ट्यूमर सेल प्रवासन और रोगी-विशिष्ट एंटी-इनवेसिव ड्रग्स के प्रभाव के अध्ययन के लिए एक मानव ग्लोबब्लास्टोमा ऑरोगोटेपिक स्लाइस कल्चर मॉडल

Medicine

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Summary

ग्लूब्लास्टोमा (जीबीएम) के वर्तमान पूर्व विवो मॉडल मानवीय ट्यूमर आक्रमण के शारीरिक अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यहां, हम नए मानव जीबीएम टिशू से अंगोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों के निर्माण और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। समय-चूक माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक सेल प्रवासन विश्लेषण तकनीकों का वर्णन प्रदान किया गया है।

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Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. J. Vis. Exp. (125), e53557, doi:10.3791/53557 (2017).

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Abstract

सर्जरी, रसायन चिकित्सा, और विकिरण चिकित्सा के बावजूद ग्लिब्ब्लास्टोमा (जीबीएम) एक बेहद खराब नैदानिक ​​रोग का निदान जारी रखता है। आसपास के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रगतिशील ट्यूमर आक्रमण एक स्थायी चिकित्सीय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। जीबीएम के लिए स्थलांतरण चिकित्सा विकसित करने के लिए, मॉडल सिस्टम जो नियंत्रित प्रयोग के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक पृष्ठभूमि प्रदान करते हैं, आवश्यक हैं। यहां, हम सर्जिकल रेशों के दौरान प्राप्त जीनबीएम ऊतक से टुकड़ा संस्कृतियों को पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इन संस्कृतियों पशु एक्सनोग्रेट्स या एकल सेल संस्कृतियों के माध्यम से बिना उत्तरार्द्ध के पूर्व विवो प्रयोग के लिए अनुमति देते हैं इसके अलावा, हम समय-चूक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी सेल ट्रैकिंग के साथ संयोजन में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार की मात्रात्मक व्यवहार का अध्ययन और चिकित्सीय विज्ञान के लिए संबंधित प्रतिक्रिया का वर्णन करते हैं। शल्य चिकित्सा के ऊतक अधिग्रहण के 90 मिनट के भीतर स्लाइस प्रतिजन उत्पन्न होते हैं। रेट्रोवायरली-मध्यस्थता वाले फ्लोरोसेंट सेल लाबेलिंग, कन्फोकल इमेजिंग, और ट्यूमर सेल माइग्रेशन विश्लेषण को दो सप्ताह की संस्कृति के भीतर पूरा किया जाता है। मानव जीबीएम में बढ़ते प्रवासी व्यवहार से संबंधित आनुवंशिक कारकों को उजागर करने के लिए हमने इन स्लाइस संस्कृतियों का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इसके अलावा, हमने एंटी-माइग्रेशन थेरेपिज़ के जवाब में रोगी-विशिष्ट भिन्नता का पता लगाने के लिए मॉडल की क्षमता को मान्य किया है। आगे बढ़ते हुए, मानव जीबीएम टुकड़ा संस्कृतियां, चिकित्सकीय एजेंटों के लिए ट्यूमर की संवेदनशीलता के तेज पूर्व विवो मूल्यांकन के लिए एक आकर्षक मंच हैं, ताकि व्यक्तिगत न्यूरो-ऑनकोल्जिक थेरेपी अग्रिम कर सकें।

Introduction

ग्लोबोब्लास्टोमा (जीबीएम) का प्रयोगशाला अध्ययन, ऐसे मॉडल की कमी से बाधित है, जो मानवीय रोगों की आवश्यक पाथोलोगिक विशेषताओं को ईमानदारी से दोहराता है, अर्थात् ट्यूमर सेल प्रवासन और आक्रमण। इन 2 संदर्भों में 2 डी और 3 डी के इन विट्रो आक्रमण आक्रमणों के साथ तुलनात्मक अध्ययनों के साथ-साथ 3 डी कृंतक टुकड़ा संस्कृति मॉडल ने यंत्रवत् रूप से भिन्न सेलुलर प्रवास कार्यक्रमों का खुलासा किया है, जो संभावित रूप से 2 डी सिस्टम से मानव रोग 1 , 2 , 3 के निष्कर्षों की अनुवाद क्षमता सीमित कर रहे हैं। यहां वर्णित अंगोटीपिक ट्यूमर स्लाइस कल्चर और इमेजिंग प्रतिमान से सर्जरी के लसीकरण से प्राप्त पूर्व विवो मानव ट्यूमर के टिशू के स्लाइस में ट्यूमर सेल प्रवासन के अध्ययन के लिए अनुमति मिलती है। इस प्रकार, समय-समाप्त confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में शल्य चिकित्सा resected ट्यूमर के ऊतक के टुकड़े संस्कृतियों देशी में ट्यूमर सेल प्रवासन का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदानऊतक विघटन या संस्कृति उत्कर्ष के बिना microenvironment

ट्यूमर आक्रमण 1 , 2 , 3 , 4 , 5 का अध्ययन करने के लिए मानव ट्यूमर एक्सनोग्राफ्ट, रेट्रोवायरल प्रेरित ट्यूमर, और सेलुलर ओवरले से उत्पन्न जीबीएम के कृंतक मस्तिष्क स्लाइस कल्चर मॉडलों का व्यापक प्रकाशन है। हाल ही में, कई समूहों ने मानव जीबीएम ऊतक 6 , 7 , 8 , 9 , 10 से सीधे ऑर्गोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन किया है। हालांकि, स्लाइसिंग तकनीक और संस्कृति मीडिया के संबंध में प्रकाशित प्रोटोकॉल के बीच चिह्नित भिन्नताएं हैं। इसके अलावा, अंगोटीपिक स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग ने स्थैतिक प्रयोगात्मक समापन बिंदुओं पर केंद्रित किया है जिसमें सेल सिग्नल में परिवर्तन शामिल हैंएनजी, प्रसार, और मृत्यु यहां वर्णित प्रोटोकॉल समय-विलंब लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से गतिशील ट्यूमर सेल व्यवहार के समय-सुलझा प्रेक्षण को शामिल करके पूर्व स्लाइस संस्कृति मानदंडों पर फैलता है। आंतरिक 11 की खोज और इंट्राममोरल 12 , मानव जीबीएम में 13 आनुवांशिक विविधता ट्यूमर सेल व्यवहार के साथ इस विविधता को जोड़ने और चिकित्सा के ट्यूमर प्रतिक्रिया पर इसके निहितार्थ को महत्व देते हैं। यहां, हम एक वास्तविक कैसटर टिश्यू से सीधी स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग के लिए एक सुव्यवस्थित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं ताकि निकट वास्तविक समय में ट्यूमर सेल माइग्रेशन की कल्पना कर सकें।

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Protocol

रोगी ऊतक के नमूनों का संग्रह शुरू होने से पहले सूचित किया जाता है कि प्रत्येक रोगी से अनुमोदित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के तहत सहमति प्राप्त की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लेखकों को कोलोराडो विश्वविद्यालय और इनोवा फेयरफैक्स अस्पताल विश्वविद्यालय में अनुमोदित आईआरबी प्रोटोकॉल के तहत वर्णित कार्य के लिए सहमति प्राप्त हुई। रोगियों की देखभाल के फैसले को निर्देशित करने के लिए इन स्लाइस संस्कृतियों से एकत्र आंकड़ों का इस्तेमाल नहीं किया गया।

1. पूर्व-टुकड़ा करने की तैयारी तैयार करना

  1. ट्यूमर प्रसंस्करण मीडिया और "टुकड़ा संस्कृति रखरखाव" मीडिया को ट्यूमर लिक्शन और टिशू संग्रह (या पहले 2 सप्ताह के भीतर पहले उत्पन्न मीडिया का उपयोग) के पहले दिन तैयार करें। ऊतक प्रोसेसिंग माध्यम को उत्पन्न करने के लिए एक उच्च ग्लूकोज डीएमईएम के 500 एमएल तक पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (10,000 यू / एमएल) के 5 एमएल और 1 एम एचईपी के 5 एमएल जोड़ें।
  2. न्यूरॉनल माध्यम के आधार ( उदाहरण के लिए , न्यूरोबैसल) का उपयोग करके 250 मिलीलीटर का टुकड़ा संस्कृति रखरखाव मीडिया तैयार करेंहंट फिनोल लाल 10 मिमी एचईपीईएस, 1x बी -27 पूरक, 400 माइक्रोग्राम एल-ग्लूटामाइन, 600 माइक्रोन एल एलएनल-एल-ग्लूटामाइन डायपेप्टाइड, 60 यू / एमएल पेनिसिलिन, 60 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 6 यू / एमएल नास्टैटिन के साथ इस माध्यम को पूरक करें।
  3. सभी मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह से ज्यादा नहीं रखें।

2. सर्जरी का दिन: ऊतक अधिग्रहण

  1. ऊतक अधिग्रहण के दिन, टिशू प्रोसेसिंग मीडिया में 50% से 100 एमएल 1% और 2% (वाइट / वॉल्यूम%) समाधान तैयार करें, टिशू प्रोसेसिंग मीडिया में ऑटोक्लावेड कांच के बने पदार्थ और लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ तकनीक का इस्तेमाल करते हैं। ट्यूमर टिशू स्थिरता में अप्रत्याशित भिन्नता को समायोजित करने के लिए एगरोस के दोनों सांद्रता की आवश्यकता होती है।
  2. एक माइक्रोवेव का उपयोग करते हुए agarose निलंबन गर्मी, जब तक कोमल उबलते मनाया जाता है। का उपयोग करने तक एक तरल राज्य में बनाए रखने के लिए 37 ° C जल स्नान में agarose समाधान रखें।
  3. एक 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में टुकड़ा संस्कृति रखरखाव मीडिया के 1 एमएल रखें।
  4. एक बाँझ का प्रयोग करेंहर अच्छी तरह से खाली पीटीएफ संस्कृति सम्मिलित करने के लिए संदंश 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा 5% सीओ 2 वायुमंडल के साथ एक आर्मीडिफाइड, वॉटर-जैकेट, टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
  5. एक लामिना का प्रवाह हुड में एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, ट्यूमर टिशू अधिग्रहण से पहले, लगभग 15 से 30 मिनट में बर्फ के ठंडे ऊतक प्रसंस्करण मीडिया युक्त फ्लास्क में 95% हे 2 /5% सीओ 2 गैस का मिश्रण बुलबुला। सुपरा-ऑक्सीजन युक्त मीडिया के उपयोग से प्रसंस्करण के दौरान थोक ऊतक में हाइपोक्सिया को कम करता है।
  6. ऑपरेटिंग कमरे और टुकड़ा करने की सुविधा सुविधा के बीच ऊतक परिवहन के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों लेबल (अलग-अलग ट्यूमर क्षेत्रों को वांछित करने के लिए पर्याप्त रूप से पृथक होना) के लिए सूप-ऑक्सीजन युक्त बर्फ-ठंडा प्रसंस्करण मीडिया के 20 मिलीलीटर एल्योकुट तैयार करें।
  7. न्यूरोसर्जन के साथ, नमूना अधिग्रहण के लिए ट्यूमर क्षेत्र की पूर्व-योजनाबद्ध योजना है। एक ट्यूमर क्षेत्र का चयन करें, इसके विपरीत वृद्धि के साथ, जैसा कि रोगी की नैदानिक ​​कल्पना पर दर्शाया गया हैजी (टी 1 पोस्ट-गैडोलीनियम चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) अनुक्रम)। पिछला अनुभव से पता चलता है कि इस क्षेत्र की पैदावार परिवादात्मक ट्यूमर के ऊतक के रूप में होती है, जो कि नेक्रोटोटिक ऊतक के विपरीत होती है।
    नोट: आसपास के (पेरिटायमोरल) सफेद पदार्थ से स्लाइस की पीढ़ी का प्रयास किया गया; हालांकि, पृष्ठभूमि autofluorescence और कमी हुई ट्यूमर सेल घनत्व इन स्लाइसों की प्रायोगिक उपयोगिता सीमित है।
  8. ट्यूमर रिक्शा की शुरुआत की ओर ट्यूमर ऊतक प्राप्त करें ट्यूमर के ऊतक के संग्रह से बचें जो व्यापक द्विध्रुवी दालों से उजागर होते हैं, जो थर्मल की चोट के लिए ऊतक की व्यवहार्यता को बाधित कर सकते हैं। टुकड़े टुकड़े के ट्यूमर के शोधन के दौरान हासिल किए गए ऊतक के नमूने लम्बी एन ब्लॉक शोध से प्राप्त ऊतकों की तुलना में बढ़ाया व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं। यह अवलोकन शल्यचिकित्सा के कारण लदान और विस्तारित समय के अधिग्रहण के कारण रक्त प्रवाह के ट्यूमर के ऊतक के अभाव से संबंधित हो सकता है।
  9. नमूनों को पृथक करने के लिए पृथक शंक्वाकार ट्यूबों में वांछित, लेबल और संग्रहीत ट्यूमर के ऊतकविशिष्ट ट्यूमर क्षेत्रों से ( यानी सतही बनाम गहरी ट्यूमर टिशू)। सटीक ऊतक स्थानों को दर्ज किया जा सकता है यदि / जब इंट्राऑपरेटिव सर्जिकल नेविगेशन उपलब्ध हो।

3. स्लाइस संस्कृति तैयार करना

नोट: इस प्रोटोकॉल को ताजा अफाक्स मानव ऊतक के उपयोग की आवश्यकता है। सभी नमूनों को संक्रामक माना जाता है, और सार्वभौमिक रक्तजनित रोगजन प्रोटोकॉल के अनुसार संभाला जाना चाहिए। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण हर समय दादा होना चाहिए। संदंश और स्केलपेल का प्रयोग करने से पहले 15 मिनट की यूवी प्रकाश के संपर्क में होना चाहिए। उपयोग के दौरान, 70% इथेनॉल (एटोओएच) के साथ औजार स्पंदित रूप से स्प्रे करें, इससे पहले तरल को उपयोग करने से पहले लुप्त हो जाना चाहिए। फिसलने वाली हवा के साथ एक क्षैतिज लामिना का प्रवाह हुड के उपयोग के लिए एक अर्द्ध-बाँझ फैशन में टुकड़ा करने की प्रक्रिया प्रक्रिया की जाती है।

  1. बर्फ-ठंड प्रसंस्करण मीडिया के साथ एक पेट्री डिश में ट्यूमर के ऊतक के टुकड़े रखें। ट्यूमर के ऊतकों को धोने और लाल रक्त कोशिकाओं को कम करने के लिए, हमपेटी डिश में तीन बार मीडिया को धीरे-धीरे एक्सचेंज और मीडिया को त्यागने के लिए एआई विंदुक
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करना, आयताकार बॉक्स आकृतियों में ट्यूमर के टुकड़े को काट लें। लगभग 3 मिमी x 3 मिमी x 10 मिमी के लिए ट्रिम ऊतक के टुकड़े ठीक संदंश के साथ छांटना या सौम्य कर्षण के माध्यम से किसी भी संलग्न जहाजों को ध्यान से हटा दें।
  3. पिपेट 5 - 37 डिग्री सेल्सियस के औसत से 7 एमएल का घन-आकार (~ 2 सेमी 3 ) प्लास्टिक एम्बेडिंग ढालना में। एंजरास समाधान के तापमान की पुष्टि करें उपयोग करने से पहले एक बाँझ थर्मामीटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है।
  4. Agarose बर्फ के एक बिस्तर पर लगभग 1 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें
  5. प्लेस 2 - 4 ट्यूमर ऊतक "स्ट्रीप्स" में लंबे समय तक धुरी के साथ उन्मुख उन्मुख अग्रवर्ती के साथ।
    नोट: दृढ़ता से पहले टिशू स्ट्रिप्स agarose में "सिंक" करने के लिए करते हैं। इस जटिलता से बचने के लिए, अस्थायी रूप से ऊतक पट्टी को ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में पकड़कर रखें, जब तक Agarose आगे मजबूत हो जाता है।
  6. 2 - 5 मील के लिए बर्फ के एक बिस्तर पर agarose मोल्ड युक्त टिशू रखेंठोसता की सुविधा के लिए n
  7. बर्फ से ढालना निकालें और धीरे-धीरे एक स्केलपेल के साथ फार्म के किनारे काटकर agarose ब्लॉक को हटा दें। ब्लॉक पर अत्यधिक बल रखने से बचें, जो agarose फ्रैक्चर हो सकता है
  8. स्पैमटॉम नमूना प्लेट में agarose ब्लॉक को चिपकाने के लिए cyanoacrylate गोंद के उदार ड्रॉप का उपयोग करें। लगभग 1 से 2 मिनट के लिए गोंद सेट करें।
  9. नमूना प्लेट में चिपकने वाले agarose ब्लॉक को डूबने के लिए बर्फ-कोल्ड प्रसंस्करण मीडिया के साथ vibratome जलाशय भरें।
  10. टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान, टमाइज़्ड बाँझ प्लास्टिक विंदुक के माध्यम से बब्बल 95% ओ 2 /5% सीओ 2 गैस मिश्रण को कंपैटोम जलाशय में मिलाया जाता है।
  11. 300 - 350 माइक्रोन के लिए कंपन थैली की मोटाई सेट करें।
  12. ऊतक स्थिरता के अनुसार ब्लेड की अग्रिम गति और ब्लेड आयाम समायोजित करें। "सफ़ाई" जीबीएम ऊतक को धीमी ब्लेड की अग्रिम गति और उच्च आयाम की आवश्यकता है सटीक ब्लेड की गति और आयाम सेटिंग्स vibratome विनिर्देशों के अनुसार अलग अलग होंगे।
  13. एक स्टेनलेस स्टील माइक्रोस्पोटुला का उपयोग करके बर्फ-ठंड प्रसंस्करण मीडिया के साथ पेट्री डिश में टिशू स्लाइस को स्थानांतरित करें।
  14. इनक्यूबेटर से पीटीएफई सम्मिलन युक्त 6-अच्छी तरह प्लेट्स प्राप्त करें और इन्हूबेटर से संतुलित स्लाइस कल्चर मीडिया प्राप्त करें (जैसा अनुभाग 2, चरण 4 में तैयार किया गया है)
  15. एक स्टेनलेस स्टील माइक्रोस्पोटुला का उपयोग करके प्लेट ऊतक स्लाइसें धीरे-धीरे स्पैटुला ए को बंद करने के लिए एक "द्रव तरंग" उत्पन्न करने के लिए एक छोटे से ठीक बाल खड़े पेंटब्रश का उपयोग करके ऊतक के सीधे संपर्क और हेरफेर को कम करेंसंस्कृति डालने पर एन डी
    नोट: टिशू कल्चर डाइरेक्ट के शीर्ष पर प्रसंस्करण मीडिया की मात्रा को कम करें। यदि अत्यधिक मात्रा में मीडिया को स्थानांतरित करने के लिए स्लाइस को फ्लोट करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है, तो मीडिया को हटाने के लिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
  16. एक 5% सीओ 2 वायुमंडल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए इनक्यूबेटर के लिए ट्यूमर स्लाइस युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटें लौटें।
    नोट: ऑपरेटिंग कमरे से 90 मिनट के ट्यूमर के ऊतक अधिग्रहण के भीतर पूरे एम्बेडिंग और स्लीसिंग प्रोटोकॉल पूरा किया जाना चाहिए।

4. स्लाइस संस्कृति रखरखाव

  1. 12 से 24 घंटे के बाद, एक बाँझ संदंश के साथ प्रत्येक सम्मिलित रिम को पकड़कर स्लाइस संस्कृतियों को स्थानांतरित करें और ताजे टुकड़ा संस्कृति रखरखाव मीडिया युक्त प्लेटों में स्थानांतरित करें। आवेषण को हस्तांतरित करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में प्रत्येक अच्छी तरह से समतुल्यित किया जाने वाला टुकड़ा संस्कृति रखरखाव मीडिया सुनिश्चित करें।
  2. ताजा समसामयिक टुकड़ा कल्ले के साथ नए 6-अच्छी प्लेटों में आवेषण ले जाएंमीडिया को हर 48 घंटे में दबाएं
  3. भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर बायोकेमिकल एसेज ( यानी एलिसा) में फ्रीस्टाइल के लिए वांछित पुराने स्लाईस कल्चर मीडिया को विंदुक के साथ वांछित,

5. ट्यूमर सेल लेबलिंग के माध्यम से ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन अभिव्यक्ति रेट्रोवायरस

नोट: ट्यूमर सेल प्रवासन के विश्लेषण के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइस संस्कृति के भीतर कोशिकाओं के दीर्घकालिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता है, रेट्रोवायरस का प्रयोग सुझाया जाता है क्योंकि यह विभाजन से विभाजित कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से संक्रमित करता है, जिससे ट्यूमर सेल आबादी के भीतर फ्लोरोसेंट लेबलिंग को समृद्ध किया जा सकता है, जैसा कि स्लाइस के भीतर मौजूद माइक्रोग्लिया या अन्य सेल प्रकार के विपरीत होता है। संक्रमण के मानकीकरण से पता चलता है कि सेल माइग्रेशन के ट्रैकिंग और विश्लेषण के लिए पर्याप्त 4 फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति में 10 4 सीएफयू / μ एल के वायरल टिटर का परिणाम है। वायरल टिटर बढ़ाया, गैर-चयनात्मक वायरस का उपयोग ( यानी एडिनोवायरस, लैन्टीवायरस), या ओ.टी.सभी कोशिकाओं को लेबल करने का उसका मतलब माइग्रेशन के दौरान स्पष्ट सेल सीमाओं की पहचान को रोक सकता है, इस प्रकार जटिल विश्लेषण। आवश्यकतानुसार वैकल्पिक फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग और अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. मानक प्रोटोकॉल 5 , 14 के माध्यम से या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोत से ट्यूमर स्लाइस के संक्रमण के लिए रेट्रोवायर प्राप्त करें 10 4 सीएफयू / μ एल के वायरल टिटर को प्राप्त करने के लिए अपरिवर्तनीय न्यूरॉनल माध्यम में उचित मात्रा को जोड़कर वायरल सतह पर तैरनेवाला को पतला करें।
  2. 7-10 दिनों की संस्कृति के बीच 5-10 μL वायरस (10 4 सीएफयू / μL) के साथ ब्याज की ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों को संक्रमित किया जाता है। वायरस को प्रत्येक ऊतक टुकड़ा की सतह पर धीरे-धीरे छोड़ दें। सम्मिलित होने पर सतह पर तैरनेवाला वॉल्यूम घटाएं, यदि टुकड़ा डालने की सतह पर तैरता है। इनक्यूबेटर को स्लाइस संस्कृतियों युक्त प्लेटें लौटें
  3. 24 घंटों के बाद लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के लिए स्लाइस का आकलन करें वायरल संक्रमण (अनुभाग 6 देखें)। इस समय विलंब वायरल निगमन और प्रतिदीप्ति जीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स पर निर्भर अलग-अलग होगा। यहां इस्तेमाल होने वाले वायरल निर्माणों के लिए, 72 एच को एक मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल का निरीक्षण करना आवश्यक था।
    नोट: दुर्भाग्य से, स्लाइसें वायरल लेबल वाली कोशिकाओं का मुख्य रूप से परिधीय वितरण प्रदर्शित करती हैं, जो कि कन्फोकल इमेजिंग को जटिल कर सकती हैं। इस जटिलता से बचने के लिए, स्लाइस में स्लाइस मोटाई और मोटाई भिन्नता को कम करने का प्रयास करें। यदि टुकड़ा संस्कृति केंद्र के पास एक मोटा क्षेत्र है, तो यह पर्याप्त पोषक तत्वों में प्रवेश को रोक सकता है, इस प्रकार ट्यूमर कोशिकाओं को सक्रिय रूप से विभाजित करने की आबादी को सीमित करता है। इस जटिलता के लिए स्क्रीन के लिए एक गुणात्मक परख एक टुकड़े संस्कृति मीडिया के लिए एक टेट्राज़ोलियम डाई अभिकर्मक ( यानी एमटीटी) के अलावा है। स्लाइस के क्षेत्र जो अभिकर्मक को जोड़ने के बाद नीले रंग की नहीं करते हैं, वे चयापचय गतिविधि की कमी और तुच्छ स्वास्थ्य से समझौता करते हैं।
6. "टाइम-लेप्स सिंगल फोटॉन लेजर स्कैनिंग ट्यूमर सेल माइग्रेशन के कन्फोकल इमेजिंग

नोट: सफल पारगमन और संस्कृति के स्वास्थ्य की पुष्टि होने के बाद, कोशिकाओं को नियंत्रण की स्थिति के तहत इमेजिंग के बराबर अवधि के बाद इमेजिंग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग, प्रत्येक स्थिति में कोशिकाओं को सफलतापूर्वक इमेज और 12 घंटे के लिए ट्रैक किया गया था। हालांकि, इमेजिंग और पर्यावरणीय हेरफेर के कम या लंबी अवधि जानकारीपूर्ण भी हो सकते हैं।

  1. माइक्रोस्कोप लोड हो रहा है
    1. इमेजिंग से पहले, ताजे टुकड़ा मीडिया के 1 एमएल कांच के नीचे डिश में रखें।
    2. 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में संतुलित करने के लिए गिलास नीचे की डिश में मीडिया को अनुमति दें
      नोट: इस बिंदु पर घुलनशील लेबलिंग एजेंट, जैसे कि फ्लोरोसेंटली संयुग्मित लेक्टिन ( यानी आईओसॉलिन आईबी 4 माइक्रोग्लिया लेबलिंग के लिए) या लिगंड संयुग्मित क्वांटम डॉट्स, सेल की पहचान के लिए टुकड़ा संस्कृति मीडिया में जोड़ा जा सकता हैइमेजिंग के दौरान ular उपपोषण
    3. एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ संदंश का उपयोग कर गिलास नीचे के डिब्बे में डालने के लिए डालें। डिश को सूक्ष्मदर्शी चरण में परिवहन करें।
    4. स्लाइस संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 वायुमंडल को मोहरबंद माइक्रोस्कोप चरण-टॉप इनक्यूबेटर में बनाए रखें। अत्यधिक मीडिया वाष्पीकरण (लंबे इमेजिंग प्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण) को रोकने के लिए उपलब्ध ऊष्मायन कक्ष के बाँझ एच 2 ओ आर्द्रीकरण का उपयोग करें।
    5. सिंगल-फ़ोटोन और / या मल्टी-फोटान के लिए एक लंबे समय तक काम करने वाले दूरी 10 एक्स एयर उद्देश्य और लेजर उत्तेजना के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस पर्याप्त कार्य दूरी प्रदान करता है। चरण-टॉप इनक्यूबेटर, कांच के नीचे डिश और टिशू कल्चर डालने से जोड़ा ऊँचाई के परिणामस्वरूप, लंबी दूरी की दूरी के उद्देश्य महत्वपूर्ण हैं।
    6. गिलास नीचे की प्लेट को सुरक्षित करें, प्लास्टिक पेट्री डिश कवर को हटा दें, और एक गैस-पारगम्य झिल्ली
  2. चित्र अधिग्रहण
    1. स्लाइस का निरीक्षण करने के लिए सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें और स्लाइस किनारे और केंद्र के बीच फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के पर्याप्त घनत्व के साथ एक उपयुक्त क्षेत्र का पता लगाएं। इमेजिंग के दौरान टिशू शिफ्ट की बढ़ती संवेदनशीलता के कारण टुकड़ा के किनारे पर इमेजिंग फ़ील्ड से बचें। इस शिफ्ट को सीमित करने के लिए टिशू स्लाइस हापियां लगाई जा सकती हैं
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग बहुआयामी विश्लेषण मोड में पहला (नीचे) और आखिरी (शीर्ष) जेड-स्टैक सीमाएं निर्धारित करने के लिए करें, जैसे कि सभी पदों को चित्रित फ्लोरोसेंट सेलुलर संकेत दिखाई दे। स्लाइस के 150 - 200 माइक्रोन के माध्यम से इमेजिंग, 10 माइक्रोन के लगातार जेड-स्टेप के साथ सेल पथ को ट्रैक करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्रदान किया गया (यह व्यक्तिगत इमेजिंग जरूरतों के लिए समायोजित किया जा सकता है)।
    3. यदि सूक्ष्मदर्शी के पास मोटर चालित मंच है, तो सुनिश्चित करें कि प्रत्येक जेड स्टैक अधिग्रहण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी जाए। अधिग्रहण के बराबर समय अंतराल निर्धारित करेंछवि प्रति स्थान प्रति स्थान स्कैन करने के लिए छवियों की संख्या x संख्या ( यानी इमेजेड ट्यूमर क्षेत्रों)।
      नोट: हरे और लाल फ्लोराफोर्स के साथ-साथ उत्तेजना के लिए, दोहरी-लाइन लेजर लाइन-स्कैनिंग प्रोग्राम का उपयोग करते हैं, साथ में एक साथ 488 एनएम और 633 एनएम उत्तेजना। व्यक्त की गई लेजर उत्तेजना की तरंग दैर्ध्य अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीनों के अनुसार अलग-अलग होगी।
    4. इमेजेड ट्यूमर क्षेत्रों के बीच वर्दी लेजर पावर और कन्फोकल पिनहोल सेटिंग्स को बनाए रखें। ट्यूमर कोशिका निकाय स्पष्ट रूप से फोटोटॉक्सिसिटी को सीमित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम लेजर पावर सेटिंग का उपयोग करें। विशिष्ट इमेजिंग पैरामीटर इकाइयां ( अर्थात् शक्ति और confocal pinhole सेटिंग्स) माइक्रोस्कोप और लेजर स्रोत विनिर्देशों के अनुसार अलग-अलग होंगे।
    5. उद्देश्य के लिए आगे बढ़ने वाले फोकल विमानों में 2-3 "बफर" Z- स्टैक चरण जोड़कर संभावित मीडिया वाष्पीकरण के लिए मुआवजा। यह प्रभावी रूप से ऊतक को Z- स्टैक अधिग्रहण की सीमा को छोड़ने से रोकता हैऊर्ध्वाधर विमान में आयन

7. छवि पोस्ट प्रोसेसिंग और ट्यूमर सेल ट्रैकिंग

नोट: कई confocal इमेजिंग सिस्टम मालिकाना छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर से लैस हैं। नीचे दिए गए प्रोसेसिंग चरणों में एक सामान्य प्रोटोकॉल शामिल है, जिसे सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म पर पूरा किया जा सकता है। ओपन सोर्स प्लैटफॉर्म, एनआईएच इमेजजे और एमटीआरकेजे 15 के लिए विशेष निर्देश दिए जाएंगे।

  1. Z- स्टैक फ़ाइल खोलें। ImageJ में, "छवि → ढेर + Z परियोजना" पर क्लिक करें। प्रक्षेपण प्रकार के रूप में शामिल करने के लिए पहले और अंतिम Z- स्टैक को चुना और "अधिकतम तीव्रता" को चुना। परिणाम एक प्रतिपादन है जिसे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) कहा जाता है। प्रत्येक क्षेत्र पर कब्जा किए गए जेड-स्टैक छवियों के प्रत्येक सेट से एक एमआईपी बनाएं I
  2. एक समय श्रृंखला बनाने के लिए प्रत्येक क्षेत्र से एमआईपी को जोड़ना। "छवि → ढेर + स्टैक छवियाँ" पर क्लिक करें।
  3. मैन्युअल रूप से स्थान की पहचान करेंट्यूमर सेल बॉडी के नेत्रहीन अनुमानित केंद्र बिंदु का चयन करके सेल बॉडी "centroid" का यह मेट्रिक जेड (एनआईएच आईजेजे के लिए एक ओपन सोर्स प्लगइन-इन) की "ऐड" ट्रैक कार्यक्षमता का उपयोग करके सेल बॉडी पर क्लिक करके पूरा किया गया है।
  4. छवियों की श्रृंखला के प्रत्येक फ्रेम में सेल बॉडी स्थान का निर्धारण करने के लिए क्लिक करें यह प्रत्येक सेल के लिए एक अद्वितीय "ट्रैक" बनाता है क्रमशः, अगले सेल के सेल बॉडी स्थानों को चिह्नित करें जब तक कि सभी सेल माइग्रेशन पथ ट्रैक नहीं होते हैं, तब तक इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  5. एक बार ट्यूमर माइक्रो क्षेत्र में कोशिकाओं की आबादी का पता लगाया जाए, तो MTrackJ के "उपाय" फ़ंक्शन का उपयोग करके सभी सेल ट्रैक निर्देशांक निर्यात करें। फाइल को एक .xls प्रारूप के रूप में सहेजें ताकि स्प्रेडशीट या उपयोगकर्ता द्वारा निर्मित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे डेटा का विश्लेषण किया जा सके।
  6. माइग्रेशन स्पीड, दिशानिर्देश और अन्य माइग्रेशन के व्युत्पन्न सहित मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए सेल के प्रवासन ट्रैक के साथ प्रत्येक बिंदु के लिए दर्ज किए गए निर्देशांक का उपयोग करेंमैट्रिक्स, जैसा कि पार्कर एट अल 16 में वर्णित है।
    नोट: सभी गणना की गई दूरी और गति वास्तविक मानों का अनुमान है। यह अधिकतम तीव्रता के अनुमानों के निर्माण के माध्यम से त्रि-आयामी डेटा के लिए त्रि-आयामी छवियों (और माइग्रेशन पथ) के परिवर्तन में निहित है।

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Representative Results

हमारे समूह ने शुरुआती जीबीएम रसीकरण से गुजरने वाले 50 से अधिक मरीजों से स्लाइस संस्कृतियों को सफलतापूर्वक तैयार किया है। यह टुकड़ा पीढ़ी, संस्कृति, रेट्रोवायरल-लेबलिंग, इमेजिंग और माइग्रेशन विश्लेषण प्रोटोकॉल को एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार्यप्रवाह ( चित्रा 1 ) में सुव्यवस्थित किया गया है। क्रिटिक रूप से, इन अंगोथीपिक जीबीएम स्लाइस संस्कृति के 15 दिनों तक पैथोलोगिक हॉलमार्क और माइक्रोग्लिया के रखरखाव समेत पूरे संस्कृति में ट्यूमर टिशू के साथ तालमेल दिखाना है ( चित्रा 2 )। इसके अतिरिक्त, हमने माइक्रोवेनिनल परिवर्तनों के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के कार्यात्मक assays करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है। भौतिक अखंडता के एक मीट्रिक के रूप में, हमने जांच की कि जीबीएम टुकड़ा संस्कृतियों ने वास्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ़) के उत्पादन को मापकर हाइपोक्सिया (1% हे 2 ) को जवाब दिया, यह प्रक्रिया जो कि vivo 17 में जीबीएम माइक्रोएनेर पर्यावरण के भीतर उभरती हुई ,"18। हमने दिखाया है कि हिपोसिक स्थितियों में स्लाइस संस्कृतियों को रखकर, स्लाइसें एक तेजी से फिजियोलॉजिक प्रतिक्रिया प्रस्तुत करती हैं, मीडिया में वीएजीएफ़ रिलीज को प्रेरित करती है ( चित्रा 3 )।

ट्यूमर सेल प्रवासन के गुणात्मक और मात्रात्मक पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए हमने विस्तृत माइग्रेशन मानचित्र बनाने के लिए समय चूक छवियों का उपयोग किया। ये मानचित्र ट्यूमर माइक्रोरेगियां (1 मिमी 2 ) की सीमांत में ट्रैक किए गए सभी जीबीएम कोशिकाओं का निर्धारण करते हैं, ट्यूमर आबादी के गतिशील प्रवासी व्यवहार के एक स्थिर दृश्य प्रदान करते हैं। प्रत्येक सेल के लिए माइग्रेशन स्पीड और डायरेक्टीमेंट (कोशिका विस्थापन / कुल दूरी की कूच की गई) की मात्रात्मक उपायों की गणना की गई, ट्यूमर क्षेत्रों में ट्यूमर के नमूने में प्रवास के मापदंडों में परिवर्तन की जांच, और उपचार के जवाब में ( चित्रा 4 )।

सेल लेबलिंग और इमेजिंग प्रोटोकॉल डेसयहां पर cribed देशी ट्यूमर microenvironment के माध्यम से प्रवास के दौरान सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त स्थानिक और अस्थायी संकल्प प्रदान करता है। हमने आकृति विज्ञान के अलग गतिशील ट्यूमर कोशिकाओं और स्लाइस संस्कृति ( चित्रा 5 ए ) के भीतर intermingled microglial की उपस्थिति मनाया। ट्यूमर कोशिका आंदोलन "खोज और फट" प्रक्रिया की विशेषता थी, जिसमें एक स्थैतिक कोशिका से फेरोपोडाय का दोबारा फलाव और वापस लेने का कार्य शामिल था, जिसके बाद कुशल गति की थोड़ी सी अवधि थी। इमेजिंग टुकड़ा क्षेत्र लगभग हर 10 मिनट में सेल डिवीजन के दौर से गुजर ट्यूमर कोशिकाओं की समय-विलंब छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त अस्थायी संकल्प प्रदान करता है। इन विभाजित कोशिकाओं को प्रवासन से रोक दिया गया, पूरा मित्सुई, और बेटी की कोशिकाओं ने बिना किसी देरी के प्रवास को दोबारा शुरू किया, सभी 3-एच समय-सीमा के भीतर ( चित्रा 5 डी )। इसके विपरीत, माइक्रोग्लिया एक उच्च और अधिक सुसंगत गति पर पलायन करते हैं, जो आसन्न ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में निचले दिशा-निर्देश होते हैं,उनके अपेक्षाकृत अक्षम प्रवास का प्रदर्शन ( चित्रा 5 सी, 5 ई-जी )। उपचार के लिए रोगी- या सेल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के जीवविज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस तरह की टिप्पणियां महत्वपूर्ण हो सकती हैं।

अंत में, हम ट्यूमर कोशिकाओं 16 वर्ष की संवर्धित प्रवासी क्षमता के साथ एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) जीनोमिक प्रवर्धन की एक संबंध सहित आबादी के स्तर पर सेल प्रवास मापदंडों में प्रदर्शन रोगी करने वाली रोगी परिवर्तनशीलता के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया,। इसके अलावा, एंटी-इनवेसिव ड्रग के साथ उपचार करने से पहले और बाद में ट्यूमर स्लाइस के समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी, प्रवासन में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया, जो ईजीएफआर प्रवर्धित ट्यूमर स्लाइस 16 के लिए विशिष्ट था।

आकृति 1
आकृति 1: मानव जीबीएम ऑरोगोटेपिक स्लाइस संस्कृति संक्रमण, इमेजिंग, और सेल माइग्रेशन विश्लेषण वर्कफ़्लो ट्यूमर टिशू इंट्राऑपरेटिव नेविगेशन उपकरण के माध्यम से एक विशिष्ट क्षेत्र में स्थानीयकृत है। एक हफ्ते के बाद टुकड़ा करने की क्रिया, जेस्ज़ग्रीन व्यक्त रेट्रोवायरस टुकड़ा संस्कृतियों में जोड़ा जाता है ताकि म्यूटोटिक रूप से सक्रिय ट्यूमर कोशिकाओं को लेबल किया जा सके। 3 दिनों के संक्रमण के बाद, कपट संलयन इमेजिंग के लिए स्लाइस तैयार किए गए हैं। 3 डी इमेजिंग डेटा को सेल माइग्रेशन पथ ट्रैकिंग, ट्यूमर सेल माइग्रेशन मानचित्रों की स्थापना, और ट्यूमर सेल माइग्रेशन पैरामीटर की गणना के लिए 2 डी छवियों में प्रोसेस किया जाता है। इस आंकड़े के अंश मूल रूप से पार्कर एट अल , 2013 16 में प्रकाशित किए गए थे और ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति के साथ दोबारा प्रकाशित किए गए थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 2. मानव GBM Organotypic स्लाइस पूर्व विवो संस्कृति के दौरान हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखने ( ) टी 1 के विपरीत बढ़ाए एमआरआई दृश्यों को स्थानीयकरण और ऊतक अधिग्रहण (तीर) के क्षेत्र (ओं) को दस्तावेज बनाने के लिए उपयोग किया गया था। ( बी ) प्रारंभिक दाता ऊतक के एच एंड ई धुंधला हो जाना (ओआर) और संस्कृति के दिन 8 पर स्लाइसें, ए। सी में प्रकाशित क्षेत्र से प्राप्त टिशू से पैदा हुई संस्कृति से 8 प्रतिशत, जीवीएम की माइक्रोएनेरेनैनलैनल पैथोलॉजिक और सेलुलर फीचर, विवो में , बनाए रखा जाता है टुकड़ा संस्कृति भर में (आई, द्वितीय) सीडी 68 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री, एक माइक्रोग्लिया / मैक्रोफेज मार्कर, कम (शीर्ष) और उच्च (नीचे) बढ़ाई पर, 15 दिनों की संस्कृति के बाद स्लाइस में माइक्रोग्लिअल दृढ़ता दर्शाता है। स्लाइस कल्चर के दिन 4 पर एच एंड ई स्टैनिंग ने प्यूडोपलिसिंग नेकोर्सिस के रखरखाव की पुष्टि की, एक पाथजीबीएम के लॉजिक हॉलमार्क, दोनों निम्न (iii) और उच्च (iv) बढ़ाई पर। स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: मानव जीबीएम स्लाइस संस्कृतियों हाइपॉक्सिया के उत्तर में वीएजीएफ छिपाना। ( ) इस प्रयोग ने एक ही ट्यूमर क्षेत्र से उत्पन्न 3 समान आकार के ट्यूमर स्लाइस युक्त व्यक्तिगत संस्कृति आवेषण का उपयोग किया। 12 घंटे के लिए सामान्य नक्सल में स्लाइस बनाए गए, उसके बाद दो हफ्ते के अंतराल 12 एच। अंतराल के बाद नए मीडिया जोड़े गए। ( बी ) दो प्रतिनिधि ट्यूमर से उत्पन्न टुकड़ा संस्कृतियों से एलिसा (माध्य मानक विचलन) द्वारा मापा गया मीडिया में वीएजीएफ स्राव, काफी बढ़ गया थाडेर हाइपोक्सिया नॉर्मोक्सिया से (पी <0.05)। ( सी ) 4 अलग-अलग ट्यूमर के टुकड़ा संस्कृतियों का एक एकत्रित विश्लेषण नेनोक्सिया (पी <0.05) की तुलना में हाइपोक्सिया के अनुक्रमिक 12 एच अंतराल के बाद VEGF स्राव को बढ़ाया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: ट्यूमर सेल पथ ट्रैक डेटा सेल गति और दिशा-निर्देश की मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति देता है। ( ) 1 की दिशात्मकता के साथ ट्यूमर कोशिकाओं को एक सदिश वैक्टर के साथ सही दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि निचले दिशात्मकता वाले लोगों को इस योजनाबद्ध 16 में प्रतिनिधित्व के रूप में अक्षम अक्षम पथों में शामिल किया गया है। ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशितदबाएँ। ( बी ) प्रतिनिधि पथ ट्रैक डेटा का विश्लेषण ("कम" रिज़ॉल्यूशन ~ 55 मिन सेल ट्रैकिंग अंतराल) गति और दिशा में सेलुलर परिवर्तनशीलता को दर्शाता है। ( सी ) प्रत्येक सेल ट्रैक के लिए माइग्रेशन स्पीड की दिशा-निर्देश बनाम सेल आबादी में प्रवास व्यवहार को देखने के लिए प्लॉट किया गया है (प्रत्येक डॉट एक अलग सेल को दर्शाता है)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: जीबीएम स्लाइस संस्कृतियों के भीतर माइक्रोग्लिया उच्च प्रवासन स्पीड और ट्यूमर सेल से कम दिशा-निर्देश से संबंधित हैं। ( ) ट्यूमर कोशिकाओं को प्रतिलिपि बनाने के लिए Islectin-I के साथ टैग किए जाने वाले ZsGreen रेट्रोवायरस और माइक्रोलिया को चुनिंदा रूप से व्यक्त करना बी 4 -647 संयुग्मित एक प्रतिनिधि ट्यूमर सूक्ष्म क्षेत्र में एक प्रतिनिधि टुकड़ा संस्कृति से मिट जाता है। ( बीसी ) एक ही ट्यूमर सूक्ष्म क्षेत्र में व्यक्तिगत रूप से ट्रैक किए गए जीबीएम ( बी ) और माइक्रोग्लिया ( सी ) के पथ में असमर्थ प्रवासन व्यवहार दर्शाते हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन ( डी ) एक सक्रिय रूप से पलायन करने वाले ट्यूमर सेल विराम देता है, अपनी प्रक्रियाओं को वापस लेता है (एरोहेड), कोशिका विभाजन का सामना करता है, और दो बेटी की कोशिकाओं को दिशाओं (तीर) का विरोध करने में दूर चला जाता है स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन ( और एफ ) माइक्रोग्लिया एक ही क्षेत्र में ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि हुई माइग्रेशन गति (पी <0.0001) और दिशात्मकता (पी <0.0001) को प्रदर्शित करता है। (जी) गति और दिशात्मकता के आधार पर ट्यूमर और माइक्रोलिअल कोशिकाओं का वितरण दो सेल आबादी के अद्वितीय प्रवासी फेनोटाइप को दर्शाता है।Et = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानव कैंसर के ऊतकों से ऑर्गोटेपिक स्लाइस संस्कृतियों पूर्व-नैदानिक ​​अनुवादिक प्रयोग के लिए एक आकर्षक और अंडूइलाइज्ड प्लेटफॉर्म प्रदान करती है। देशी ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट में माइग्रेशन, प्रसार और सेल की मृत्यु के संबंध में ट्यूमर कोशिकाओं की आबादी-स्तर के व्यवहार की समझ में कमी है। गंभीर रूप से, सेल व्यवहार के स्तर पर एक गतिशील, समय-निर्धारण फैशन में चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया का अध्ययन उपचार प्रतिरोध के उपन्यास तंत्र पर प्रकाश डाला जा सकता है। मानव ट्यूमर टुकड़ा संस्कृतियों मानव रोग की प्रक्रिया और वर्तमान पूर्व vivo के बीच और इन विवो मॉडलिंग तकनीकों 19 में एक लिंक प्रदान करते हैं। हमने हाल ही में तकनीक जीबीएम प्रवास का अध्ययन करने के लिए, EGFR प्रवर्धन और 16 संकेत से संबंधित सेल प्रवास व्यवहार में पहली बार औसत दर्जे का अंतर tumoral रूपांतरों के लिए रिपोर्टिंग एक विधि के रूप यहाँ वर्णित मान्य। इस अध्ययन के अनुसार, पैटी की परीक्षा के लिए टुकड़ा संस्कृति मॉडल का भी इस्तेमाल किया गयाजीजीएम 16 के लिए एक संभावित विरोधी-इनवेसिव थेरेपी के रूप में, ईजीएफआर अवरोध करनेवाला, जिफिटिनिब की एनटी-विशिष्ट प्रभावशीलता।

टिशू टुकड़ा करने की क्रिया, रेट्रोवायरल संक्रमण, इमेजिंग, और इमेज विश्लेषण प्रतिमान के दौरान कई आम नुकसान में ऊपर चर्चा की गई है। हालांकि, रेट्रोवायरल संक्रमण प्रोटोकॉल वॉरंट्स अधिक ध्यान देते हैं रोगी से रोगी की विविधता को देखते हुए, यह प्रत्येक टुकड़ा के भीतर वायरल लेबल वाले ट्यूमर कोशिकाओं के घनत्व को दान करने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। अगर कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या वायरल निर्माण द्वारा लेबल की जाती है, तो प्रत्येक टिप की सतह पर रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला के अतिरिक्त 5-10 μL अलक्षकों को जोड़कर लेबल ट्यूमर कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता प्राप्त होने तक रोजाना प्राप्त किया जाता है। प्राथमिक टुकड़ा संस्कृतियों में, प्रतिकृति कोशिकाओं का प्रतिशत आमतौर पर रूपांतरित सेल लाइनों की तुलना में कम होता है, इस प्रकार किसी भी समय रेट्रोवायरल निगमन के लिए अनुमोदित कोशिकाओं के सबसेट को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से, अगर बहुत से कोशिकाओं को लेबल किया जाता है, तो एसीसी को रोकनासेल प्रवासन मार्गों की पेशी सीमांकन, कम प्रभावी टिटर प्राप्त करने के लिए न्यूरॉनल मीडिया के साथ वायरल सतह पर तैरने वाले को पतला। ट्यूमर से जुड़ी माइक्रोग्लिया ने फ्लोरोसेंट प्रोटीन को शामिल किया था जिसमें सभी लेबल वाली कोशिकाओं के लगभग 1% की आवृत्ति पर रेट्रोवायरस को व्यक्त किया गया था। हम इमेजिंग डेटा विश्लेषण ( चित्रा 5 ) के लिए माइक्रोग्लिया बाइंडिंग लैक्टिन के इस्तेमाल से अलग-अलग विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं को अलग-अलग अलग कर सकते हैं।

पोषक प्रसव, कोशिका-कोशिका संबंधी क्रियाकलाप और बाह्य मैट्रिक्स के पहलुओं सहित ट्यूमर माइक्रोएनेवायरमेंट सभी जीबीएम 20 के रोगजनन में एक भूमिका निभाते हैं। प्रत्यक्ष मानव जीबीएम टुकड़ा संस्कृतियां, छोटे जानवरों के मॉडल या प्रसारित सेल संस्कृति के भीतर पैसगेट की आवश्यकता को समाप्त करते हैं, जबकि मानव ट्यूमर माइक्रोएन्नेरमेंट का करीब से मिला देना प्रदान करते हैं। इसके अलावा, स्लाइस संस्कृतियों को नमूनों में पोषक तत्वों तक समान पहुंच प्रदान करते हैं, जबकि सेल सेल और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन बनाए रखते हैं। Var को कम करकेट्यूमर के भीतर होने वाले ज्ञात पोषक तत्वों के लिए सेलुलर अभिगम में आइएशन, हम संस्कृतियों में देखा गया मतभेद जनसंख्या स्तर पर ट्यूमर सेल व्यवहार ( यानी प्रवासन) के बीच आंतरिक अंतर पर प्रकाश डालने का प्रस्ताव करते हैं हालांकि, मानव ट्यूमर से उत्पन्न स्लाइस संस्कृतियों में एकत्रित डेटा की व्याख्या अंतर्निहित अंतर और अंतर-टूमरल विविधता द्वारा जटिल है। महत्वपूर्ण ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों के पूर्व विवो रखरखाव के दौरान हो सकता है संभावित आनुवंशिक और एपिगेनेटिक बदलावों को चिह्नित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

चरण 1 / द्वितीय नैदानिक ​​परीक्षणों के साथ समानांतर में मानव ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग मरीज नैदानिक ​​परिणामों के साथ टुकड़ा मापदंडों को सहसंबंधित करने के लिए एक आशाजनक रणनीति है। स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग ऑंकोलॉजिकल थेरेपी को निजीकृत करने के लिए किया जा सकता है, इससे पहले इन संभावित भविष्यवाणियों / पूर्वकथात्मक पैरामीटरों की मान्यता आवश्यक है। हमारा काम, और साथ ही दूसरों के भी, बायोमाकर सत्यापन की व्यवहार्यता दर्शाता हैसुपर क्लास = "एक्सएफ़"> 21, साथ ही साथ जीबीएम 9 , 16 के स्लाइस संस्कृतियों में चिकित्सीय एजेंटों के तेज पूर्व विवो परीक्षण। फेफड़े 22 , कोलन 22 , सिर और गर्दन 23 , स्तन 24 और प्रोस्टेट कैंसर के 25 ऊतकों का प्रयोग करने वाले मानव शरीर की इस तरह की संस्कृति की तकनीक का सुझाव है कि यह दृष्टिकोण मानव कैंसर में सामान्यीकृत है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

हम अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए डॉ ली ली निस्वांडर और डा। रदा मस्वार्वा को धन्यवाद देना चाहते हैं, जो यहाँ वर्णित टुकड़ा संस्कृति की कन्फोकल इमेजिंग प्रोटोकॉल में योगदान है। मस्तिष्क ट्यूमर के ऊतक टुकड़ों के टुकड़ों और संस्कृति के मानकों को अनुकूलित करने के बारे में विशेषज्ञता प्रदान करने वाले डॉ। कलन डायनेन के अतिरिक्त धन्यवाद

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose  Invitrogen (Gibco) 11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red Invitrogen (Gibco) 12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15140-122
GlutaMAX Supplement Invitrogen (Gibco) 35050-061
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
HEPES (1 M) Invitrogen (Gibco) 15630-080
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638-20ML 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen (Gibco) 16520-050 Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher (Molecular Probes) I32450 Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector Clonetech 632520
Retro-X Concentrator  Clonetech 31455 Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) Sigma-Aldrich Z105899 Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) Polysciences, Inc. 18646A-1 Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas Fisher Scientific S50823 Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher Scientific  08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) Fisher Scientific 17-989-001 Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome Leica Biosystems VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert  EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes  MatTek P35G-1.5-20-C Sleeve 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope Zeiss LSM 510 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator PeCON Germany (Discontinued) Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.

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References

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