujo de gas auxiliar40 y barrer el flujo de gas a 5 unidades, y el voltaje de pulverización 3,5 kV. Estos ajustes se pueden ajustar más adelante para conocer los requisitos específicos de usuarios que dependen de la muestra que se está analizando.

3. Preparación de 2,2-difenil-1-Radical picrilhidrazil (DPPH •) Reactivo de configuración de DPPH Detector System

  1. Pesar 25 mg de DPPH y disolver en 250 ml de metanol en un matraz aforado.
  2. Añadir 250 ml de ácido fórmico al DPPH reactivo. Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
  3. Sonicar el matraz que contiene el reactivo para DPPH 10 min.
  4. Purgar la bomba de DPPH con el preparado DPPH reactivo según el requisito del fabricante.
  5. Configurar el sistema de DPPH acuerdo con la Figura 2 conectando la línea de la bomba a la entrada de una pieza en T.
  6. Adjunte una bobina de reacción de l 100 a the salida de la pieza en T y conectar el otro extremo de la bobina de reacción al detector.
  7. Encajona en el serpentín de reacción en un calentador de columna y ajustar la temperatura del calentador de la columna a 60 ° C.
  8. Ajuste el DPPH UV-Vis detector a 520 nm.

4. Configuración de Columna PSF

  1. Conectar la entrada de la columna de la PSF al instrumento HPLC.
  2. Conectar el puerto central al detector MS, utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID.
  3. Conectar un puerto periférico al detector de UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID.
  4. Conecte otro puerto de periféricos de la pieza en T del sistema de detección de DPPH utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm.
  5. Bloquear el puerto de periféricos no utilizados usando un tapón de columna.
  6. Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol (ácido fórmico al 0,1%).
  7. Equilibrar la columna con el pH móvil metanol 100%ase durante 20 min para una columna mm de longitud 4,6 mm de diámetro x 250. Esta vez se escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas el usuario puede emplear.

5. Ajuste la Columna PSF para la detección multiplexada

  1. Medir la masa de al menos dos recipientes de recogida vacíos (uno para el puerto conectado al detector de UV-Vis y uno para el detector de DPPH •) utilizando una balanza analítica.
  2. Recoger la fase móvil desde el UV-Vis y los puertos de DPPH en dos recipientes de recogida, pesadas previamente separadas (5.1). Anote el período de tiempo para la colección. Recoge al menos 500 mg de disolvente en cada buque.
  3. Sopesar los recipientes de recogida y determinar la masa de la fase móvil. Teniendo en cuenta la densidad del metanol es 0,791 g ml -1, determinar el volumen de fase móvil recogido de cada puerto.
  4. Por diferencia, es decir, conjunto de caudal de la bomba nominal menos la tasa de flujo a través del DPPH y UV-Vis Detectopuertos de flujo r, determinan la velocidad de flujo al detector MS. Expresar cada proporción de flujo como un porcentaje del flujo total.
    Nota: Idealmente, los porcentajes de flujo son: para la MS es 18% de la velocidad de flujo total, a la UV-Vis 22%, a la DPPH detector 60%.
  5. Si no es así, ajustar los porcentajes de flujo cambiando la presión de nuevo en el detector UV-Vis. Por ejemplo, si el flujo a la UV-Vis es demasiado alta, disminuir la proporción mediante la adición de añadir una sección de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID a la salida del detector de UV-Vis. A continuación, repita los pasos 5.1 a 5.5.

6. Condiciones de instalación Finales

  1. Ajuste el caudal de la bomba de DPPH reactivo a la misma velocidad de flujo que sale del puerto de salida conectado al detector DPPH •.
    Nota: La columna PSF multiplexado con UV-Vis, DPPH y MS ahora está listo para su análisis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un análisis de HPLC multiplexada se llevó a cabo utilizando una columna de AFT en el modo de PSF (Figura 1) y configurar como se ilustra en la Figura 2. Este tipo de configuración permite una muestra de café que va a analizarse simultáneamente usando UV-Vis, DPPH y MS en total Contador de Ion modo (TIC). Los compuestos de la muestra de café que respondió a DPPH podrían entonces ser fácilmente emparejados a los UV-Vis y MS - respuestas TIC basado en la alineación de tiempo de retención, como se ilustra en la Figura 3, ya que los cromatogramas se registraron simultáneamente. Cuando una respuesta positiva fue visto desde el detector de MS-TIC, se registró la masa molecular del pico. La Tabla 1 enumera los tiempos de retención de los DPPH picos, y la respuesta de tales picos en el espectro UV-Vis y / o la MS detector, que de este modo siempre que la masa molecular. La facilidad en la adecuación de los picos entre los diferentes procesos de detección permitido afforma ast y más eficiente de la detección y caracterización de una muestra compleja, como el café.

Figura 1
Figura 1. Una imagen de la columna tecnología de flujo activo en comparación con una columna convencional. La columna AFT está equipado con un conector de salida de cuatro puertos que alberga la frita anular que permite el muestreo de pico a través de la sección transversal radial de una banda de la muestra. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Una ilustración ejemplo de una disposición multiplexada HPLC, utilizando una columna de fibras discontinuas de poliéster con DPPH •, detectores MS UV-Vis y. Cada Detecto r está conectado a un puerto de salida por separado. En este caso, la MS se utiliza para la cuantificación y se establece para recoger muestras del puerto radial salida central. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los cromatogramas de una muestra de café analizado a través de un sistema de HPLC multiplexado, utilizando una columna de fibras discontinuas de poliéster con DPPH •, UV-Vis y los detectores MS: (a) DPPH 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Cada traza detector es perfectamente coincidentes en el tiempo, por lo que no se requiere ajuste de compensación con el fin de compensar el tiempo muerto entre cada detector.arget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

">
Café DPPH • Respuesta de pico y la Misa
DPPH Pico Tiempo de retención DPPH UV-Vis MS - Respuesta TIC Masa
(min) Respuesta Respuesta
1 6.74 123.84
2 </ td> 7.54 125.83
3 8.94 No No -
4 10.05 No 135.83
5 13.15 No No -
6 16.22 No No -
7 18.14 126.82
8 19.4 162.81
9 20.46 187.89
10 24.71 162.81
11 26.27 162.8
12 26.97 194.87
13 31.84 162.8
14 32.02 162.78
15 32.56 176,82
16 33.94 176.83
17 41.26 No -
18 42.72 No 284,93
19 46.07 190.83
20 49.21 162.75

Mesa 1. Detectado DPPH picos de respuesta a la radiación UV-Vis y MS - TIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este estudio consiste en la caracterización y perfiles de café usando HPLC con detección multiplexado empleando una columna paralela flujo segmentado (PSF). Multiplexado HPLC utilizando columnas de PSF permite la caracterización y la identificación de entidades químicas clave mediante la reducción de la complejidad de los datos de la muestra, mientras que la obtención de un mayor grado de información molécula específica dentro de una fracción del tiempo que tarda el uso de procesos convencionales multi-detección. La columna PSF no sólo permite una plataforma para la detección multiplexada, sino también la combinación de ambos detectores destructivos y no destructivos, sin volumen muerto adicional y la tubería. DPPH •, UV-Vis y MS (TIC) se multiplexan para el análisis de café espresso.

Una columna PSF 4-puerto se utilizó para el análisis multiplexado de café utilizando los tres detectores diferentes. El puerto central de la salida de la columna PSF estaba conectado con el detector de MS y dos de los three puertos periféricos estaban conectados ya sea a un sistema de detección de DPPH o un detector de UV-Vis. El tercer puerto de periféricos disponibles no fue utilizado y, por tanto, bloqueado con un tapón de la columna, pero esto podría haber sido utilizado para la recogida de la muestra, o para otro detector. El proceso de ajuste de este conjunto multiplexado seguimiento fue específica al detector, donde la medición del flujo de segmentación se produjo después de detector para DPPH • Sistemas de detección de la radiación UV-Vis y. Dado que el MS es un detector destructiva, el porcentaje de flujo se determinó por diferencia (flujo nominal total menos el flujo de los otros puertos de salida).

En este estudio, el análisis de café con el DPPH • Reactivo resultó en 20 picos bien resueltos, 13 de los cuales también mostraron una respuesta en los detectores de UV-Vis y MS. La Figura 3 compara los cromatogramas obtenidos por cada detector. Hay cuatro regiones que tienen el mismo perfil cromatográfico dentro de cadacromatograma, indicado por las cajas rojas. En estas cajas, donde UV-Vis y MS mostraron poca respuesta a estos compuestos, hubo una fuerte respuesta del detector DPPH •. Cuatro componentes que respondieron a la DPPH reactivo no se detectaron ni por los detectores de UV-Vis o MS y tres de los componentes que respondieron a la DPPH reactivo dieron ninguna respuesta UV-Vis o MS en absoluto. La masa molecular de los componentes que respondieron a la MS están registrados en la Tabla 1. El componente que eluye a los 10 minutos tuvo una fuerte DPPH • Respuesta, sin respuesta del detector UV-Vis y sólo una muy pequeña respuesta del detector de MS .

El acoplamiento de una columna de AFT en modo PSF dio la oportunidad de ejecutar múltiples detectores en modo multiplexado, donde todos los detectores, independientemente de los requisitos de HPLC-detector se llevaron a cabo de forma simultánea en una sola inyección y la separación de este complejo sample. El multi-puerto terminar el diseño apropiado de la columna AFT ofrece el beneficio adicional de proporcionar oportunidades para los procesos de detección de multiplexación, dando información de la muestra detallada y la fiabilidad absoluta en la asignación de los componentes entre cada modo de detección. Detección multiplexada con columnas de PSF proporcionado una gran cantidad de información de la muestra, tres detectores operados simultáneamente en el tiempo de ejecución requerido para un único detector. El resultado exacto del tiempo de retención de picos dentro de cada modo de detección fue posible. Dos de los detectores utilizados eran detectores destructivas.

Las capacidades de multiplexación de una columna de fibras discontinuas de poliéster, sin embargo limitadas por los componentes instrumentales disponibles HPLC y la instrumentación de detección. La técnica requiere de múltiples métodos de detección y los complementos necesarios para cada modo específico de detección, es decir, bombas, bobinas de reacción, calentadores, etc. El principal beneficio de la detección de multiplexado utilizando una columna de fibras discontinuas de poliéster es el reduction en el tiempo de análisis por hasta cuatro veces (si se utilizan detectores 4), lo que minimiza la variabilidad de la muestra entre los análisis para cada modo único de detección. Por otra parte, la asignación de las relaciones de los componentes dentro de la muestra detectada a partir de un detector a otro es mucho más simple y menos propenso a error que si cada detector se emplearon por separado. Esto evita falta de coincidencia en asignaciones de componentes, que es a menudo un problema en el análisis de muestras complejas.

Es importante reiterar que la cuantificación debe ser realizada con base en el detector situado en el puerto de salida central radial desde aquí eficiencia de separación es la más alta, por lo tanto, los efectos de pico del tizón son mínimos y por lo tanto la cuantificación es el más preciso. La segmentación del flujo ha demostrado ser robusto a través de análisis, pero aún así, es una buena práctica de laboratorio para mantener la estandarización regular. De ahí que en cualquier trabajo cuantitativo es importante para ejecutar las normas, según corresponda. Si un detector se utiliza puramente como un medio para comprender la complejidad de la muestra a través de representación visual de constituyentes de la muestra, la cuantificación puede no ser necesaria, como es el caso aquí por el protocolo de detección de la respuesta antioxidante.

Hemos demostrado aquí un ejemplo de detección triple, UV, MS y la detección de respuesta antioxidante. Sistemas de detección multiplexados utilizando columnas de popa se puede utilizar en casi cualquier situación en la que un analistas requiere información de la muestra multidimensional y esto implica múltiples protocolos de detección. El uso de columnas AFT simplificará en gran medida y acelerar el proceso de caracterización de la muestra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136, (24), 5127-5130 (2011).
  2. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
  3. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35, (3), 410-415 (2012).
  4. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
  5. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
  6. Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
  7. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
  8. Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
  9. Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
  10. Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
  11. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics