माउस गर्भाशय में गर्भावस्था के दौरान मातृ संवहनी remodeling के आकलन

Developmental Biology
 

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Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Colucci, F. Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (106), e53534, doi:10.3791/53534 (2015).

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Abstract

Introduction

eutherian गर्भ के दौरान पोषक तत्वों, गैसों और अपशिष्ट उत्पादों के आदान-प्रदान नाल द्वारा मध्यस्थता है। महिला प्रजनन पथ में, गर्भाशय धमनियों गर्भाशय में रक्त की मुख्य नाली हैं। आरोपण के बाद, विशेष वाहिकाओं में इन शाखा fetoplacental इकाई की ओर पतनिका basalis के माध्यम से कुंडल कि सर्पिल धमनियों बुलाया। व्यास और विशेष रूप से गर्भाशय प्राकृतिक हत्यारा (Unk) कोशिकाओं में, ल्यूकोसाइट्स से घिरे हैं, जो इन सर्पिल धमनियों की लोच, नाल 1,2 करने के लिए खंड और उपलब्ध रक्त के वेग को नियंत्रित करती हैं। सर्पिल धमनियों के पुनर्गठन का एक परिणाम के रूप में सही रक्तसंचारप्रकरण परिवर्तन गर्भावस्था की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं।

अंतर्निहित तंत्र मानव और murine गर्भावस्था के बीच विस्तार में मतभेद है, वहीं दोनों प्रजातियों में पुनर्गठन की प्रक्रिया के अंतिम परिणाम अपनी चिकनी पेशी परत खो देता है कि फैली हुई है, उच्च चालकता वाहिका है। चूहों में, Unk (यदि इंटरफेरॉन सेल व्युत्पन्नएन) γ चारों ओर मध्य हमल 3-5 पर इन परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। एन.के. कोशिकाओं या IFN-γ संकेतन मार्ग के घटकों या तो कमी है कि चूहे इन परिवर्तनों से गुजरना करने में विफल रहते हैं और इस fetoplacental इकाई के लिए एक पर्याप्त रक्त की आपूर्ति करने के महत्व पर जोर दिया, कम भ्रूण के विकास 6.7 के साथ जुड़ा हुआ है। प्रारंभिक मानव गर्भावस्था के दौरान, मध्य और अंतर्वाहिकी extravillous trophoblast के आक्रमण और Unk कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत संवहनी परिवर्तन उत्प्रेरण और भ्रूण के विकास 8-10 बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। Unk कोशिकाओं granulocyte बृहतभक्षककोशिका रूप chemokines 11 और साइटोकिन्स के माध्यम से मानव ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण आर्केस्ट्रा कर सकते हैं - कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) 12। उथला trophoblast आक्रमण ऐसे पूर्व एक्लंप्षण 9 के रूप में कम धमनी remodeling और गर्भावस्था की जटिलताओं के साथ जुड़ा हुआ है।

इस प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण वर्णित है जो ऐनी Croy की अग्रणी काम के आधार पर किया जाता हैimmunohistochemistry और सुरुचिपूर्ण हस्तांतरण प्रयोगों 5,13 के माध्यम से सफल संवहनी remodeling के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली और विशेष रूप से एन.के. व्युत्पन्न IFN-γ की भूमिका। यहाँ हम सर्पिल धमनियों के पुनर्गठन की स्थिति का आकलन करने के लिए एक तेज और किफायती तरीका का वर्णन है। हमारी प्रयोगशाला नियमित तौर पर मध्य हमल (गर्भ दिन (जीडी) 9.5) 14 पर यह आकलन है हालांकि, remodeling प्रक्रिया gd8.5 और 12.5 से 15 के बीच होता है। स्वचालित स्लाइड स्कैनर के आगमन के बहुत वर्गों से पोत और लुमेन क्षेत्रों के आकलन में मदद की है और हम इस पोत व्यास को मापने की तुलना में एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण हो पाया। SMA के प्रतिरक्षाऊतकरसायन का पता लगाने के अलावा stereological आकलन से प्राप्त परिणामों के एक सीधा सत्यापन के लिए अनुमति देता है। सभी stereological तकनीकों के साथ के रूप में, यह कम से कम दो परीक्षकों द्वारा एक अंधे प्रयोग के रूप में मूल्यांकन करने की सिफारिश की है। क्रमानुसार कटौती जब यह अंत करने के लिए, एक यादृच्छिकीकरण कदम पेश किया जा सकताटिंग नमूने स्लाइड आकलन जांचकर्ताओं नमूने आते हैं, जो प्रायोगिक समूह से पता नहीं है कि इतनी।

इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य को ध्यान से गर्भावस्था संबंधी जटिलताओं के लिए माउस मॉडल के संदर्भ में परिभाषित मातृ और पैतृक जीनोटाइप के साथ चूहों में सर्पिल धमनियों के पुनर्गठन का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करना है। परिणाम सामान्य भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक है, जो इस प्रक्रिया का Unk कोशिकाओं पर निर्भरता तनाव।

Protocol

इस पांडुलिपि में चर्चा की सभी प्रक्रियाओं ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के नियमों के अनुसार कर रहे हैं और कैम्ब्रिज एथिकल समीक्षा पैनल द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. नमूना संग्रह

  1. दोपहर में (पुरुष के प्रति 2 महिलाओं तक) वयस्क पुरुषों के साथ 8-12 सप्ताह पुरानी महिला C57BL / 6 चूहों का उपयोग समय पर संभोग की स्थापना की। जल्दी बाद के दिनों पर सुबह में शयन की निशानी के रूप में योनि प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें। सुबह के निशान gd0.5 में एक प्लग की उपस्थिति।
  2. Gd9.5 पर, ग्रीवा अव्यवस्था से पशु euthanize और उदर गुहा खुला। Vasodilatation कारण हो सकता है सीओ 2 से कि इच्छामृत्यु पर ध्यान दें।
  3. धीरे गर्भाशय धमनियों (चित्रा 1, धराशायी तीर) ligate करने के लिए दंत सोता का प्रयोग करें। गर्भाशय ग्रीवा के आसपास है, साथ ही अंडाशय के लिए प्रत्येक गर्भाशय सींग, समीपस्थ की नोक पर धमनियों के आसपास सोता बाँधो।
    नोट: इस ढह धमनियों में परिणाम हो सकता है के रूप में जहाजों टूटना मत करो।
  4. <ली> गर्भाशय सींग और गर्भाशय ग्रीवा की नोक पर तीन बंधाव अंक के लिए distally पूरे गर्भाशय excising, विच्छेदन कैंची का उपयोग जल्दी से गर्भाशय काटना।
  5. दोनों सींग गर्भाशय ग्रीवा से विपरीत दिशाओं में एक ही लंबी अक्ष के साथ गठबंधन कर रहे हैं इतना है कि एक तैयार पॉलीस्टीरिन टुकड़े पर गर्भाशय रखें। धीरे यह खिंचाव और 2-3 25 जी सुइयों का उपयोग जगह में पिन।
  6. एक तैयार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पॉलीस्टीरिन विसर्जित कर दिया। 10% formalin के साथ 50 मिलीलीटर ऊपर। कमरे के तापमान पर 5-6 घंटे के लिए ठीक करें।
  7. Formalin समाधान त्यागें और 5 मिनट के लिए 50 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ बदलें।
  8. केंद्र में गर्भाशय ग्रीवा तक proximally प्रत्येक के अंत में बंधाव बात करने के लिए और proximally दो गर्भाशय सींग आबकारी आरोपण स्थलों के आसपास किसी भी अतिरिक्त चर्बी दूर ट्रिम और formalin के निशान को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार धो लें।
  9. प्रसंस्करण तक (अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए) 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में नमूनों की दुकान।
    चेतावनी: ETHanol अत्यधिक ज्वलनशील है।
  10. तालिका 1 में संकेत मापदंडों का उपयोग कर एक स्वचालित प्रसंस्करण प्रणाली का प्रयोग करें वे गर्भाशय की लंबी अक्ष को सीधा विमान के साथ काटा जा सकता है, ताकि आयल में व्यक्तिगत रूप से सींग शामिल करें। यह प्रत्येक आरोपण साइट की अधिकतम क्षेत्र ब्लॉक (2A चित्रा) के बीच में विश्लेषण के लिए उजागर किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है।
    वैकल्पिक: यदि चाहें तो इस ब्लॉक के randomization के लिए एक सुविधाजनक समय बिंदु है।
  11. एक microtome का उपयोग करना, ब्लॉक से 7 माइक्रोन मोटाई के धारावाहिक वर्गों में कटौती। Hematoxylin और eosin के साथ हर 49 माइक्रोन अंतराल पर एक अनुभाग दाग (एच ई, खंड 2.1 देखें)। एसएमए धुंधला और अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के लिए कमरे के तापमान पर शेष वर्गों स्टोर।
: 21px; "> ज़ाइलीन
समाधान T.I.M.E तापमान
70% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
100% इथेनॉल 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
ज़ाइलीन 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
ज़ाइलीन 1 घंटा 40 डिग्री सेल्सियस
तेल 1 घंटा 63 डिग्री सेल्सियस
तेल 1 घंटा 63 डिग्री सेल्सियस
तेल 1 घंटा 63 डिग्री सेल्सियस
तेल 1 घंटा 63 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1:। गर्भाशय ऊतक के प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल की स्थापना की स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण के लिए सेटिंग्स अवलोकन

2. Stereological आकलन

  1. एच एंड ई धुंधला
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक 100% xylene स्नान में एक स्लाइड रैक में रखा स्लाइड्स डुबो कर Deparaffinize वर्गों।
      चेतावनी: ज़ाइलीन ज्वलनशील और संपर्क और साँस के माध्यम से विषैला होता है कि एक संदिग्ध कैसरजन है। इस काम के व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग कर, एक धूआं हुड में आयोजित किया जाना चाहिए।
    2. एक और 10 मिनट के लिए स्वच्छ xylene युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    3. क्रमिक रूप से 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और शुद्ध पानी युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    4. 5 मिनट के लिए, शुद्ध पानी से पतला, 50% गिल नहीं 3 hematoxylin समाधान में विसर्जित स्लाइड।
      चेतावनी: Hematoxylin घूस और आँखों के लिए संपर्क से हानिकारक है। जब हैंडलिंग उचित पीपीई पहनें।
    5. 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के अंतर्गत एक धुंधला गर्त में स्लाइड्स धो लें।
    6. 10 सेकंड के लिए (70% इथेनॉल में 1% 10 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड) 1% में एसिड / शराब समाधान विसर्जित स्लाइडऔर नल का पानी चलाने के अंतर्गत एक धुंधला गर्त में धो लें।
    7. 30 सेकंड के लिए eosin समाधान में विसर्जित स्लाइड और 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के अंतर्गत एक धुंधला गर्त में धो लें।
    8. एक धूआं हुड के भीतर, क्रमिक रूप से 5 मिनट प्रत्येक के लिए 70% इथेनॉल, 95% इथेनॉल और 100% इथेनॉल युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    9. 10 मिनट के लिए xylene युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    10. माउंट एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर coverslips। एक खुर्दबीन के नीचे स्लाइड visualizing करने से पहले एक धूआं हुड में क्षैतिज और अच्छी तरह से सूखे।
  2. पोत आकार और पुर्ननिर्माण स्थिति stereological आकलन
    1. प्रत्येक आरोपण साइट के लिए, midsagittal बिंदु के करीब हैं, जो वर्गों का निर्धारण। भ्रूण और विकासशील नाल के बीच chorioallantoic लगाव midsagittal बिंदु का एक अच्छा संकेत के रूप में कार्य करता है।
    2. विश्लेषण के लिए midsagittal बिंदु के करीब 49 माइक्रोन अंतराल पर 3 वर्गों का चयन करें। चयनित स्लाइड स्कैन करें। उद्योग जगत से बचने के लिएअधिक सतही तौर पर आरोपण साइटों 16 में स्थित होना दिखाया गया है, जो luding नसों, प्रत्येक आरोपण साइट (2A चित्रा) के केंद्रीय 2/4 पर विश्लेषण सीमित।
    3. लुमेन आकार का आकलन करने के लिए, वाहिकाओं के अंदर चारों ओर आकर्षित हैं और इस आकार के क्षेत्र में रिकॉर्ड है। कुल पोत आकार के लिए, endothelial कोशिकाओं, pericytes और अंदर का ल्यूकोसाइट्स सहित पोत की बाहरी दीवार के चारों ओर आकर्षित।
      नोट: लुमेन के लिए कुल पोत आकार के अनुपात से एक पोत के पुनर्गठन की स्थिति के लिए एक प्रॉक्सी है। वाहिकाओं अनुभाग के साथ काटा गया था कि विमान के माध्यम से तार के रूप में, एक स्लाइड में ही धमनी के कई वर्गों पार हो सकता है। एक ही धमनी कई बार मापने से बचें।
    4. सबसे बड़ा और roundest lumens के साथ प्रत्येक आरोपण साइट में 5 वाहिकाओं से माप रिकॉर्ड। तीन प्रतियों में प्रत्येक आरोपण साइट (तीन वर्गों में एक दूसरे से 49 माइक्रोन के अलावा दूरी) को मापने। इन 15 माप represe का मतलबसबसे बड़े जहाजों का मतलब व्यास एनटीएस।
    5. कुछ नमूनों में बड़े जहाजों की overrepresentation से बचने के लिए, प्रत्येक आरोपण साइट में जहाजों की संख्या में एक ही उपाय।

Immunohistochemistry का उपयोग 3. गुणात्मक मूल्यांकन

  1. Deparaffinization और रिहाइड्रेशन
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक 100% xylene स्नान में एक heatproof स्लाइड रैक में रखा स्लाइड्स डुबो कर Deparaffinize वर्गों।
    2. एक और 10 मिनट के लिए स्वच्छ xylene युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    3. क्रमिक रूप से 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल और 70% और शुद्ध पानी युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
  2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति
    1. शुद्ध पानी में एक 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर तैयार है और 10 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग पीएच 6 को समायोजित करें।
    2. पर्याप्त वाट युक्त घरेलू प्रेशर कुकर में 400 मिलीलीटर सोडियम साइट्रेट बफर और जगह के साथ 600 मिलीलीटर पकड़ कर सकते हैं कि एक heatproof कंटेनर भरेंएर कंटेनर का आधा डूब। शिथिल उबलते जब तक प्रेशर कुकर और गर्मी के ढक्कन देते हैं।
    3. प्लेस स्लाइड सोडियम साइट्रेट बफर में रैक और कसकर प्रेशर कुकर का ढक्कन ठीक। एक बार दबाव, 3 मिनट के लिए फोड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. प्रेशर कुकर depressurize और आंतरिक कंटेनर को हटा दें। स्लाइड कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सोडियम साइट्रेट बफर में शांत करने के लिए अनुमति दें।
    5. धो 5 मिनट के लिए शुद्ध पानी युक्त एक स्नान में स्लाइड।
    6. एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का उपयोग कर वर्गों घेरना।
    7. 5 मिनट के लिए पीबीएस में जलमग्न द्वारा स्लाइड्स धो लें।
  3. अंतर्जात Peroxidase और गैर विशिष्ट बंधन को अवरूध्द
    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में शुद्ध पानी में पतला 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ वर्गों को सेते हैं।
      चेतावनी: हाइड्रोजन पेरोक्साइड आंखों, त्वचा के लिए और घूस पर अत्यधिक अड़चन है। उचित पीपीई पहनें।
    2. अतिरिक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान ठोकर और SLI धोनेदेस दो बार Tris में जलमग्न द्वारा 2 मिनट प्रत्येक के लिए खारा (टीबीएस) बफर।
    3. माउस इम्युनोग्लोबुलिन निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार माउस किट पर माउस से अभिकर्मक रोकने के साथ वर्गों को सेते हैं।
    4. धो 2 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार टीबीएस में स्लाइड।
  4. चिकनी पेशी actin के Immunodetection
    1. (किट में प्रदान की) एंटीबॉडी मंदक समाधान तैयार है और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए वर्गों के साथ सेते हैं, या निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
    2. एक पतला एंटीबॉडी मंदक समाधान में 100 माउस विरोधी मानव चिकनी पेशी actin (Dako M0851)। अंतिम इम्युनोग्लोबुलिन एकाग्रता दोनों के समाधान में बराबर है सुनिश्चित करना है कि एंटीबॉडी मंदक समाधान में माउस IgG2a निर्धारण नियंत्रण पतला।
    3. पतला एंटीबॉडी या निर्धारण नियंत्रण समाधान के साथ या तो अतिरिक्त एंटीबॉडी मंदक समाधान और कवर वर्गों ठोकर। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में सेते हैं।
    4. धोने के लिए टीबीएस में दो बार स्लाइड2 मिनट प्रत्येक।
    5. Biotinylated विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं, या निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार।
    6. धो क्रमश: 2 मिनट के लिए एक बार प्रत्येक टीबीएस और पीबीएस के साथ स्लाइड।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 3,3'-diaminobenzidine (थपका) समाधान तैयार है। थपका समाधान के साथ वर्गों को कवर और अतिरिक्त रंग विकास से बचने के लिए वर्गों की निगरानी के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए 4 मिनट के लिए सेते हैं।
      चेतावनी: थपका ज्वलनशील और संपर्क और साँस के माध्यम से विषैला होता है कि एक संदिग्ध कैसरजन है। जब हैंडलिंग उचित पीपीई पहनें।
    8. धुंधला की वांछित तीव्रता तक पहुँच जाता है एक बार शुद्ध पानी में विसर्जित स्लाइड।
    9. 20 सेकंड के लिए 50% गिल नंबर 3 hematoxylin साथ Counterstain और पानी साफ चलाता है जब तक नल का पानी चलाने के अंतर्गत एक धुंधला गर्त में धो लें।
  5. निर्जलीकरण और बढ़ते
    1. एक धूआं हुड के भीतर, क्रमिक रूप से 70% ETH युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइडanol, 95% इथेनॉल और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल।
    2. 10 मिनट के लिए xylene युक्त स्नान में विसर्जित स्लाइड।
    3. माउंट एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर coverslips। पहले एक खुर्दबीन के नीचे स्लाइड visualizing के लिए एक धूआं हुड में क्षैतिज और अच्छी तरह से सूखे

Representative Results

Rag2 - / - IL2rg - / - चूहों एन.के. कोशिकाओं 17 सहित सभी परिपक्व लिम्फोसाइट, कमी है, और उनके गर्भाशय धमनियों मध्य हमल 5,14 चारों ओर congenic wildtype C57BL 6 / (डब्ल्यूटी) चूहों में देखा संवहनी परिवर्तन से गुजरना करने में विफल। चूहों stereologically एच ई-दाग वर्गों पर कल्पना और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो कुल मिलाकर छोटे जहाजों का संकेत काफी छोटे ल्यूमिनल सतह क्षेत्रों (चित्रा 2) दिखाने - / - / - - IL2rg यह कम पुर्ननिर्माण Rag2 का एक परिणाम के रूप में। इसके अलावा, (लुमेन अनुपात करने के लिए पोत) रिश्तेदार दीवार मोटाई रक्त की कम आपूर्ति और उच्च रक्त वेग, सुझाव है कि इन चूहों में सर्पिल धमनियों में अधिक है।

इस मात्रात्मक आकलन SMA के प्रतिरक्षाऊतकरसायन का पता लगाने का उपयोग कर पुष्टि की गई। WT चूहों संवहनी मीडिया के भीतर एसएमए की सबसे कम करने के लिए यह विशेषता हैमध्य हमल द्वारा सर्पिल धमनियों की। इस एन.के. सेल से चलने वाली प्रक्रिया की जगह नहीं ले करता है, एसएमए वाहिकाओं के मीडिया में रहता है और आसानी से रक्त वाहिकाओं (चित्रा 3) के आसपास के छल्ले के रूप में immunohistochemically पता लगाया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: gd9.5 पर माउस गर्भाशय, गर्भाशय सींग, गर्भाशय ग्रीवा (नीला) के सापेक्ष पदों दिखा योजनाबद्ध सिंहावलोकन आहरण एवं मुख्य गर्भाशय धमनियों (लाल)।। गर्भाशय सींग (तीर) और बंधाव अंक (धराशायी तीर) की लंबी अक्ष रहे हैं संकेत दिया। immunohistochemistry के लिए वर्गों को देखने के विमान के साथ काट रहे हैं।

चित्र 2

चित्रा 2:। के मध्य के गर्भ में धमनी remodeling के stereological आकलन (ए) उदाहरण asseपतनिका basalis के केंद्रीय 2/4 में ल्यूमिनल और गुम्मट महिलाओं से एच एंड ई दाग वर्गों पर कुल पोत क्षेत्रों के ssment gd9.5 पर (ऊर्ध्वाधर काले द्वारा सीमांकन धराशायी लाइनों)। उच्च बढ़ाई वाहिकाओं में, लाल लाइन की कुल पोत क्षेत्र, पीले धराशायी लाइन लुमेन क्षेत्र सीमांकित सीमांकित धराशायी। बार = 500 माइक्रोन (बाएं), 50 माइक्रोन (दाएं)। गर्भाशय की लंबी अक्ष इस उन्मुखीकरण में एक क्षैतिज रेखा है। डब्ल्यूटी (C57BL / 6) और Rag2 से कुल पोत क्षेत्र (सही पैनल) के लिए ल्यूमिनल क्षेत्रों (बाएं पैनल) और ल्यूमिनल क्षेत्र के अनुपात (बी) मात्रा - / - Il2rg - / - चूहों (C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर)। प्रत्येक डेटा बिंदु 15 माप (अनुभाग प्रति 5 माप, आरोपण साइट प्रति 3 वर्गों) के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। बार्स एन = समूह प्रति 4 गर्भधारण से 11-13 आरोपण साइटों का मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं; एक दो पूंछ, अयुगल मान व्हिटनी परीक्षण से पी मूल्य। गुम्मट: wildtype।

चित्रा 3:। पतनिका basalis में चिकनी पेशी actin के इम्युनोहिस्टोकैमिकल पता लगाने डब्ल्यूटी (ऊपर) और Rag2 पर प्रतिनिधि एसएमए धुंधला - / - IL2rg - / - gd9.5 पर (C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर, नीचे) चूहों। बार = 100 माइक्रोन। गुम्मट: wildtype।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफल गर्भावस्था के लिए आवश्यक हैं कि नाड़ी परिवर्तन का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करने के लिए बनाया गया है। इस मूल्यांकन के सफलता के लिए महत्वपूर्ण ऊतक वर्गों की गुणवत्ता है। दोनों सही ढंग से मज़बूती से गर्भाशय धमनियों महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं ligating के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आरोपण साइटों के गर्भ की आयु का निर्धारण। ऐसी आदि के निर्धारण के समय, ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल, के रूप में मानकों में परिवर्तन भी परिणाम को प्रभावित कर सकता है। एक निष्पक्ष stereological मूल्यांकन के लिए, यह प्रत्येक आरोपण साइट में जहाजों की संख्या में एक ही उपाय करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह आरोपण साइट और तीन प्रतियों में प्रत्येक आरोपण साइट के अनुसार 5 वाहिकाओं को मापने के लिए सिफारिश की है। इन 15 माप का मतलब 5 सबसे बड़े जहाजों का मतलब आकार का प्रतिनिधित्व करता है।

/ - - IL2rg - इसके अलावा alymphoid Rag2 के आंकड़ों के / - चूहों यहाँ दिखाया गया है, हम इस prot पायाहिचकते एन.के. कोशिकाओं 14 में से एक सहित अपर्याप्त मातृ प्रतिरक्षा समारोह के मॉडल, के एक नंबर के लिए उपयोगी ocol। धमनी पुर्ननिर्माण में दोष भी बिगड़ा trophoblast आक्रमण 18 के मॉडल में दिखाया गया है और यहाँ वर्णित तकनीक इन मामलों में वाहिका का आकलन करने के लिए सहायक हो सकता है। हम अनुकूलित और माउस में मध्य गर्भ में decidual संवहनी पुर्ननिर्माण की जांच के लिए इस प्रोटोकॉल मान्य है, लेकिन यह अन्य मॉडल सिस्टम (जैसे चूहों) या यहां तक कि अन्य अंगों में में काम करने के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए भी बोधगम्य है। हम एन.के. निर्भर पुर्ननिर्माण मजबूती के साथ gd9.5 पर मूल्यांकन किया जा सकता है कि मिल जाए, यह इस तरह मातृ वाहिका पूरी तरह से remodeled है जब gd12.5, के रूप में अन्य समय बिंदुओं के लिए संशोधन किया जा सकता है। इस समय बिंदु पर, अंतर्वाहिकी trophoblast आक्रमण 16 गहरा है और इस समय बिंदु संवहनी परिवर्तन के लिए trophoblast की भूमिका की जांच के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। अतिरिक्त मात्रात्मक readouts वांछित हैं,जांचकर्ताओं ने यह भी SMA के लिए दाग वर्गों की संख्या बढ़ाने के लिए और प्रत्येक आरोपण साइट के भीतर आंशिक रूप से remodeled वाहिकाओं के प्रतिशत का आकलन कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है ऊतकीय परीक्षाओं के वर्णनात्मक प्रकृति है। कार्यात्मक assays, हालांकि, धीरे धीरे ही (जैसे डॉपलर अल्ट्रासाउंड 19) के रूप में उपलब्ध हो रहे हैं। इन तकनीकों में तकनीकी विशेषज्ञता और प्राप्त करने और बनाए रखने के उपकरण के लिए बहुत अधिक खर्च की आवश्यकता है, लेकिन histologically मनाया जा सकता है कि परिवर्तन के प्रभाव के लिए विवो readout में एक अनुदैर्ध्य उपलब्ध कराने का फायदा है। सभी stereological परीक्षाओं का एक वापसी संभव जांचकर्ताओं की आत्मीयता है। यह अंत करने के लिए स्वतंत्र रूप से सभी नमूनों का विश्लेषण है कि दो स्वतंत्र परीक्षकों का उपयोग कर इस समस्या से बचने के लिए कर सकते हैं। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल ज्यादा खून fetomaternal इंटरफ़ेस तक पहुँच सकते हैं कि कैसे में जानकारी देता है, यह compl के साथ गठबंधन करने के लिए फायदेमंद हो सकता हैप्लास्टिक के माध्यम से वाहिका में किसी भी समय में रक्त की कुल राशि का आकलन करने का ementary दृष्टिकोण 16 डाले।

इस प्रोटोकॉल की ताकत यह दो स्वतंत्र दृष्टिकोण को जोड़ती है। संवहनी परिवर्तन पहले मात्रात्मक Stereology द्वारा मूल्यांकन किया है और परिणाम तो immunohistochemistry का उपयोग गुणात्मक मान्य है। परिणामों की विश्वसनीयता आगे नमूने randomizing से मजबूत बनाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए तैयार नमूनों आसानी से भी कड़ाई से midgestation पर एक गर्भावस्था के लक्षण प्रारूप का आकलन करने के लिए, इस तरह के decidualisation, गर्भावस्था (MLAp) या ब्याज की कोशिकाओं के immunodetection के mesometrial लसीकावत् कुल के विकास के रूप में गर्भावस्था के अन्य मानकों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

धमनी पुर्ननिर्माण महिलाओं और इन परिवर्तनों की विफलता में सीधी गर्भधारण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम महान प्रसूति सिंड्रोम (GOS), अर्थात् पूर्व एक्लंप्षण, भ्रूण के विकास प्रतिबंध और underpins हैमृत प्रसव। हम ध्यान से GOS के pathophysiology की कुछ विशेषताओं की नकल है कि माउस मॉडल में एक गर्भावस्था के लक्षण प्रारूप का आकलन करने के लिए यहाँ तकनीक मौजूद है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice (8-12 weeks old) Charles River
Dental floss
Polystyrene Used for holding tissue in place
Straight dissection scissors EMS 72940
25 G needles BD  300600 Used for holding tissue in place
50 ml conical tubes Falcon 352070
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Phosphate buffered saline Sigma P3813-10PAK
Ethanol Sigma 32221-2.5L
Paraffin Sigma 327204-1KG
Xylene Fisher Scientific X/0250/17
Automated tissue processor Sakura 6032
Microtome Leica RM2245
Slide rack Sigma Z710989
Coplin jar Sigma S5891
Purified water
Hematoxylin solution, Gill No. 3 Sigma GHS332-1L
Eosin Y solution Sigma HT110116-500ML
Fume hood
Xylene-based mounting media VWR 361254D
Slide scanner Hamamatsu NanoZoomer
Slide scanner software Hamamatsu NDP viewer
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 32320 Make 10 mM solution and adjust pH to 6
Pressure cooker Used for antigen retrieval
Heating plate Used for antigen retrieval
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H/1800/15
Tris buffered saline Sigma T6664-10PAK
Mouse on mouse kit Vector BMK-2202 Significantly reduces background
Mouse anti-human smooth muscle actin DAKO M0851 Cross-reacts with mouse
IgG2a isotype control DAKO X0943
Humidified chamber Sigma H6644
3,3’-Diaminobenzidine solution Sigma D4293-5SET
Hydrochloric acid Fisher Scientific H/1050/PB17

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References

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