Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Som presenteras här är en enhetlig beskrivning av tekniker som kan användas för att utveckla, omvandla, administrera, och testa heterologt protein uttryck av de probiotiska jästen Saccharomyces boulardii.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Probiotiska mikroorganismer är en spännande potentiella medel för effektivt och ekonomiskt att leverera heterologa proteiner till mag-tarmkanalen. Dessa organismer är kapabla att överleva passagen genom mag-tarmkanalen ännu inte kolonisera det en som möjliggör kontrollerad dosering och begränsa exponering för läkemedlet uttryckt. Dessutom möjlighet att enkelt konstruera dessa organismer för att producera heterologt protein i stor skala gör dem ett ekonomiskt alternativ till syntetiska leveranspartiklar. Men utvecklingen av en sådan strategi, som nyligen visat med hjälp av en auxotrof stam av probiotiska jästen Saccharomyces boulardii 2, kräver kunskap om laboratorietekniker inte traditionellt kombineras inom en given studie, från jäst och molekylärbiologi till djurhantering tekniker och immunologiska metoder. Således även om de enskilda förfaranden som beskrivs häri är inte i sig romanlaboratorieprotokoll, är målet för detta manuskript att presentera en enhetlig introduktion till tekniker som behövs för experimentell testning av probiotiska jäst som läkemedelsleveransfordon till den murina mag-tarmkanalen. Förutsatt är en sammanställning av viktiga protokoll för: 1) generering av auxotrofa mutantjäststammar som lätt kan genmanipulerade; 2) transformation av jästkulturer för att uttrycka heterologt protein; 3) administrering av rekombinant jäst till tarmen via oral sondmatning; och 4) återvinning av livskraftiga rekombinant probiotiska jäst från mus tarm och bedömning av deras heterologt proteinuttryck.

Först, även om många positiva och negativa urvalsmetoder finns för manipulering av jästarter, ökar negativ selektering, såsom genom användning av auxotrofa markörer både effektivitet och lätthet med vilken jäst kan transformeras och väljas. Positiv selektering av transformanter med användning av antibiotika, i samarbetentrast, signifikant ökar kostnaden för jäst manipulation. Dessutom kan valet av jäst på antibiotikainnehållande fasta medier möjliggör ökad tillväxt av otransformerade bakgrundskolonier i förhållande till val av auxotrof jäst på syntetiskt avhoppen fasta medier (opublicerade observationer). Auxotrofa jäst är stammar som saknar enzymer kritiska för syntes av essentiella aminosyror eller uracil. En sådan jäst kan växa endast om kompletteras med den saknade metabolit eller metabolisk gen, så att negativa val när jäst ströks ut på syntetisk hoppar media som saknar den väsentliga metaboliten. Många vanliga Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammar är i själva verket redan auxotrofa mutanter 3. Industrial, klinisk och probiotiska jäststammar är emellertid typiskt prot med förmågan att syntetisera alla nödvändiga näringsämnen. För att möjliggöra en effektivare genetisk manipulation av sådan jäst kan auxotrofa gener selektivt riktadeatt generera stammar som kan väljas utan antibiotika. Särskild inriktning på auxotrofa markörgener kan uppnås genom PCR-medierad gen störningar förlitar sig på homolog rekombination eller mer nyligen genom crispr / Cas9 inriktning 4-6. Alternativt kan UV-mutagenes snabbt generera auxotrofa mutanter även i jäststammar som transformation med flera plasmider är tekniskt svårt 7. Medan PCR inriktning och crispr / Cas9 har beskrivits utförligt på annat håll, som presenteras i del ett av detta manuskript är ett detaljerat protokoll som beskriver en UV-mutagenes strategi för att skapa auxotrofa stammar som gör det möjligt för negativt urval snarare än positiv antibiotikaselektion av jästtransformanter.

Nästa nödvändigt steg vid användningen av sådana auxotrofa stammar för oral tillförsel av heterologt protein är jäst transformation med plasmid-DNA. Sedan den första framgångsrika omvandlingen av yeast sfäroplaster rapporterats för Saccharomyces cerevisiae 1978 8, har ett flertal modifieringar präglats för att öka effektiviteten och lätthet med vilken jästarter kan vara genetiskt modifierade. Användning av elektroporering för en framgångsrik omvandling av DNA i S. cerevisiae beskrevs första gången 1985 9 och har sedan dess förbättrats genom tillsats av 1 M sorbitol inkubation till osmotiskt stödceller 10. Elektroporering effektivitet har dessutom visat sig bero på jäst art och stam, antalet celler och tillväxtfas, elektroporering volym, fältstyrka, och specifika buffertar 11. Litiumacetat (LiOAc) transformation, ursprungligen beskrevs av et al. Ito 12, är bland de mest använda transformationsprotokoll eftersom det kräver ingen speciell utrustning. Ytterligare analyser visade att effektiviteten hos LiOAc jästtransformation ökar i hög grad när cellerna samlas i mitten av log-fasenav tillväxt och är värmechock i närvaro av polyetylenglykol (PEG) och DNA vid 42 ° C 12. Inkubation av hela intakt jäst med PEG är väsentlig för effektiv omvandling, eventuellt genom att förbättra fastsättning av DNA till cellmembranet samt via andra effekter på membranet 13. Litium självt ökar också permeabiliteten för intakta celler 14. Även om de flesta laboratorium S. cerevisiae stammar kan lätt omvandlas med hjälp av LiOAc transformation 3, kan andra jästarter vara mer effektivt transformeras med användning av alternativa protokoll. Pichia pastoris, till exempel, är mest effektivt omvandlas via elektroporering snarare än LiOAc omvandling 13. Det är viktigt, därför att testa flera metoder för omvandling och att optimera inkubationsperioder och reagenskoncentrationer vid försök att genetiskt modifiera en karaktäriserad jäststam. Detta manuskript beskriver således både LiOAc transformation och elektroporering som teknik för omvandling av auxotrof mutant och vild typ S. boulardii. Intresserade läsare är inriktade på senaste recensioner för noggranna beskrivningar av utvecklingen av jäst omvandling, alternativa protokoll, och ytterligare diskussioner om möjliga verkningsmekanismer 13,15. Transformation av jäst med plasmid som kodar för ett lätt detekterbart protein är dessutom en förutsättning för efterföljande tester för att säkerställa korrekt uttryck och funktion av heterologt protein. Otaliga olika proteiner kan väljas beroende på det yttersta syftet med den terapeutiska studien och antikropparna som proteindetektion av immunoblotting, ELISA, och andra tekniker. Protokoll för dessa tekniker har grundligt beskrivits på annat ställe 16,17, och kan användas för att bestämma nivåer av heterolog proteinproduktion från transformerad jäst genom jämförelse med standardkurvor. För syftena med demonstration och att visaframgångsrik produktion av ett mycket vanligt förekommande protein i jäst biologi, presenterar detta manuskript transformation med plasmid kodande grönt fluorescerande protein (GFP), som gör det möjligt för efterföljande detektion med användning av fluorescensmikroskopi.

Lika viktigt för produktion av probiotiska organismer som uttrycker heterologt protein är det en god förvaltning och detektering av dessa mikroorganismer inom gastrointestinala vävnader, som beskrivs i delar tre och fyra. Administrering av rekombinant jäst via oral sondmatning möjliggör avgivning av kontrollerade kvantiteter av jäst direkt in i magen, från vilket C57BL / 6-möss är naturligt oförmögna att kräkningar 18. Däremot kan felaktig djurhantering och sondmatning leda till matstrupen skada och perforering, gastrisk perforering, luftrör administration, och aspirationspneumoni 19,20. Dålig teknik och bristande erfarenhet kan vidare öka variabiliteten i murina immunsvar och experimentell Results, som har tillskrivits djur stressen vid oral sondmatning 21,22. Praxis i korrekt teknik kan således inte endast dämpa djuret obehag, men kan också öka precisionen av experimentella resultat. Detta manuskript beskriver och visar förvaltning av kontrollerade doser av rekombinant jäst djurhantering och oral sondmatning.

Slutligen är det viktigt att bekräfta framgångsrik leverans av rekombinant jäst genom att analysera lymfoidvävnader avseende på närvaro av jäst och heterologa proteinet. Mag immun vävnader som undersökts kan enklast och förutsägbart vara med avseende på förekomst av jäst är de Peyerska placken. Peyers plack är sekundära lymfoida organ längs tunntarmen som är viktiga områden av mukosal immunsvarsinduktion 23. Antigener från lumen överförs transcellularly genom microfold (M) celler i epitelet och frigörs i de Peyerska placken och exponerar därmed omslutad antigenpresenterande celler till tarm luminala innehåll. Även om partikelupptag över tarmepitelet också kan uppnås genom bägarceller, har dessa celler visats endast tar upp partiklar mindre än 0,02 pm i diameter 24. Transepitelialt dendriter sträckte sig från CD103 + dendritiska celler (DC) också tar upp små partiklar från tarmlumen 25; men det finns för närvarande inga rapporter som visar att CD103 + DCs ta upp partiklar som är större än bakterier. Således intakt probiotiska jäst, av medelstorlek mellan 3-6 mikrometer i diameter, är mest sannolikt att tas upp av M-celler och överfördes till de Peyerska placken. Som beskrivs här är ett protokoll för insamling och screening av Peyers plack för livsduglig rekombinant jäst, även om detta förfarande också lätt kan anpassas för att utvärdera upptag av probiotiska bakterier.

Sammanfattningsvis bedömer rekombinant probiotiska jäst för leverans avrapeutic proteiner till tarmen kräver kunskaper i laboratorietekniker som spänner över molekylärbiologi till djurhantering och immunologi. Presenteras här är protokoll för en) generering och screening av auxotrofa jäststammar som kan lätt negativt väljas utan antibiotika, 2) alternativa protokoll för att transformera jäst och möjliggöra expression av heterologt protein, 3) demonstrationer av lämpliga djurhantering teknik och oral sondmatning för intragastrisk tillförsel av rekombinant jäst, och 4) protokoll för Peyers plack dissektion och screening för livsduglig rekombinant jäst och funktionellt heterologt protein. Tillsammans kommer dessa protokoll möjliggör generering och provning av en probiotisk jäststam som kan leverera heterologa terapeutiskt protein till mag-tarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UV-mutagenes för att generera auxotrof jäststammar

  1. Generera överlevnadskurvor för att bestämma korrekt dos av UV-bestrålning
    1. Förbered YPD (jästextrakt pepton dextros) media och andra reagens som anges i tabell 1 enligt standardprocedurer 26 och ympa enskilda kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkubera kulturer på en rulltrumma vid 30 ° CO / N till mättnad under minst åtta timmar.
    2. Bestämma cellkoncentration av O / N odlingar med användning av en spektrofotometer genom att späda cellerna 1:10 i vatten i en plast kyvett. Späd cellerna till en koncentration av 10 7 celler / ml i 20 ml sterilt destillerat vatten.
    3. Häll utspädda celler i en steril plastpetriskål och, med locket borttaget, placera plattan 14 cm under en UV-lampa.
    4. Exponera celler till serie 5000 μJ och 10.000 μJ doser av UV-strålning, som utvinner 500 pl celler efter varje ökning så att cellersamplas efter exponering för 0 μJ, 5000 μJ, 10000 μJ, 15.000 μJ, 20000 μJ, 25.000 μJ, 30000 μJ, 40.000 μJ och 50.000 μJ av UV-strålning. Överför extraherade cellprover till sterila 1,5 ml rör och seriellt späda på 1:10 steg i sterilt vatten.
    5. Pelletera celler i varje utspädning genom centrifugering i en mikrocentrifug vid 16.000 xg i 1 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera i en 100 | il volym av sterilt vatten lämpligt för plätering jästceller. Pipettera hela volymen av återsuspenderade celler på plattor innehållande YPD-fasta medier och använda en steril spridare att jämnt fördela celler över varje platta.
    6. Wrap plåtkanter i Parafilm för att förhindra uttorkning av media och täckplåtar i aluminiumfolie för att förhindra fotoreaktivering och reparation av UV-inducerade mutationer. Inkubera plattorna upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar för att möjliggöra tillväxt av livskraftiga jästkolonier (Figur 1).
    7. Räkna number kolonier, eventuellt med hjälp av en penna för att markera räknade kolonier, en handhållen elektronisk räknare penna, eller en räknare stå med förstoring. Tomt i procent av det totala antalet strukna cellerna vid varje μJ dos av UV-strålning för att generera en överlevnadskurva för bestrålat jäst (Figur 2).
      NOT: Haploid jäststammar kan förväntas kräva lägre doser av UV-bestrålning i förhållande till diploida stammar att nå samma procent överlevnad. En stam av jäst som saknar funktionella DNA-reparationsenzymer, såsom rad1 S. cerevisiae-mutanten, kan användas som en positiv kontroll för att indikera närvaron av UV-bestrålning vid mycket låga doser.
    8. Bestäm dos av UV-mutagenes kan användas för screening genom att hänvisa till överlevnadskurvan bestämmas i 1.1.7. X-värdet för punkten längs kurvan överlevnad där y är lika med 50 är den UV-bestrålning dos vid vilken 50% av jäst överleva. Screening mutanter vid denna låga procent överlevnad kan resultera i enhögre utbyte av framgångsrikt muterade stammar, särskilt för diploid jäst. Överlevnads dos 50% för WT S. boulardii, som visas i figur 2, är cirka 18.000 μJ.
      OBS: Även om sådana hög UV-doser ökar risken för mutationer i gener för andra än den auxotrofa markörgenen av intresse cellulära vägar, måste denna nackdel vägas mot behovet av att framkalla mutationer i båda kopiorna av auxotrof markörgen. För haploida stammar i vilka endast en genkopior måste muterade, screening på en högre procent överlevnad, såsom vid 90%, minskar risken för ytterligare mutationer och fortfarande tillåter tillräcklig generering av auxotrofa mutanter.
  2. UV-mutagenes och screening för auxotrofa jäststammar
    1. Förbered jäst som beskrivs i steg 1.1.1-1.1.3.
    2. Exponera jäst till dosen av UV-strålning motsvarande 50% överlevnad, som fastställs i 1.1.8. För WT S. boulardii, denna dos waär fast beslutna att vara cirka 18.000 μJ (Figur 2).
    3. Samla in 1 ml volymer av UV-bestrålade jäst och pellet genom centrifugering i en mikrocentrifug vid 16.000 xg i 1 min. Sug ut supernatant och återsuspendera cellerna i 100 ul sterilt vatten.
      1. Val av mutanter
        1. Om du använder val såsom med URA3 - auxotrofa mutanter, platta bestrålade jäst på media innehållande 5-fluororotsyra (5-FOA) för att selektera för celler som saknar ett funktionellt Ura3 enzym.
          OBS: Varje jäst innehållande funktionella kopior av Ura3 omvandlar 5-FOA till toxinet 5-fluorouracil, vilket leder till celldöd och möjliggör enkel val av URA3 - kolonier som saknar en funktionell Ura3 27. Analoga urval metoder är möjliga för LYS2 och LYS5, TRP1 och MET2 och MET15 markörer med hjälp av media innehållande α-aminoadipinsyra 28; 5-fluorantranilsyra 29; och metylkvicksilver 30,31, respektive.
        2. Pipettera 100 | il av återsuspenderade celler på minimala media innehållande 5-FOA och använda en steril spridare för att jämnt belägga plattan. Linda plattorna i Parafilm och inkubera upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar för att möjliggöra tillväxt av livskraftiga jästkolonier.
        3. Bekräfta URA3 - fenotypen av någon koloni visas på 5-FOA-plattor genom restreaking på YPD, uracil - och 5-FOA-plattor (Figur 3). Använd spetsen på en steril tandpetare för att samla in en del av en enda koloni och försiktigt dra cellerna över färska YPD, uracil - och 5-FOA-plattor. Igen inkubera lindade plattorna upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar.
          OBS: Livskraftiga kolonier visas som upphöjda, ungefär cirkulära utväxter medan icke livsdugliga celler visas endast som en ogenomskinlig smeta utan upphöjda utväxter (Figur 3).
      2. screening av mutanter
        1. Om generera en auxotrof mutant som urvalsmetoder inte är tillgängliga, förbereda serie 1:10 utspädningar av UV bestrålade jästceller i sterilt vatten och pipett utspädning på YPD media, med en steril spridare att jämnt belägga plattan.
        2. Linda plattorna i Parafilm och inkubera upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar. Avgöra vilka utspädning möjliggjorde tillväxten av individuella kolonier som lätt kan särskiljas från varandra, vanligtvis inte mer än approximativt 100 kolonier per platta.
        3. Upprepa UV-mutagenes av jästprover som beskrivs i 1.2.1-1.2.3 och platt celler vid denna bestämd utspädning. Pipett den utspädda jäst på YPD media, använd en steril spridare att distribuera cellerna och inkubera inslagna plattor upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar.
        4. Skärm för auxotrofer av replica plating på selektiva media saknar metabolit av intresse. Först, säkra en steril sammetsdyna på en tallriksställoch vänd plattan med UV-bestrålade kolonier på sammet, märkning plattorientering.
        5. Därefter invertera en färsk platta saknar metabolit av intresse på sammet och lätt tryck nedåt för att överföra celler från sammet till plattan. Lagra den ursprungliga plattan vid 4 ° C. Linda och inkubera den nya plåten upp och ner vid 30 ° C under 2-4 dagar.
        6. Som ett alternativ till replica plating, mutanter skärm genom åter ränder kolonier från YPD på selektiva medier. Använd spetsen på en steril tandpetare för att samla in en del av en enda koloni och försiktigt dra cellerna över en ny YPD-platta och en platta som saknar metabolit av intresse. Igen inkubera lindade plattorna upp och ned vid 30 ° C under 2-4 dagar.
          OBS: Var noga med att välja enstaka kolonier och strimmig ut kolonier flera gånger för att bekräfta en homogen population av sanna auxotrofa celler.
    4. Ytterligare bekräfta fenotypen av bestrålade celler genom inoculating enstaka kolonier i 5-10 ml av både YPD och media som saknar lämplig metaboliten (t.ex. i uracil - media för en URA3 - mutant). Inkubera på en rulltrumma vid 30 ° CO / N för att bekräfta tillväxt av celler i YPD-medium men inte i frånvaro av metaboliten.
      OBS: Även om tillväxtmönster på fasta medier bör tydligt ange jäst auxotrof status, är det möjligt för en del jäst att tolerera påkänningar och bildar små, långsamt växande kolonier på fasta medier men ännu inte tolerera samma villkor i flytande medier (opublicerade observationer). Ympning i flytande kulturer bör därför utföras för att grundligt bekräfta tillväxtmönster UV bestrålas mutanter.
    5. För långtidslagring av bekräftade auxotrofa mutanter, förbereda glycerolstam genom ympning cellerna i 10 ml YPD och inkubera på en rulle trumma O / N vid 30 ° C. Pelletera celler genom centrifugering under 3 min vid 2500 xg och aspirera medier. Resuspendera cellerna i 50%sterilfiltrerades glycerol, överföring till en cryovial, och förvara vid -80 ° C.
      OBS: UV muteras jäst innehåller potentiellt mutationer i andra än i auxotrof markör för ränte flera gener. Innan vi fortsätter med användning av verifierade auxotrofa mutanter, bör dessa stammar analyseras ytterligare genom gen-sekvensering och bedömning av resistens mot pH, gallsyrabindande spänningar och andra egenskaper som är relevanta för probiotiska stammar, som beskrivs på annat håll 2. Dessutom, användning av pcr homologi eller crispr / Cas9 inriktning för att mer selektivt mutera auxotrofa markörer bör betraktas som ett alternativ till UV-mutagenes 4-6.

2. Jäst Transformation

  1. LiOAc Transformation av jäst
    1. Inokulera enstaka jästkolonier i 5-10 ml YPD medium och inkubera på en valstrumma vid 30 ° CO / N.
    2. För att inducera logfas tillväxt och öka effektiviteten av plasmid-upptag, determine cellkoncentrationen med hjälp av en spektrofotometer för att mäta en 1:10 spädning av cellerna i sterilt vatten i en plast kyvett. Späd O / N kulturer att en OD 600 av 0,16-0,2 (cirka 2 x 10 6 - 2,5 x 10 6 celler / ml) i 50 ml färsk varm YPD och inkubera cellerna på en orbital plattformsskakanordning inställd på 200 rpm tills kulturen når ca 1 x 10 7 celler / ml, vanligtvis runt 4 h.
      OBS: Transformation effektivitet kan mätas som en funktion av antalet framgångsrikt transformerade jästkolonibildande enheter (CFU) per | j, g av plasmid-DNA. Ökad effektivitet resulterar i mer transformerade kolonier per | j, g av plasmid-DNA. Subodling jästceller och insamling under logfastillväxt är en faktor som ökar omvandlingseffektiviteten 12.
    3. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 2500 xg under 3 min.
    4. Aspirera supernatanten och överföra cellerna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att återsuspendera pellet i 1 ml sterilt vatten.
    5. Pelletera celler genom centrifugering vid 16.000 xg under 1 minut i en mikrocentrifug, aspirera supernatanten och tvätta cellerna genom resuspension i 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) buffert.
    6. Upprepa centrifugering och återsuspendera cellerna i TE / LiOAc buffert till en koncentration av 2 x 10 9 celler / ml.
    7. Förbereda transformationsblandningar med vardera av följande: 50 | il av beredd jäst i TE / LiOAc-buffert, 5 pl av bärar-DNA (10 | ig / | il) och 1 | il av plasmid-DNA (1 | j, g). Mikrogram plasmid-DNA kan titreras som ökande mängder av DNA kan eller kan inte leda till ökad omvandlingseffektiviteten 32
      OBS: För en mutant jäststam som saknar en auxotrof markör, kan bara en plasmid som kodar för markören omvandlas per prov. Vidare, användning av en plasmid som kodar för ett lätt detekterbart protein, såsom GFP, kommer att möjliggöra effektiv bestämning av korrekt veckning och expression av heterologa protein av jäststammen efter transformation.
    8. Till varje beredning, tillsätt 300 pl PEG / LiOAc / TE och skaka ordentligt. Inkubering av intakta celler med PEG är väsentlig för effektiv transformation 13.
    9. Inkubera beredningar vid 30 ° C under 30 min med omrörning genom att placera mikrocentrifugrör i en bägare placerades på en orbital plattformsskakanordning vid 200 rpm.
    10. Lägg 35 | il DMSO till varje reaktion och värmechock cellerna under 15 min i en 42 ° C vattenbad. Även om det finns motstridiga rapporter om den extra fördelen av DMSO 33, har värmechock av intakta jästceller visats kraftigt öka omvandlingseffektiviteten 12.
    11. Tvätta cellerna genom pelletering genom centrifugering som i 2.1.5, aspire eller pipettering bort supernatanten och återsuspendering i 1 ml sterilt vatten. pipettera försiktigt upp och ned för att bryta upp cellpelleten.
      OBS: Det är viktigt att noggrant avlägsna supernatanten eftersom medieanvändningd vid generering av kompetenta celler kan inhibera jästtillväxt och kolonibildning.
    12. Upprepa cell pellete som i 2.1.5, aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 100 pl sterilt vatten. Pipettera hela volymen på en selektiv platta och använda en steril spridare för att jämnt belägga plattan med transformerade jästen.
    13. Linda kanterna av belagda plattor i Parafilm för att förhindra uttorkning av media och inkubera upp och ned vid 30 ° C under 2 dagar för att möjliggöra tillväxt av transformerade jästceller. Framgångsrik, effektiv omvandling och auxotrofa urval av Saccharomyces cerevisiae ger ett stort antal kolonier per omvandling preparat, trots att avkastningen kan vara mycket lägre för andra stammar (Figur 4).
    14. Store jästplattor på kort sikt (vanligen 1-3 veckor) upp och ned och täckt vid 4 ° C. Bereda glycerollager av transformerad jäst, såsom beskrivs i 1.2.5 för långtidsförvaring.
      OBS: Ytterligare studier testa omvandlas CFU är nödvändigt att bestämma plasmidstabilitet och utvärdera korrekt expression av heterologt protein. Grundliga beskrivningar av plasmidstabilitet 34, användning av immunoblotting för att detektera denaturerade proteiner som återvunnits från cellprover 17, enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) för att detektera korrekt vikta tredimensionella proteiner 16 och användningen av GFP i jäststudier 35 finns tillgängliga på annat håll. Figur 6 visar en representativ bild av en framgångsrik GFP-uttryck i transformerade S. cerevisiae relativt otransformerade celler. Användning av en sådan fluorescerande protein är ett medel för att effektivt bestämma framgångsrik heterolog proteinproduktion.
  2. Elektroporering av jäst
    1. Inokulera enstaka jästkolonier i 5-10 ml YPD medium och inkubera på en valstrumma vid 30 ° CO / N.
    2. Bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en spektrofotometer för att mäta en 1:10 spädning av cellerna i sterilt vatten. diluta O / N kulturer i 100 ml färskt varma YPD media till en OD 600 motsvarande cirka 0,3. Inkubera subkulturer vid 30 ° C på en orbital plattform shaker set till 200 rpm tills den når en OD 600 av cirka 1,6, vanligen 4-5 timmar. Varje 100 ml subkultur kommer att generera tillräckligt med rade celler för två omvandlingsreaktioner.
    3. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 2500 xg under 3 min. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna genom återsuspendering i 50 ml iskallt sterilt vatten. Upprepa tvätta genom pellete celler, aspirera supernatanten och återsuspendering i färskt 50 ml iskallt sterilt vatten.
    4. Pellets cellerna igen och återsuspendera i 50 ml iskall elektroporering buffert (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2).
    5. Upprepa snurra som i 2.2.3, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Inkubera cellsuspension på en rulltrumma vid 30 ° C under 30 min. Förinkubation av cellerna i LiOAc och DTT ökar synergistiskt deneffektivitet elektroporering 36.
    6. Pellets cellerna som i 2.2.3, avlägsna supernatanten och tvätta genom återsuspendering i 50 ml iskall elektroporering buffert. Upprepa centrifugering och återsuspendera cellerna i iskall elektroporering buffert till en slutlig volym av 1 ml.
    7. Förbereda på Is: rade jästceller, sterila elektroporer kyvetter, och plasmid-DNA. Omedelbart efter slutlig resuspension av rade celler i en ml elektroporation buffert, kombinera 400 pl rade jästceller med ungefär 1 | j, g av plasmid-DNA och tillsätt till en iskall 0,2 fim elektroporeringskyvett. Användning av ökade mängder av DNA kan öka något omvandlingseffektiviteten 11. Inkubera reaktion på is i 5 minuter, sedan electroporate med elektroporator inställd på 2,5 kV och 25 iF.
      OBS: Som beskrivits i 2.1.7, kan en mutant jäststam som saknar en auxotrof markör transformeras med endast en plasmid som kodar den muterade markör per prov. Också, med hjälp aven plasmid som kodar för en lätt detekterbar protein såsom GFP möjliggör effektiv bestämning av korrekt veckning och uttryck av heterologt protein efter omvandling.
    8. Överföring electroporated celler i 8 ml av en 1: 1 blandning av YPD: 1 M sorbitol och tillåta cellerna att inkubera på en rulltrumma vid 30 ° C under 60 min.
    9. Pellets celler som i 2.2.3 och återsuspendera i 100 ^ 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Platta hela volymen på selektiva media innehållande 1 M sorbitol, linda kanterna av plattorna i Parafilm, och inkubera plattorna upp och ned vid 30 ° C under 2-5 dagar för att tillåta tillväxt av transformerade jästceller.
      OBS: Det är kritiskt för testet transformerad jäst att utvärdera korrekt expression av heterologt protein, såsom beskrivits i 2.1.14 och 2.2.7.

3. oral sondmatning av möss med transformerade jäst

  1. Utför alla förfaranden djurskötsel och hantering enligt handledningen för vård och användning av försöksdjur AnDJUR och Institutional Animal Care och godkännande användning kommittén.
  2. Förbereda O / N jästkulturer genom inokulering av enstaka kolonier av transformerad auxotrof jästen i 5-10 ml av selektivt medium. Inkubera kulturer O / N i minst 8 h på en rulltrumma vid 30 ° C till mättnad.
    OBS: Användning av plasmid som kodar för provproteiner såsom GFP kommer att möjliggöra för enkel proteinuttryck testning i sondmatades jäst, såsom beskrivs i 4.7.
  3. För maximal induktion av proteinuttryck och att inducera logfastillväxt, förbereda subkulturer från O / N kulturer genom utspädning till en OD 600 motsvarande cirka 0,16 till 0,2 i 50 ml av lämpliga medier som beskrivs i 2.1.2.
  4. Bestäm koncentrationen av subodlades celler som i 1.1.2 och justera till 10 9 celler / ml. Bered en 100 pl dos för varje mus, med några få hundra | il extra volym per grupp för att förbättra noggrannheten och lätthet av provladdning.
  5. Pelletera celler genom centrifugering vid 2500 xg under3 min eller i en mikrocentrifug vid 16.000 xg i 1 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna genom tillsats av en lika stor volym av sterilt vatten och försiktigt pipettera upp och ned.
  6. Fastställas en lämplig mätare sondmatning nål (22 G för 15-20 g möss) på en 1 ml steril spruta och last jäst prov, att se till att eliminera eventuella bubblor och ställ kolven till en 100 l steg. Läsa in ytterligare spruta med sterilt vatten till sondmatning kontrollmöss och kontrollera förekomst av kontaminerande jäst.
  7. Plocka upp musen att sondmatades med den icke-dominanta handen, med pekfingret och tummen tätt greppa huden runt halsen (figur 6A). Tuck svansen under lillfingret för att förhindra förflyttning av underkroppen. Var noga med att greppet är säker och förbjuder musen från att röra huvudet för att förhindra skador på inre vävnader under sondmatning.
    OBS: Uppskatta hur långt sondmatning nålen ska föras in genom att hålla nålen mot musen så attlampan är även med xiphoid process av bröstbenet. Sätta denna längd av nålen typiskt tillåter sondmatning nål lampan att komma in i magen.
  8. Med hjälp av dominanta handen, försiktigt in sondmatning nålen i musen matstrupen genom att vinkla nålen längs taket i munnen och svalget, hålla något till vänster om mitten. Vänta musen för att svälja lampan av nålen och låta nålen att sjunka ytterligare något till den punkt uppskattas 3,7 (Figur 6B). Om något motstånd känns under införande av sondmatning nål eller om musen när som helst börjar kippa, försiktigt bort nålen och återigen försöka hitta matstrupen.
  9. Efter musen har svalt lampan av sondmatning nålen försiktigt trycka ner sprutkolven att administrera 100 pl (10 8 CFU) av jäst direkt i musen magen.
    OBS: Även om möss är oförmögna att kräkas någon av sondmatades lösning efter administrering 18,19 21,37. Korrekt insättning av sondmatning nål, samt att justera volymen och lösningens viskositet, kan bidra till att begränsa reflux och säkerställa korrekt dosering.
  10. Försiktigt bort sondmatning nålen från mus mage och matstrupe och återgå musen till buren. Kontrollera att musen är andas och rör sig normalt efter sondmatning för att säkerställa att sondmatning nålen var korrekt insatt under hela förfarandet, och att ingen lösning sögs.

4. Skörd av Murine Peyers plack och isolering av Livskraftiga jästkolonier

  1. Vid lämplig tidpunkt efter sondmatning, typiskt 4 timmar, offer möss med IACUC godkända metoder. Kontrollera om bristande lyhördhet efter en tå nypa, och använda en sekundär åtgärd som halsdislokation att offra musen. Ytterligare tidpunkter kan också testas, såsom ett stort antal studier har visat att effektiviteten och tidpunkt för uppta över epitel är partikel beroende 38,39.
  2. Låg musen med buken helt exponerad och sterilisera buken genom sprutning med 70% EtOH. Gör en tvärgående snitt genom päls och hud med sax, försiktigt så att inte skada några inre vävnader. Manuellt bända snittet öppna ytterligare för att exponera bukhinnan, den tunna serosala foder som täcker bukorganen. Lyft försiktigt bukhinnan och göra en tvärgående snitt för att exponera tarmen.
  3. Använd noggrant trubbiga pincett för att retas tunntarmen bort från mesenteriala artärer, fett och andra vävnader. Exponera den tunntarmen från magen, i den övre vänstra kvadranten av musen buken, till blindtarmen, tjockt ficka av tarmvävnad vid början av tjocktarmen.
  4. Isolera Peyers plack genom att leta efter 1-3 mm ungefär cirkulära fläckar av ogenomskinlig vävnad längs tunntarmen (Figur 7). Med användning av krökta dissektion SCIsors, skära bort kupolen i Peyers plaque, lämnar marginaler för att säkerställa att ingen av de omgivande lamina propria uppsamlas.
    OBS: De flesta möss har mellan 4-8 lätt synliga Peyers plack. Utföra proceduren i ett område med direkt takbelysning kommer att öka den lätthet med vilken Peyers plack kan visualiseras.
  5. Collect dissekeras Peyers plack i fullständigt Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM).
    OBS: Det är viktigt att använda steril teknik och innefattar antibiotika i samlingen medier för att förhindra gastrointestinal bakteriell kontaminering av jästplattor.
  6. Stam Peyers plack genom en 40 ìm cell sil för att eliminera samling media. Tvätt Peyers plack med färskt fullständigt IMDM över en 50 ml rör och använda en kolv från en 1 ml spruta för att försiktigt bryta upp de Peyerska placken. Pellets ansträngda cellerna genom centrifugering vid 1800 rpm under 7 min. Sug ut supernatant och återsuspendera cellerna ien slutlig volym av ca 100 | j, l.
  7. Applicera ansträngda celler på selektiva jäst media och använda en plattspridare att fördela celler. Linda plåtkanter i Parafilm och inkubera plattorna upp och ned vid 30 ° C under 2 dagar för att möjliggöra tillväxten av alla livskraftiga jäst utvinnes från den murina Peyers plack.
    OBS: Ytterligare studier efter återvinning av jäst från Peyer 'patchar är nödvändigt att bekräfta att stammarna kan leverera ordentligt vikta heterologt protein till dessa immun vävnader. Som beskrivits i 2.1.14, kan sådana metoder inkluderar immunoblotting, ELISA, eller fluorescensmikroskopi för att detektera fluorescerande proteiner såsom GFP 2,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av en överlevnadskurva efter UV-bestrålning kräver plätering av utspädda jästceller så att olika kolonibildande enheter (CFU) kan bilda. Varje prov 500 | il samlas upp såsom beskrivits ovan innehåller cirka 5 x 10 6 celler; Men större än 100 kolonier per platta är svårt att exakt urskilja. Bordläggningen outspätt prov samt serie 1:10 utspädningar av bestrålade celler garanterar därmed att CFU kan räknas upp vid varje UV-dos, som visas i figur 1. CFU räkna, multiplicerat med utspädningsfaktorn, delas sedan med det totala antalet original bestrålade celler i varje prov 500 | il i syfte att bestämma procent överlevnad vid varje dos. Figur 2 visar den beräknade procentandelen av diploida vildtyp S. boulardii celler kan överleva 0 μJ, 5000 μJ, 10000 μJ, 15.000 μJ, 20000 μJ, 22.500 μJ, 25.000μJ, 35.000 μJ och 50.000 μJ. Dessa data fastställer en tydlig kurva som kan användas för att hitta den dos som motsvarar 50% överlevnad.

Efter val av UV-dos och bestrålning av jästceller, är det viktigt att skärmen mutantkolonier för att bekräfta avsaknaden av en funktionell auxotrof markörgen. Användning av en urvalsmetod, såsom beskrivs i 1.2.3.1 och visas i Figur 3, ökar avsevärt effektiviteten i fenotypen bekräftelse. Visas är ett exempel på URA3 val som drar nytta av omvandlingen av 5-FOA till toxinet 5-FU genom intakt Ura3. Analoga metoder finns för LYS2 och LYS5, TRP1 och MET2 och MET15 och öka effektiviteten av val för dessa mutationer. Man måste vara försiktig för att välja enskilda kolonier under screening. Den konsekventa tillväxt av muterade kolonier på YPD och 5-FOA, men inte uracil -, tallrikar indicates auxotrof fenotyp.

Figur 4 visar omvandlingseffektiviteten för vildtyp S. boulardii (Sb) i förhållande till ett vanligt använt laboratorium S. cerevisiae stam (Sc) med både LiOAc (LiOAc) och elektroporering (elektro) tekniker. Även LiOAc omvandling är mycket effektivt för S. cerevisiae, omvandlingseffektiviteten för S. boulardii är mycket bättre med hjälp av elektroporering. Figur 5 visar användning av fluorescensmikroskopi som ett exempel metod för att analysera korrekt proteinuttryck från transformerad jäst. Bright (A) och fluorescens (B) bilder visas för S. cerevisiae transformerad med en URA3 plasmid som kodar för GFP, visar funktionell expression av heterologt protein från den transformerade jästen. Celler kan orörlig under bättre visualisering med hjälp av täck belagda i konkanavalin A (kappa 5 pl av en 2mg / ml stamlösning i vatten på varje 22 x 22 um täck och lufttorka).

Figur 6A visar en C57BL / 6 mus hålls strax före oral sondmatning. Den handen greppar ryggen och nacken av musen ordentligt så att musen inte kan röra huvudet i någon riktning. Detta grepp tillåter sondmatning nålen placeras korrekt och med minskad risk för vävnadsskada. Figur 6B visar sondmatning nålen hålls efter musen sväljer sondmatning nål. Efter inkubationsperioden, bör tunntarmen av offrad mus noggrant retad bortsett från de omgivande vävnaderna, såsom visas i figur 7. Denna manipulation möjliggör enkel identifiering av Peyers plack och för ren dissektion av plåstren utan att samla någon av de omgivande Lamina propria. Slutligen visar figur 8 typisk återhämtning av livskraftiga jäst CFU från Peyers plack. lösningar Jäst Media och tallrikar transformations Reagens Polyetylenglykol (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g pepton 50 ml 10x TE 500 ml sterilt vatten 20 g dextros 50 ml 10x (1M) LiOAc filtrera sterilisera 10 g jästextrakt 400 ml sterilt vatten 1 L vatten filtrera sterilisera Autoklav TE 10x: YPD-plattor: PEG / TE / LiOAc: 100 mM Tris 20 g pepton 400 ml 50% PEG 10 mM EDTA 20 g dextros 50 ml 10x TE pH till 7,5 och filtrera sterilisera 20 g agar 50 ml 10x (1M) LiOAc 10 g jästextrakt 1 L vatten Autoklav 20% glukos: Uracil - selektiva medier Bärar-DNA (SS-DNA): 200 g dextros 2 g aminosyrablandning utan uracil Förvara vid -20 ° C och före användning värme för 1-2 minuter vid 100 ° C för att smälta strängar och lagra på is 1 L vatten 6,7 g jästkvävebas utan aminosyror filtrera sterilisera 1 L vatten <tr> Sterilisera genom autoklavering eller steril filtrering Tillsätt 20% glukos 1:10 före användning 50% glycerol: Uracil - plattor: Elektroporation buffert: 500 ml glycerol I en 250 ml kolv: 1 M sorbitol 500 ml vatten 2 g aminosyrablandning utan uracil 1 mM CaCl2 Autoklav 6,7 g jästkvävebas utan aminosyror Fyll på med destillerat vatten 150 ml vatten Autoklav och förvara vid 4 ° C I en 2 liters kolv: 20 g agar 750 ml vatten Autoklav kolvar separat, sedan blanda med 100 ml 20% glukos komplett IMDM 5-FOA + plattor: LiOAc / DTT 500 ml Iscoves Modified Dulbeccos media Autoklav i en 2 liters kolv: 0,1 M LiOAc 5 ml penicillin streptomycin glutamin 100x 20 g agar 10 mM DTT 500 | il 2-merkaptoetanol 750 ml vatten 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum Blanda: 2,5 ml natriumpyruvat 100 mM 6,7 g jästkvävebas utan aminosyror 2 g aminosyrablandning utan uracil 150 ml varmt vatten Låt svalna, tillsätt: 0,05 g uracil pulver 1 g 5-FOA Rör om och filtersterilisera Lägg till autoklaverad agarlösning Blanda med 100 ml 20% glukos

Tabell 1. Reagens List. Beskrivna är de reagens som behövs för att göra var och en av lösningarna, jästmedier och plattor, och omvandlings buffertar som användes för protokollen i detta manuskript.

Figur 1
Figur 1. Jäst kolonier odlas på YPD medium. Exempel YPD-platta som visar viabla kolonibildande enheter (CFU) av probiotic jäst efter UV-strålning. Cellerna späddes i serie så att enskilda CFU kan särskiljas och räknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Överlevnad kurva för diploid probiotiska jäst. Antal livsdugliga S. boulardii CFU som en procent av den totala strukna cellerna plottades för varje μJ dos av UV-bestrålning (heldragen linje). Den vertikala röda linjen indikerar den μJ UV-dos som motsvarar 50% överlevnad av denna jäststam. En rad1 S. cerevisiae mutant, som inte kan reparera skador från UV-mutagenes, visas som en kontroll (streckad linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ A>

Figur 3
Figur 3. Bekräftelse av URA3 - fenotyp UV bestrålade celler på YPD, uracil - och 5-FOA-plattor Celler från enskilda UV mutantkolonier samlades in med spetsen på en steril tandpetare och försiktigt ströks över YPD, uracil -., Och 5 -FOA plattor. Cellerna först ströks i två vinkelräta korsande linjer, då en ny tandpetare användes för att passera genom den andra linjen och fortsätter att sprida celler tills att enskilda celler separerar. En sann ura3 - mutant (mut) växer på YPD-medium och i närvaro av 5-FOA, men inte i frånvaro av uracil. Kontroll ura3 - S. cerevisiae (ura3 -) och URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) visas för jämförelse och för att bekräfta korrekt beredning av jästmedier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Transformation effektivitet Saccharomyces stammar. Vildtyp S. boulardii (Sb) och ett laboratorium S. cerevisiae stam (Sc) transformerades med användning av den beskrivna LiOAc (LiOAc) och elektroporering (elektro) protokoll. Resultaten plottas som medelvärde CFU erhölls per mikrogram av plasmid som kodar en kanamycin resistensmarkör. Staplarna visar medelvärdet av dubbla experiment med felstaplar som visar standardfelet av medelvärdet.es / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. funktionellt protein Expression av transformerad jäst. S. cerevisiae transformerad med tom plasmid (A) och plasmid kodande GFP (B) analyserades med användning av ett fluorescerande mikroskop. Fluorescens i jästceller transformerade med GFP plasmid indikerar framgångsrik produktion av funktionell GFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Korrekt hantering av en C57BL / 6 mus för oral sondmatning. Musen är hålls tightly i den icke-dominanta handen med svansen tucked under den lilla fingret så att ingen rörelse är möjlig (A). Sondmatning nål sätts in i svalget längs taket i munnen. Musen får svälja lampan av sondmatning nål, låta lösningen sedan in i magen när kolven är nedtryckt (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Upprättande och dissekering av Peyers plack. Tunntarmen är visas dissekeras bort från de andra inre organ och vävnader, med pilar som pekar på några av de Peyerska placken. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Jäst Återhämtning från Peyers plack. Ett exempel på livskraftiga CFU detekteras efter dissektion, homogenisering, och plätering av totalt Peyers patch celler från en mus sondmatades med S. boulardii. Celler ströks ut på YPD-jästmedia och odlades vid 30 ° C under 2 dagar. Typiskt utbyte av CFU återvinns per mus är mindre än 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tillsammans protokollen häri beskriver de väsentliga åtgärder som är nödvändiga för utveckling och testning av auxotrofa probiotiska jäststammar för leverans av heterologt terapeutiskt protein till tarmen. Denna manipulation och testning av rekombinant probiotiska jästen kräver metoder och resurser som ett enskilt laboratorium för närvarande inte kan vara bekant. Sålunda, även om ett stort antal tidigare studier har beskrivit de ovanstående protokoll för multipla jäst och musstammar, dessa metoder har inte till författarnas kännedom presenterats på ett detaljerat, enat form. Dessutom ställer den nuvarande manuskriptet särskild tonvikt på att anpassa nuvarande standardiserade protokoll för genmanipulation av probiotiska jäst, som är mindre väl karakteriserade än vanligen använda jäststammar laboratorie. Många steg för både mutagenes (som diskuteras i del 1) och transformation (del 2) måste optimeras för manipulering av sådan diploid probiotiska jäst isolates. Detta manuskript diskuterar också potentiella fallgropar i samband med djurhantering (del 3) och dissektion av Peyer s patch immun vävnader i tunntarmen (del 4).

Så många industriella och kliniskt relevanta jäststammar är inte omedelbart kan anpassas till storskalig genetisk manipulation, är det först nödvändigt att generera stammar såsom auxotrofa mutanter som kan odlas och utvalda utan dyra antibiotika. UV-mutagenes är en sådan metod som möjliggör en snabb ospecifik mutation av auxotrofa gener 7,41. Överlevnadskurvorna kan enkelt genereras (figurerna 1 och 2) för att bestämma den lämpliga dosen för screening mutanter. Emellertid bär detta tillvägagångssätt risken att inducera off mål-mutationer som kan påverka tillväxthastigheten eller andra egenskaper hos den jäststammen. Riktade knockouts kan i stället alstras med hjälp av PCR-konstruktioner eller crispr / Cas9 systemet. Efterföljande screening eller urval(Figur 3) av mutanter möjliggör identifiering av auxotrof jäst. Användning av val genom plätering på 5-FOA media, till exempel, tillåter snabb eliminering av alla jäst fortfarande innehåller en funktionell URA3 auxotrof gen. När det är möjligt, kan detta val strategi vara att föredra framför en skärm, som kräver analys av alla kolonier som genereras. Med antingen val eller sållning, dock, är det viktigt att utföra upprepade strimmor av individuella jästkolonier på selektiva media för att bekräfta auxotrof status.

Transformation av de alstrade mutanterna kan åstadkommas genom olika protokoll. Även LiOAc transformation är effektiv vid omvandlingen av många jäststammar, särskilt för de vanligaste laboratorie S. cerevisiae stammar, kan alternativa protokoll såsom elektroporering omvandla andra jäst isolat med större effektivitet (Figur 4). Varje ny stam ska testas USIng flera protokoll för att bestämma de optimala förhållandena för transformation. Varierande inkubationstider och koncentration av DNA, till exempel, kan påverka den totala omvandlingseffektiviteten och bör testas och optimeras för varje stam 33.

Oral sondmatning möjliggör leverans av kontrollerade doser av dessa rekombinant jäst direkt med den murina magtarmkanalen, vars immun vävnader kan därefter analyseras för jäst och heterologa proteinet. Korrekt oral sondmatning teknik (figur 6) är avgörande för att minimera djurens obehag och öka experimentell precision. Dessutom de Peyerska placken är viktiga platser för att utvärdera upptaget av rekombinant jäst från tarmen. Dessa kluster av immunvävnad är viktiga platser av antigen provtagning och induktion av slemhinnor immunsvar. Stora antigener, inklusive jäst 3-6 mikrometer i diameter, är mest sannolikt att tas upp av M-cellerna i Peyers plack i syfte att korsa gastrointestinal epitel och interagera med immunceller. Man måste vara försiktig när dissekera de Peyerska placken för att säkerställa att endast celler inifrån plåstret snarare än tarmlumen eller lamina propria samlas (Figur 7). Ytterligare åtgärder måste också tas efter dissekering för att bedöma korrekt uttryck och funktion av heterologt protein i den återvunna jäst (figur 8). Framställning av totalt protein från jäst lysat och immunoblotting är en standardmetod för att bedöma proteinuttryck; Men denna metod inte ge information om proteinveckning och funktion. För att bedöma proteinfunktion, kan jäst transformeras med en plasmid som kodar för GFP och analyseras under ett fluorescerande mikroskop efter återhämtning från Peyers plack att bedöma funktionell GFP uttryck (Figur 5).

Sammanfattningsvis visar detta manuskript en enhetlig uppsättning detaljerade försöksprotokoll som spänner steg tillbakam generering av auxotrofa mutanter för indrivning av probiotiska jäst från mus tarm. Genom att sammanställa protokoll som inte traditionellt faller inom ett område av expertis, kommer dessa beskrivningar att underlätta fortsatta studier testar immunologiska reaktioner på probiotiska jäst utformad som oral drug delivery vektorer. Författarna hoppas denna studie kommer att uppmuntra till diskussion och främja optimering av experimentella metoder för varje jäststam testas, vilket banade väg för de mest effektiva metoder för utveckling av nya probiotiska-baserade rekombinanta terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering genom Barnens Centrum för immunologi och vacciner och en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tilldelas Tracey J. Lamb. Författarna tackar också Natalya P. Degtyareva för generöst bidrag av rad1 S. cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73, (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9, (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32, (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5, (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23, (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153, (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1, (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30, (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8, (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49, (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34, (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38, (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197, (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118, (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14, (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67, (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13, (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1, (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71, (1), 312-319 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics