DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Biology

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Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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Abstract

Introduction

Einzelne Muskelfasern sind groß, hoch organisierte Syncytial-Zellen. Es gibt einige Zellkulturmodelle für Muskel; jedoch haben diese Modelle als ihre wichtigste Einschränkung, dass sie nicht vollständig zu reifen Muskelfasern unterscheiden. Beispielsweise werden die C2C12 und L6-Zelllinien von Mäusen und Ratten, jeweils 1-4 abgeleitet sind. Unter den Bedingungen der Serumentzug, die einkernigen "Myoblasten-like" Zellen aufhören Proliferation, Zellzyklus Entzug zu unterziehen, und geben Sie in die myogenen Programm bildet kernige Zellen mit Sarkomere, die so genannte Myotuben. Bei längerer Kulturbedingungen kann Myotuben Kontraktionseigenschaften aufweisen und "zucken" in der Kultur. Menschlichen Zelllinien wurden auch jetzt 5 etabliert. Neben diesen immortalisierten Zellinien können einkernige Myoblasten aus Muskel- und unter den gleichen Bedingungen von Serumentzug wird Myotuben Form isoliert werden. Diese Zelllinien und Primär Myoblastenkulturen sind hoch verwendenvoll, da sie die mit Plasmiden transfiziert oder transduziert mit Viren und zur Basiszelle biologische Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind diese Zellen, selbst wenn veranlasst, Myotuben zu bilden, fehlt vielen der wichtigsten Merkmale von reifen Muskel Organisation. Insbesondere sind Myotuben viel kleiner als einzelnen reifen Muskelfasern und nicht über die normale Form der Muskelfasern. Kritisch Myotuben fehlt Quer (T-) Tubuli, die membranartige Netzwerk für effiziente Ca 2+ Freisetzung der gesamten myoplasm erforderlich.

Eine alternative Methode zur primären Myoblasten oder myogenen Zelllinien bringt mit reifen Muskelfasern. Transgenese verwendet werden, um die Expression von markierten Proteinen herzustellen, jedoch ist dieses Verfahren kostenintensiv und zeitraubend ist. In vivo Elektroporation von Maus-Muskel wurde als ein bevorzugtes Verfahren zu seiner Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit 6-10 entstanden.

Verfahren zur in vivo Elektroporation und effiziente Isolierung von Muskelfasern have für die Maus flexor digitorum brevis (FDB) Muskel 6 optimiert. Die Verfahren können leicht durchgeführt werden und sind minimal-invasive in vivo-Expression von Plasmiden zu induzieren. Dieser Ansatz wird jetzt mit hochauflösenden bildgebenden Verfahren einschließlich Bildgebung nach der Laser Störung des Sarkolemma 6,7 kombiniert. Die Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen und die Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um zellbiologische Prozesse in reifen Muskelfasern zu überwachen.

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Protocol

Die Methoden in dieser Studie wurden im ethischen Übereinstimmung mit der Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt genehmigten Richtlinien. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren.

1. Experimentelles Verfahren zur in vivo Elektroporation des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel in Maus-

  1. Design Plasmide zur Expression in vivo einen Promotor verwendet, bekannt, in Säugetierzellen zu exprimieren (zB Cytomegalovirus, CMV) oder im Muskel (zB Muskelkreatinkinase, MCK) 6,7. Größere Plasmide können auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Der CMV-Promotor wurde umfassend 6,7 verwendet.
  2. Reinige Plasmide aus E. coli mit Endotoxin-freien Bedingungen den Anweisungen des Herstellers. Löse das Plasmid in sterile, endotoxinfrei TE Puffer bei 2-5 & mgr; g Plasmid / ul.
  3. Verdünnen und aliquotieren das Plasmid zu einem concentration von 20 ug DNA in 10 ul sterilem endotoxinfreiem TE (2 ug / ul) Puffer pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine aliquote Menge pro Injektion.
  4. Verdünnen Sie die Lager von Hyaluronidase, um mit sterilem Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium 1x (PBS - / -) was eine Endkonzentration von 8 Einheiten. Aliquot 10 ul verdünnt Hyaluronidase pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Betäuben die Maus mit 2,5% Isofluran, bis sediert und reagiert nicht mehr bis zum Schwanz oder Zehen Kneifen. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Heizkissen oder Wärmetisch zur normalen Körpertemperatur zu halten.
  6. Reinigen Sie die Fußballen der Maus mit einer alternierenden Anwendung einer Povidon-Iod-Peeling und Alkohol dreimal unter Verwendung eines Prep-Technik von der Nadel Website Ursprung und strahlende nach außen. Diese Technik hält die Nadel Website in einem aseptischen Zustand, Minimierung Erreger Einführung.
  7. Spritzen Sie die Fußballen von the Maus mit 10 ul 1x-Hyaluronidase-Lösung (2 mg / ml = 8 Einheiten) zwischen der Haut und den Muskel unter Verwendung einer sterilen 1 ml-Spritze. Hyaluronidase verdaut Komponenten der extrazellulären Matrix zu effizienteren Eintrag der Plasmid in Muskelfasern ermöglichen. Geben Sie an der Basis der Ferse und vorab die Nadel in Richtung der Zehen. Langsam lassen Sie die Flüssigkeit, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Die Injektionsstelle unter die Haut dehnt sich und beginnen, rosa drehen.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 auf der kontralateralen Fuß.
  9. Trennen Sie die Anästhesie und die Maus wieder in den Käfig. Lassen Sie die Maus, um in vollem Umfang von der Anästhesie erholen.
  10. Warten Sie 2 Stunden.
  11. Wiederholen Sie die betäubende und Fuß Sterilisationsverfahren, die Schritte 1.5 und 1.6.
  12. Spritzen Sie die verdünnte Plasmid-DNA in den Fußballen auf die gleiche Weise wie die Hyaluronidase. Sicherzustellen, dass das maximale Volumen beträgt 20 & mgr; l oder weniger. Für Dual-Plasmid-Expressions injizieren 20 ug jedes Plasmids mit einem maximalen Volumen von 20 &# 181; l oder weniger.
  13. Wiederholen Sie den Plasmid-Injektion auf der kontralateralen Fußballen oder verwenden Sie den kontralateralen Fuß für Steuereinspritzungen.
  14. Auf dem Fuß, die zunächst eingespritzt wurde, heben Sie die Haut von der Unterstreichung Muskel mit feinen Pinzette und legen Sie eine 27 G-Nadel durch die Kugeln der Haut in der Nähe der Zehen in einer Position senkrecht zu der heilen Zehenlinie des Fußes. Nehmen Sie einen zweiten sterilen 27 G-Nadel und legen Sie sie horizontal durch die Haut an der Ferse. Ort Nadeln parallel zueinander ~ 1 cm auseinander.
  15. Verwenden Krokodilklemmen, Klemmelektroden zu den parallelen Nadeln dafür, dass die Nadeln nicht miteinander in Berührung kommen. Die Verwendung von Modelliermasse können die Klammern zu befestigen.
  16. Verbinden Elektroden zu einem elektrischen Stimulator.
  17. Elektroporieren den Muskel durch Anwenden 20 Impulse, 20 msec Dauer / jedes bei 1 Hz, bei 100 V / cm. Die Zehen können mit Stimulation zucken.
  18. Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren auf der kontralateralen Fuß, falls erforderlich.
  19. Nadeln zu entfernen. Wischen Sie den Fußballen Povidoniod Gestrüpp.
  20. Schalten Sie die Anästhesie. Bringen Sie die Maus, um die Erholung Käfig und Überwachungstätigkeit. Wenn das Verfahren wurde durchgeführt, wie erwartet, sollte das Tier normale Gehfähigkeit innerhalb von 30 Minuten wieder zu erlangen und zeigen keinen Unterschied in der Gehfähigkeit oder Aktivitätsniveau von vor der Einspritzverhalten. Daher werden keine post-Verfahren Analgetika nötig. Bei der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier zum Tiergehege.
    Achtung: Die Proteinexpression kann so früh wie 48 Stunden nach der Elektroporation untersucht werden. Allerdings, mehr vollständige Wiederherstellung nach der Elektroporation zu ermöglichen, ziehen wir die Isolierung und Untersuchung von Muskelfasern 7 - 14 Tage nach der Elektroporation 10. Expression untersucht werden, solange 4 Wochen nach der Elektroporation werden.

2. Experimentelles Verfahren zur Isolierung des M. flexor digitorum brevis (FDB) Fibers

  1. Thaw Kollagenase. Für jede FDB Bündel bereiten zwei Vertiefungen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte. In einer gut hinzufügen, 1 ml vorgewärmtes Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium sowie Rinderserumalbumin (DMEM + BSA) und in der anderen auch 1 ml vorgewärmten Ringers Lösung. Darüber hinaus fügen Sie frisches 10 ml 1x Ringers Lösung für die 35 mm Sylgard Gericht.
  2. Opfern das Tier durch CO 2 oder Narkosegas Inhalation, gefolgt durch Genickbruch oder eine andere Methode, um den Tod zu gewährleisten.
  3. Entfernen Sie die Hinterfüße oberhalb des Sprunggelenks mit einem sauberen Rasierklinge und tauchen in 1x Ringer-Lösung in den 35 mm Sylgard Gericht.
  4. Pin einen Fuß eng, Sohle nach oben, auf die Sylgard Gericht mit 30 G Nadeln durch jede der 5 Zehenspitzen und am Knöchel.
  5. Beginnend am Knöchel, schnippeln die Haut gerade an der Seite des Fußes entlang der Haaransatz in Richtung der Zehen, darauf achten, nicht nick die Muskeln unter der Haut. Wiederholen Sie auf der anderen Seite des Fußes.
  6. Halten Sie die Haut an der Unterseite des oberen Sprunggelenks mit feinen Pinzette, schneiden Sie die Haut über der Ferse.
  7. Anheben der HautKlappe mit einer Pinzette, zeigen Sie mit einer Schere in Richtung auf die Haut, um nicht nick der Muskel. Snip die zugrunde liegende Bindegewebe, die Haut effektiv zu entfernen.
  8. So entfernen Sie die FDB Muskelbündel schneiden die großen Sehne an der Ferse, um die Sehne vom Knochen zu befreien. Halten Sie die Sehne mit einer Pinzette, sezieren die FDB Bündel von der großen weißen Sehne sorgfältig Entfernen von Bindegewebe mit einer Schere auf die FDB angebracht. Wenn man es richtig macht das Bündel leicht abheben der zugrunde liegenden Sehnen enthüllt hellen weißen Sehnen, die zu den einzelnen Ziffern. Schneiden Sie die FDB an den Sehnen in der Nähe von den Zehen zu befreien das Bündel aus dem Fuß.
  9. Legen Sie die gesamte Muskelbündel in der auch das DMEM + BSA.
  10. Wiederholen Sie auf der kontralateralen Fuß.
  11. Sobald alle FDB Muskeln isoliert, fügen Sie 100 ul von Kollagenase in jede Vertiefung DMEM + BSA und Muskeln.
  12. Überprüfen Sie den Erfolg der Elektroporation auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor dem Aufschluss. Wenn getan properly, nach oben von 90% Transfektionseffizienz erzielt werden.
  13. Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 37 ° C-Inkubator bei 10% CO 2 für ca. 1 Std. Die Inkubationszeit kann je nach Krankheitsmodell und Hintergrund und die Menge von Kollagenase variieren.
  14. Nach 1 Stunde sorgfältig überweisen Sie den FDB-Bundle zum Brunnen, die nur Ringerlösung.
  15. Man reibt die FDB Bündels in der gut mit der Ringer-Lösung unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze mit einem sauberen Rasierklinge, so dass das Bündel kann leicht durch die Pipettenspitze passieren. Verreiben Sie vorsichtig die Muskeln (~ 15-mal) so dass die Bündel, um sich parallel zu der Spitze vorbei und. Intakten Fasern werden in die Ringer-Lösung fallen ab. Wenn Fasern nicht leicht fallen aus dem Bündel, legen Sie die Muskeln wieder in Kollagenase-Lösung.
  16. Teller der isolierten Fasern auf dem Teller ~ 500 ul pro Platte.
  17. Erlauben der Muskel in der Vertiefung für 15 Minuten zu verdauen.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 2.152,17 bis das Bündel in der Größe abnimmt und die Mehrheit der Fasern aus dem Bündel (üblicherweise insgesamt 2-3 mal) dissoziiert. Sobald dissoziiert der Muskel leicht durch eine 1 ml Pipettenspitze gelangt.
  19. Lassen Fasern zu befestigen, um die Schale für mindestens 15 min. Frisch Ringers-Lösung kann in Abhängigkeit von Zeitbeschränkungen an der Platte aufgenommen werden, um restliche Kollagenase verdünnen oder verändert.
    Hinweis: Die Fasern sind nun bereit für die Bildgebung.

3. Versuchsdurchführung zur Visualisierung von Laserinduzierte Membranschädigung mit konfokale Mikroskopie

  1. Lastfasern unmittelbar vor dem Gebrauch mit 300 ul von 2,5 uM FM 1-43 FM 4-64 Farbstoff in Ringers Lösung Bildgebung. Generell Bildfasern 15 min bis 2 h nach der Isolierung. Allerdings können Fasern bis zu 24 Stunden nach der Isolierung abgebildet werden.
  2. Setzen Sie den Glasboden Teller auf einem konfokalen Mikroskop mit einem UV-Laser und einem 60X / 63X Ziel ausgestattet.
  3. Suchen Sie eine Faser. Stellen Sie sicher, die Faser fest verbundenin die Schale durch Antippen der Mikroskopbasis. Fasern, die bei der Spaltung beschädigt wurden auszuschließen. Beschädigte Fasern können Membran Blasen, Aufnahme hoher FM Farbstoff, Locke enthalten oder biegen intensiv.
  4. Um Membranschäden auf der Faser zu induzieren, positionieren Sie den Sarkolemma im Zentrum des Abbildungsfenster mit einem Feld weg von Kernen. Konzentrieren Sie sich auf die Sarkolemma mit der FM-Farbstoff-Kanal, so dass das Sarkolemm ist extrem scharf.
  5. Setzen Sie den ROI Fadenkreuz auf dem Sarkolemma Verwendung des FM 4-64 Kanal.
  6. Bestrahlen einer 1 Pixel Punkt bei 80% Leistung für 3 Sekunden (~ 350 nm x 350 nm-Bereich). FM Farbstoff wird die Zelle an der Stelle der Verletzung geben. Leistung und Zeit eingestellt werden kann zur Erhöhung oder Verringerung der Fläche Insult.
  7. Machen Sie Bilder von der Faser vor Beschädigungen, zum Zeitpunkt der Beschädigung, alle 2 Sek post-Schäden, danach alle 10 Sekunden bis zu 5 min. Timing kann je nach Bedarf eingestellt werden. Einzelne Bilder können zum Zeitraffer-Filme in Bild J. umgewandelt werden
  8. Wiederholen Sie die Schritte3,3 bis 3,7 auf bis zu 3 Fasern pro Gericht.

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Representative Results

Elektroporation ist eine minimal invasive Technik, die effizient stellt gereinigte Plasmid-DNA in der flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel (Figur 1A). Sieben Tage nach der Transfektion fluoreszenzmarkierten Proteins in isolierter Muskelfasern (1B) visualisiert. Isolated Fasern werden dann ausgestrichen und für die Bildgebung vorbereitet auf einem konfokalen Mikroskop. Fasern können laserinduzierte Schädigung unterzogen werden. FM Farbstoff kann verwendet werden, um den Ort der Membranschäden zu identifizieren (Abbildung 1c)

Während der Verdauung, kann eine kleine Anzahl von Muskelfasern verletzt werden (weißer Pfeil) (2A). Beschädigten Muskelfasern durch vorliegende Membranblasenbildung am Sarkolemm (schwarzer Pfeil) identifiziert werden. Der beschädigte Faser ist nicht geeignet für weitere Experimente und sollte nicht verwendet werden. Repräsentative konfokalen Bildern, die die Expression ofa fluoreszierendes Fusionsprotein innerhalb der isolierten Muskelfasern 2B. Verwendung des CMV-Promotors steuert optimale Proteinexpression in Muskelfasern. DIC-Bildgebung zeigt eine optimale Faser. FM 4-64 ist an der Membran bei niedrigen Pegeln vor Beschädigungen (2C) vor.

Repräsentative Bild eines myofiber mit FM 4-64 auf einem Leica SP 5 konfokalen Mikroskop abgebildet wird geladen. Die Sarkolemma wird im Sichtfeld (weiße Kästchen) und ROI Fadenkreuz (weiß x) zentriert ist auf dem gestochen scharfen, fluoreszierende Rand des Sarkolemm in einem Gebiet ohne myonuclei (Abbildung 3, Mitte) ausgerichtet ist. Kerne werden vermieden, da sie FM Farbstoff Analyse Beitrag Bildgebung beeinflussen können. Bei Membranschädigung minimal tritt FM Farbstoff normalen Muskelfasern (Abbildung 3, rechts). Muskelfasern in Membran repariert defekte hängt laserinduzierten Schäden erhöhten FM Farbstoffaufnahme anzuzeigen.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der in vivo Elektroporation und Laser Damage-Protokoll. (A) Hyaluronidase in den Fußballen eines betäubten Maus injiziert. Plasmid-DNA wird dann eingespritzt und Spannung angelegt wird. (B) Sieben Tage nach der Injektion, die flexor digitorum brevis (FDB) Bundle (weißer Pfeil Mitteltafel) aus dem Fußballen und hinterließ exponierten Sehnen (schwarzer Pfeil) isoliert. (C) Fasern werden plattiert und Laser-induzierte Schäden an lebenden Muskelfasern durchgeführt. Linkes Bild, Skala 50 um. Rechten Fensterskala 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Isolierte Muskelfasern Ausdruck fluoreszenzmarkierten Proteine. Sieben Tage nach der Elektroporation, wird die Proteinexpression in der gesamten myofiber erkannt. (A) Die Isolierungsverfahren führt zu einer kleinen Anzahl von unbrauchbaren Muskelfasern mit unterschiedlichen Membranblasenbildung (schwarzer Pfeil) und Membranstörungen (weißer Pfeil). Maßstab 5 um. (B) Repräsentative Bild einer gesunden myofiber. Gleichmäßig verteilt Sarkomere sind in DIC-Bildgebung (links) sichtbar gemacht. Ein myofiber ausdrücken Annexin A6 getaggt mit GFP (Mitte). Es ist minimal FM Farbstoffsignal vor Beschädigungen (rechtes Bild). Maßstab 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Ausrichtung der LaserFadenkreuz auf dem FM-positive Sarkolemm. Die Region von Interesse auf der Sarkolemma im Sichtfeld zentriert ist. Die Sarkolemma vergrößert (weiß gepunkteten Kasten) und ROI Fadenkreuz auf die scharfe FM-positiven Flanke des Sarkolemm in einem Gebiet ohne Kerne (Mitte) ausgerichtet ist. Bei Schäden, geht FM Farbstoff an der Verletzungsstelle (rechtes Bild, weißer Pfeil). Maßstab 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Verwendung der Elektroporation zur fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in vivo zu untersuchen ist besonders für die Untersuchung von Muskeln aufgrund der Abwesenheit von geeigneten Zellinie Modelle, die die gesamte Zellstruktur des Muskels originalgetreu geeignet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Elektroporation und hochauflösende konfokale Mikroskopie, detaillierte Darstellung von Protein-Lokalisierung und Translokation nach der Laser Verwundung bereitzustellen. Diese Methode lässt sich an andere zelluläre Prozesse wie Zellskelett Reorganisation, Menschenhandel, und die Fusion zu untersuchen.

Unter Verwendung dieses Protokolls bis zu 90% der Muskelfasern im FDB Muskelbündel express Plasmid, und dies kann leicht durch Fluoreszenzmikroskopie vor und nach myofiber Dissoziation gesehen werden. Es ist typischerweise ein Gradient von Ausdruck näher an der Injektionsstelle beobachtet höhere Expression. Wegen des Gradienten des Ausdrucks kann der Effekt der Variation der Proteinexpression her überwacht werdenma einzigen Experiment. Wie bei allen Transfektionsverfahren wird dieser Ansatz von Fragen im Zusammenhang mit Überexpression verbundenen Kosten beschränkt. Bemerkenswert ist, mit Expression auf hohem Niveau, kann die Proteinaggregation auftreten. Nach unserer Erfahrung zeigt, das mCherry Fluoreszenzmarkierung weitere Aggregation als die Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) tag Reduzierung Auflösung und Schärfe der Proteindomänen (zum Beispiel siehe Abbildung 4 in 7). Zusätzlich mTurquise2 und Venus Fluoreszenzmarkierungen beide zeigen, ausreichende Fluoreszenz Ausdruck. Allerdings sind beide Proteine ​​weniger hell als eGFP.

Dieses Verfahren kann auf Bild lebenden Muskelfasern unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich Tests pharmazeutischer Wirkstoffe und Zell Verwundung verwendet werden. Wir verwendeten Laser Schädigung des Sarkolemm stören, aber andere Verwundung Prozesse könnten diesem Verfahren angepasst werden. Zu diesem Zweck ist die Bildung von Bläschen Membran durch osmotischen Schock sowie Membranschäden durch Rollglasperlen kann auch induziert geschaffenVerwendung beurteilt elektroporiert Muskelfasern 11,12. Für Laser Verwundung, wird die Art und Leistung des Lasers, sowie das Ziel die Länge der Zeit benötigt, um eine Membran Läsion 13,14 erstellen beeinflussen. Ferner werden externe Puffer, insbesondere die Konzentration von Calcium und FM Farbstoff innerhalb des Puffers den Reparaturprozess 13,15 beeinflussen. Diese Methode wurde auf beiden Nikon und Leica konfokalen Abbildungssysteme getestet und beide in der Lage, der die Technik sind. FM 4-64 ist für Experimente mit grün fluoreszierende Protein 7 geeignet. Andere haben FM 1-43, eine andere lipophile Farbstoff, negativ geladene Phospholipide bindet mit einem Anregungsmaximum bei 470 nm und Emissionsmaximum bei 610 nm, was die Anwendung dieses Farbstoffs 13,15,16 einschränkt. Photobleichen und Phototoxizität sind beide möglichen Ergebnisse aufgrund von Über Bildgebung. Bestimmung der richtigen Balance zwischen Belichtungszeit, Bildfrequenz und Anzahl der Kanäle abgebildetParameter sind leicht zu manipulieren, um diese Effekte zu reduzieren.

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Disclosures

Es gibt keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health NS047726, NS072027 und AR052646 unterstützt gewährt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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