Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

Neuroscience

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Summary

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

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Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561, doi:10.3791/53561 (2016).

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Abstract

Introduction

La cóclea en forma de espiral del oído interno, contenida dentro del hueso temporal, alberga el órgano de Corti, el órgano final sensorial auditiva en mamíferos. La cóclea está tonotópicamente organizado y comúnmente dividido en apical, media y basal turnos correspondientes a diferentes regiones de frecuencia con detección de sonido de alta frecuencia en la base y detección de baja frecuencia en el vértice 1. Las células ciliadas, las células mechanosensory del órgano de Corti, corren a lo largo de la cóclea, que es de aproximadamente 6 mm de largo en ratones 2,3. Estas células convierten la energía mecánica de las ondas de sonido, que se transmiten a través del laberinto membranoso lleno de líquido, en señales neurales que son procesados ​​por las estructuras auditivas centrales. La técnica descrita aquí proporciona un método para preparar preparaciones completas de órgano de Corti después de la calcificación de la cóclea es completa (para las muestras que van desde una semana de edad hasta la edad adulta). También presentamos un método para immunostacaniza todo ello montado tejido coclear. Preparaciones completas cocleares son cruciales para la visualización de todas las células del cabello y que rodea las células de apoyo en sus disposiciones espaciales naturales y permiten el análisis en tres dimensiones con el uso de la microscopía confocal.

Drs. Hans Engstrom y Harlow Ades describen originalmente montar todo un método de disección coclear en 1966. Se detallan a una técnica para fijar rápidamente y diseccionar cochleae calcificado sumergido en líquido de una variedad de mamíferos, conservando intactas segmentos cortos del órgano de Corti para el análisis microscópico 4. La disección de un sin fijar, cóclea rata calcificada también se ha ilustrado en un video instructivo 5. Drs. Barbara Bohne y Gary Harding de la Universidad de Washington hicieron varias modificaciones importantes a este método. En su versión del método de montaje en toda coclear, el hueso temporal fue descalcificada, incrustado en plástico y cinco medias vueltas o diez cuartos de vueltas fueron disecciónted 6,7. Dr. Charles Liberman y sus colegas de Eaton Peabody laboratorios, Massachusetts ojo y Ear Infirmary, modificaron esta técnica por lo que no se requiere que la incrustación de plástico 8. Además modificación de la técnica se produjo en el laboratorio del Dr. Jian Zuo en el Hospital de Investigación Infantil St. Jude 9-12 que informó al método de disección que aquí se presenta. Utilizamos una estrategia diferente para acceder al órgano de Corti que Bohne y Liberman, que permite el aislamiento de apical completa, media y vueltas basales. Así, el tejido diseccionado es más grande y menos probabilidades de ser perdido o dañado durante el proceso de disección o de inmunotinción. Además, el método actual facilita la medición de la distancia desde la punta apical o basal gancho para identificar una región de frecuencia.

Aunque muchos laboratorios realizan inmunotinción del tejido coclear, no está claro dónde se originó este método. Como resultado de ello hay varias recetas para el bloqueo de buffers y tampones de incubación de anticuerpos que pueden afectar el desempeño de los anticuerpos primarios individuales. A continuación, presentamos un método para inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia que es aplicable a los anticuerpos más comúnmente utilizados en el campo auditivo.

La forma compleja de la cóclea, delicada estructura del órgano de Corti, y encajamiento ósea proporcionan un desafío para el análisis histológico y bioquímico. Una variedad de técnicas se utilizan actualmente en el campo de audición para superar estas características difíciles y visualizar las células dentro del órgano de Corti, cada técnica con sus propias ventajas y desventajas. El protocolo que aquí se presenta permite la disección para el conjunto de montaje de la cóclea del ratón adulto y, con una ligera modificación, potencialmente se puede utilizar para examinar las estructuras críticas dentro de las cócleas de una variedad de otros organismos modelo utilizados en el campo.

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Protocol

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Facultad de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois.

1. Extracción de Huesos temporales

  1. Identificar los temporales en la base del cráneo del ratón 13 y raspar los nervios craneales utilizando fórceps patrón estándar.
  2. Coloque fórceps patrón estándar en la punta de la cápsula ótica y con el pulgar de la mano opuesta presione hacia abajo en el canal semicircular posterior para desalojar la cóclea encapsulado.
  3. Liberar la mitad inferior del hueso temporal del cráneo de forma manual con el pulgar y el dedo índice o usando 10,5 cm tijeras finas.

2. Post-fix temporales Huesos

  1. Coloque huesos temporales en 2 ml tubos de microcentrífuga que contiene 250 - 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS) de pH 7,4 y incubcomió a temperatura ambiente durante 2-20 horas.
    NOTA: No se necesita una apertura de la tapa apical o inyección de PFA en la ronda o la ventana oval. Recomendar el uso libre, ultra-pura, microscopía electrónica (EM) de grado metanol PFA que se puede comprar en una concentración del 16% en viales de vidrio. Una vez que se abrió un vial y se diluyó 1: 4 en PBS, por lo que una solución al 4%, que puede ser utilizado para un máximo de 2 semanas cuando se almacena a 4 ° C (Algunos anticuerpos requieren la fijación a corto y otros pueden tolerar O / N (O / N) de fijación).

3. decalcify temporales Huesos

  1. Después de la fijación, retire PFA con una pipeta y reemplazar con 120 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un poco más de 2 ml. Asegúrese de llenar todo el tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar las burbujas de aire cuando el tubo está cerrado.
    1. Si no descalcificación inmediatamente, vuelva PFA con pH 7,4 y almacenar muestras de PBS 10 mM a 4 o C.
      NOTA: Después de la fijación, huesos temporales se pueden almacenar durante variable asciende de tiempo antes de descalcificación en función de los antígenos que se examina.
  2. Colocar los tubos en extremo-extremo sobre los rotadores y giran a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambie solución de EDTA al día usando una pipeta. Longitud de descalcificación depende de la edad de la muestra y la preferencia del científico que hace la disección.
    1. Incubar huesos temporales en EDTA usando las siguientes directrices para los tiempos de incubación:
      Para las muestras de día postnatal (P) 8 a P15: 2 - 4 horas; Para muestras P15 a P21: O / N; Para muestras P21 a P30: 2 O / N; Para muestras mayores de P30: 3 o más O / N.
      NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetas a la preferencia de los usuarios y se puede ampliar según sea necesario. Tiempo de descalcificación se puede reducir cambiando la solución de EDTA dos veces al día, alrededor de 8 horas de diferencia. Algunos laboratorios añadir 1% PFA a la solución de EDTA cuando descalcificación por más de 3 días para evitar la contaminación.
  3. Para determinar si la muestra se descalcificar adecuadamente, coloque huesos temporales ona de silicio impregnados de elastómero plato de disección y presione suavemente con fórceps en la cóclea en forma de caracol. Si el tejido es spongey, a continuación, la descalcificación es completa.
  4. Una vez descalcificación, retire EDTA con una pipeta y añadir 500 -1000 l de 10 mM PBS pH 7,4. Almacene las muestras a 4 ° C hasta el momento de diseccionar.

4. Crear recubierto de elastómero de silicona Dish Disección

  1. Combinar la base y agente de curado de un kit encapsulante elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar bien.
  2. Añadir aproximadamente 2-3 cucharadas de polvo de carbón hasta que la solución es de color negro y mezclar bien.
    NOTA: tinta líquida o carbón vegetal líquido no se mezclan con la solución y no se puede utilizar. Kits encapsulantes elastómero de silicona se pueden comprar en negro, lo que permite el paso 4.2 para ser omitido.
  3. Vierta la solución en 60 mm de vidrio o placas de Petri de plástico, lo suficientemente satisfactorios para cubrir el fondo. Si bubbles están presentes, soplo de aire en la superficie. Deje reposar por lo menos 24 horas a temperatura ambiente para ajustar.
    NOTA: los platos impregnados de elastómero de silicona se puede utilizar en varias ocasiones durante años. Sin embargo, no use etanol para la limpieza, ya que esto hará que el elastómero de silicona de roer.

5. Todo el montaje Disección de la cóclea (por P7 y muestras de edad avanzada)

  1. Separar la espira basal de vueltas medias / apicales
    1. Coloque un hueso temporal descalcificada en un plato de la disección con recubrimiento de elastómero de silicona rellena dos tercios de su capacidad con 10 mM de PBS pH 7,4 y el uso de un microscopio de disección estéreo para los siguientes pasos.
    2. Sostenga el hueso temporal en la región vestibular con # 4 o # 5 pinzas de joyero recta y usando 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, cortar el exceso de tejido cápsula ótica largo de los lados y por encima del ápice.
    3. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la ventana oval y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / lateralpared de la espira basal.
    4. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar y colocar la otra hoja en la parte externa del hueso temporal, medial a la ventana oval. Este corte separa la espira basal de giros medio y apical.
  2. La disección completa de la espira basal.
    1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan a la modiolo para liberar la tensión en la espira basal y corte por debajo de la espira basal de separar de los órganos vestibulares.
    2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, hacer una serie de pequeños cortes para retirar el ligamento espiral / pared lateral de ambos por encima y por debajo del órgano de Corti. Utilice # 4 o # 5 pinzas de joyero recta para guiar el tejido. Fijar las fibras nerviosas del ganglio espiral en el elastómero de silicona recubierto con plato de disección, pero no aferrarse a esta región como el tejido se rompa.
    3. Durante los pasos anteriores, algunos de los Membran de Reissnere a menudo será eliminado. Si alguna sigue siendo, sujete la membrana de Reissner con pinzas # 4 o # 5 de joyero recta y alejarse del órgano de Corti.
      NOTA: La membrana tectorial rara vez es visible y por lo general flota lejos sin necesidad de un paso específico para su eliminación.
    4. Finalmente hacer varios recortes para reducir el espesor de los axones del ganglio espiral, para hacer la vuelta lo más plano posible y utilizar # 4 o # 5 pinzas de joyero directamente a transferir la espira basal diseccionado, agarrando los axones restantes del ganglio espiral, a una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) que contiene ~ 500 l de 10 mM de PBS pH 7,4.
  3. Media separada y vueltas apical
    1. Coloque los dos tercios restantes de la cóclea, con el lado apical hacia abajo.
    2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la escala media, donde el giro medio utilizado para conectarse a la espira basal, y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / de la pared lateral del XXe espira media.
    3. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar con el giro medio colocado en la parte superior de la hoja, y coloque la otra hoja en la parte exterior del laberinto óseo, en un ángulo de 90 ° de la punta apical. Esto separa la espira media de la vuelta apical.
  4. La disección completa de la espira media de una manera similar a la vuelta basal (consulte los pasos 5.2.2 al 5.2.4).
  5. La disección completa de la vuelta apical.
    1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, abra la tapa que cubre el turno apical. Disección completa de una manera similar a la espira basal (consulte los pasos 5.2.2 a 5.2.4).
      NOTA: disecado giros cocleares pueden almacenarse en 10 mM PBS pH 7,4 en una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción. Sin embargo PBS se evaporará y necesita ser repuesto periódicamente y almacenamiento de más de 2 - 3 semanas puede dar lugar a crecimiento bacteriano o fúngico en eltejido que puede disminuir la calidad de la imagen. Se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras como los temporales no seccionada.

6. La inmunotinción con marcado con fluorescencia Anticuerpos

  1. Después de la disección, almacenar cada vez coclear en un pozo independiente en una placa de 48 pocillos (o diapositiva de cámara), sumergido en ~ 500 l de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada uno de los siguientes pasos el giro coclear debe ser sumergido en un líquido, no flotante en la parte superior o pegada a un lado del pozo.
    NOTA: Al retirar el líquido de cada pocillo, es fácil perder los giros cocleares o encárgate de la punta de la pipeta. Cambio de soluciones con una punta de pipeta 200 l usando un alcance de la disección ayudará a prevenir esto.
  2. Con una pipeta, retire PBS de cada pocillo y reemplazar con ~ 200 - 300 l por pocillo de bloquear / solución de permeabilización (1% Triton X-100, 1% de albúmina de suero bovino (BSA), y 10% de suero normal de cabra (NGS) diluido en PBS 10 mM pH 7,4). Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un rotador 3D.
    NOTA: Si cualquier anticuerpo primario utilizado fue hecha en un huésped de cabra, entonces será necesario un anticuerpo secundario de cabra anti-NGS y NO se debe utilizar para cualquiera de los pasos. Suero de caballo normal puede ser utilizado como un reemplazo para NGS.
  3. Eliminar la solución de bloqueo / permeabilización utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de solución de anticuerpo primario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada anticuerpo primario varía. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C en un rotador 3D.
    NOTA: Si se utiliza más de un anticuerpo primario, todas se pueden combinar en la misma solución para la incubación, sólo asegúrese de que cada anticuerpo primario tiene un host diferente.
  4. Retire solución de anticuerpo primario utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Cada lavado incuba un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D.
  5. Retire última PBS lavado usando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de una solución de anticuerpo secundario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y el 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada fluorescentemente etiquetado anticuerpo secundario es generalmente de 1: 500 o 1: 1000. Coloque la placa de 48 pocillos en un cuadro negro para proteger fluorescente etiquetados anticuerpos secundarios de la luz. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente en un rotador 3D.
    NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, que se pueden combinar en la misma solución para la incubación. Asegúrese de que no hay posibilidad de etiquetado cruz (ej., El uso de anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo y pollo anti-cabra)
  6. Retire solución de anticuerpo secundario con una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
  7. Retire último lavado PBS utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de CEOShst 33342 (diluido 1: 2000 en PBS 10 mM pH 7,4) para etiquetar los núcleos. Incubar 15 - 20 min a TA en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. No incubar más de 20 min.
  8. Retire la solución Hoechst utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
  9. Todos los pasos se pueden extender, excepto la incubación Hoechst, por varias horas si es necesario. Para detener la reacción en cualquier momento, simplemente sumergir las muestras en ~ 500 ul de PBS 10 mM pH 7,4 y almacenar la placa 48 -bien (o diapositiva de cámara) a 4 ° C hasta que esté listo para reanudar las horas de protocolo o de 1 - 2 días después .

7. Monte Coclear Activa Diapositivas

  1. Etiquetar los portaobjetos con información pertinente acerca de la muestra y los anticuerpos utilizados.
  2. Pipeta ~ 50 l de los medios de montaje en cada diapositiva y tener cuidadopara evitar burbujas. Centrifugar el tubo que contiene el medio de montaje para eliminar las burbujas.
  3. Usando # 4 o # 5 pinzas de joyero recta, sujete los axones del ganglio espiral para transferir suavemente una vuelta coclear de la placa de 48 pocillos a la diapositiva y el lugar en los medios de montaje. Monte una vuelta coclear por diapositiva para evitar exposición a la luz y fotoblanqueo durante el proceso de obtención de imágenes.
  4. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurar que a su vez coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, fórceps uso # 4 o # 5 de joyero directamente a reposicionar el turno coclear.
  5. Coloque un extremo de un cubreobjetos sobre el portaobjetos y suelte suavemente para dejar caer el cubreobjetos.
  6. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurarse de que la vuelta coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, mueva suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta para volver a colocar el turno coclear.
  7. Colocar los portaobjetosen una carpeta de diapositivas para que queden planos. Deje de montaje cura medios O / N a temperatura ambiente (mantener en la oscuridad)
  8. Cubreobjetos sello con esmalte transparente de uñas y almacenar a temperatura ambiente o -20 ° C hasta el fotografiado. Las diapositivas se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas o caja de portaobjetos.
    NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a largo plazo a -20 ° C o -80 ° C y la fluorescencia se mantendrá durante varios meses.
  9. Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal con la longitud de onda apropiada basada en los anticuerpos secundarios utilizados durante el procedimiento de inmunotinción. Ajustes de brillo y contraste se pueden realizar utilizando el software de imagen proporcionada por el vendedor confocal.

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Representative Results

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y base) a partir de tejido coclear que está calcificada, con escalones de disección clave presentados en la Figura 1. Durante la primera semana postnatal del desarrollo, la calcificación de la cóclea del ratón es incompleta y un método de disección más simple puede ser utilizado 13. Utilizando el método de disección neonatal todo el montaje con la cóclea de P7 y mayores ratones resulta en lágrimas y destrucción del órgano de Corti. El ligamento espiral / pared lateral es ahora más firmemente unida y no se puede despegar a partir del epitelio sensorial sin causar daños. Por lo tanto se necesita el método de "adulto" todo el montaje de disección para muestras mayores de P6. Se presenta un ejemplo de la vuelta medio de una cóclea del ratón P15 que se ha diseccionado y immunostained con células ciliadas y marcadores de células de apoyo (Figura 2). Secciones transversales ópticas cun también se pueden obtener con toda la técnica de montaje (Figura 3).

Varios problemas pueden ocurrir durante toda la disección de montaje o al montar el coclear convierte en portaobjetos. Durante la remoción del ligamento espiral / pared lateral, hay una estrecha ventana entre cortar demasiado o no lo suficiente. Los cortes que se producen junto a la última fila de las células ciliadas externas pueden causar las células ciliadas en esta última fila para montar en ángulos variados (Figura 4A). Los cortes que son demasiado grandes pueden eliminar secciones del órgano de Corti (Figura 4B). Manejo de la muestra con fórceps tiene mucho cuidado y con frecuencia hay agujeros en el órgano de Corti, donde estaban fuera de lugar unas pinzas (Figura 4C). Finalmente, cuando el montaje de los giros cocleares, el órgano de Corti puede doblar que oscurece la imagen (Figura 4D).

Figura 1
Figura 1. Pasos importantes en el monte entero Disección del "adulto" ratón cóclea. (A) Después del paso del protocolo 5.1.4, la espira basal de la cóclea se separa de vueltas medias / apicales, pero todavía unido a la región vestibular. (B) Después del paso del protocolo 5.3.3, el cambio medio se separa de la vuelta apical. (C) Ejemplo de la disección completa de un giro medio, donde se retira el ligamento espiral / de la pared lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2
Figura 2. confocal Slice Imagen del OrienteGire aislada de un P15 Mouse. Cuatro 20x imágenes se superponen para reconstruir toda la espira media. Las células ciliadas se etiquetan con un conejo anti-miosina VIIa anticuerpo primario (1: 200 dilución) combinado con un anticuerpo de burro anti-conejo Alexa 488-conjugado secundario (1: 1000 dilución) (magenta). Células de soporte se marcan con un anticuerpo de cabra anti-Sox2 primario (dilución 1: 500) combinada con un burro anti-cabra Alexa 568 anticuerpo conjugado secundario (1: 1000 dilución) (verde). Hoechst (azul) etiquetas de todos los núcleos. La imagen fue tomada con un microscopio confocal Zeiss LSM 700 con 405, 488 y 555 longitudes de onda. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. óptico Sección transversal del Medio Gire aislada de un 6 semanas de edad Mouse. (A) Imagen rebanada confocal de toda la preparación de montaje (parte inferior) y la sección transversal óptica en el plano XZ (arriba). (B) Aumento de la ampliación del panel superior en (A), con el punto de mira eliminados. Las células ciliadas se etiquetan con un conejo anti-miosina VIIa anticuerpo primario (1: 200 dilución) combinado con un anticuerpo de burro anti-conejo Alexa 647-conjugado secundario (1: 1000 dilución) (magenta). Células de soporte se marcan con un anticuerpo de cabra anti-Sox2 primario (dilución 1: 500) combinada con un burro anti-cabra Alexa 568 anticuerpo conjugado secundario (1: 1000 dilución) (verde). La imagen fue tomada con un microscopio confocal Zeiss LSM 700 con 405, 555 y 647 longitudes de onda. Las barras de escala = 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Ejemplos de problemas que pueden ocurrir durante el monte entero disección o al montar Coclear Activa Diapositivas. (A) En el lado izquierdo de la imagen, el tejido coclear fue cortada al lado de la última fila de las células ciliadas externas que causan muchos de estas células para ser montados en ángulos variados. (B) Una sección del órgano de Corti en el lado izquierdo de la imagen ha sido cortada. (C) Hay un agujero perforado en la región de células ciliadas externas en el medio de la imagen. (D), el órgano de Corti se pliega en varios lugares. Las imágenes fueron tomadas a partir de 4 - 8 semanas de edad cochleae ratón. Las células ciliadas se etiquetan con un conejo anti-miosina VIIa anticuerpo primario (1: 200 dilución) combinado con un anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa 488-conjugado anticuerpo secundario (1: 1000 dilución) o un burro anti-conejo Alexa 488-anticuerpo secundario conjugado (1: 1000 dilución) (magenta). En C cel ciliadas externasls se marcan con un anticuerpo de cabra anti-prestin primario (1: 200 dilución) combinado con un anticuerpo de burro anti-conejo Alexa 568-conjugado secundario (1: 1000 dilución) (verde). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal Leica SP5 con 405, 488 y 555 nm longitud de onda. Las barras de escala: en AB = 20 m; CD = 40 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay varios pasos críticos para el éxito de la disección de todo el montaje y la inmunotinción. Sin embargo antes de que cualquiera de estos métodos se llevan a cabo, se requiere la fijación adecuada del tejido coclear. Recomendamos el uso de metanol libre, ultra-pura, EM grado PFA. PFA hecha de polvo puede tener trazas de metanol y un pH inestable que disminuye la calidad de inmunofluorescencia. Otros grupos también han demostrado que las disecciones similares son posibles utilizando fijadores que no contienen formaldehído 14-16 de. La longitud de la fijación es también importante y es específica de anticuerpos. Algunos anticuerpos pueden tolerar un O / N fijación, mientras que otros no funcionan bien con sólo 1 hora en PFA (sin embargo esto es raro). Sub-fijo tejido puede ser problemático para el método de disección que el tejido se desmorona. En nuestra experiencia un 3 - 4 hr fijación proporciona una fijación adecuada y no interfiere con la mayoría de los anticuerpos primarios utilizados comúnmente en el campo de audición.

jove_content "> También es posible que el EDTA puede interferir con anticuerpos primarios;. Así, algunos anticuerpos funcionarán bien en el tejido neonatal, pero no en P7 o tejido antiguo que se descalcificar Después de la fijación, huesos temporales se pueden almacenar durante cantidades variables de tiempo antes descalcificación dependiendo de los antígenos que se examina. Algunos antígenos requieren descalcificación y la disección dentro de días a semanas después de la fijación, mientras que otros pueden ser almacenadas durante años (ya sea antes o después de la descalcificación) sin disminuir la calidad de la inmunotinción. Se recomienda almacenar muestras como huesos temporales debido al riesgo de la evaporación de los medios de almacenamiento (PBS) de la placa de 48 pocillos y la posible contaminación con hongos o bacterias. normalmente Llevamos a cabo toda la disección de montaje menos de una semana de antelación de la inmunotinción.

Una vez fijo y descalcificada, toda la disección de montaje se realiza con el hueso temporal sumergido en líquido. Eliminar el exceso de hueso y suavetejido que rodea el laberinto temprano en la disección ayudará en la eliminación del ligamento espiral / pared lateral en etapas posteriores, facilitando la manipulación del tejido y proporcionando una visión menos oculta de las estructuras críticas. Al realizar los primeros pocos pasos, los fórceps pueden ser utilizados para mantener el tejido en la región vestibular. Sin embargo una vez se aíslan las vueltas, es importante para evitar la colocación de pinzas en el órgano de Corti o ligamento / pared lateral espiral. En su lugar, mantener el fórceps cerrados y Pin de las fibras nerviosas del ganglio espiral en el plato de disección con recubrimiento de elastómero de silicona. No se acerque a esta región como el tejido se rompa. En general, una vez que el tejido se ha dividido en los tres turnos, agarrar y maniobras de tracción puede provocar resultados impredecibles, que a menudo son perjudiciales para el órgano de Corti y deben evitarse. El tejido de los animales más jóvenes (P7-P21) tiende a ser más indulgente que el tejido de los animales mayores de P21. Además, las muestras con las células ciliadas cocleares damage son más difíciles de diseccionar. Si el ratón recibió la exposición al ruido del tejido es especialmente frágil. Independientemente del estado de los tejidos, la disección que presentamos es técnicamente exigente y requiere muchos intentos de práctica para el dominio.

Durante la inmunotinción, es importante que cada giro coclear está sumergido en líquido, no flotante en la parte superior o pegada a un lado del pozo. Esto permite la penetración más completa de triton y los anticuerpos en el tejido. Al extraer el líquido de cada pocillo, es fácil perder el turno coclear o dibujar para arriba en la punta de la pipeta. Cambio de soluciones con una punta de pipeta 200 l usando un alcance de la disección ayudará a prevenir esto. Extraer lentamente el líquido y mover la punta de la pipeta si el giro coclear se acerca demasiado. También pipetteting solución de desecho en un tubo limpio puede ser una buena estrategia ya que este tubo de desecho se puede buscar si una vez se dibuja accidentalmente en la pipeta. Si el giro se ha quedado atascado en la punta de la pipeta, tque la punta se puede cortar abierto con una hoja de afeitar, pero a menudo el órgano de Corti se dañará si esto ocurre.

Cuando, se pueden añadir medidas adicionales, tales como la recuperación de antígenos o mejora de la señal solución de problemas anticuerpos para inmunotinción. Hay un pH bajo y el antígeno pH alto reactivos desenmascarar que se pueden comprar. Si un anticuerpo no funciona con el método descrito aquí, el primer cambio de protocolo a intentar es uno de estos métodos de recuperación de antígeno. También puede utilizar un promotor de la señal. Hay soluciones disponibles en el mercado para usar kits de amplificación antes de la inmunotinción, o tiramida que se pueden utilizar para amplificar la señal del anticuerpo secundario.

La importancia de la técnica que presentamos es la capacidad de mantener la estructura tridimensional del órgano de Corti y visualizar todas las células dentro del órgano. La longitud total de la cóclea se separa en sólo tres vueltas mientras que otras técnicas similares, a saber THmétodos e Bohne y Liberman, requieren división en 5 - 10 piezas 6-8, aumentando el número de muestras para maniobrar en los procesos de inmunotinción y de imagen. La disección de la pared lateral coclear que fue desarrollado por Cosgrove y Gratton requiere un nivel similar de habilidad y es posible en el tejido no fijado, fresca, así como en el tejido descalcificada, pero el órgano de Corti es despojado de distancia y destruido en el proceso de aislar el pared lateral 17. Otro grupo ha realizado disecciones similares en el tejido coclear no fijado, fresco de tres semanas de edad ratas donde el ligamento espiral / pared lateral se agarra y despojado de distancia desde el órgano de Corti, dejando el órgano intacto. Sin embargo esto sólo se logró en la vuelta apical 5. El método de pelado de la ligamento espiral / pared lateral lejos del órgano de Corti es de rutina para la disección de tejido fijado en un ratón joven (<P7) 13. Sin embargo, en nuestra experiencia con los ratones mayores de P6, después de una fijaciónd descalcificación, esta maniobra menudo desgarra el órgano de Corti de una manera poco fiable. Además, el procedimiento aquí descrito permite el aislamiento de media y basal gira también.

Criosecciones y secciones obtenidas después de la inclusión en parafina también se utilizan comúnmente en el campo auditivo. Estos métodos permiten la visualización de otras estructuras como la estría vascular, la membrana de Reissner y la membrana tectorial, sin embargo, cada sección sólo permite la visualización de una pequeña región del órgano de Corti en cada turno coclear. Así, para investigar los eventos que ocurren en un patrón de mosaico, como la pérdida celular o la división celular, con el método de seccionamiento, 50 o más diapositivas necesitan ser manchada y fotografiado para capturar toda la longitud de la cóclea. Por el contrario, todo el protocolo de disección de montaje tiene la ventaja de la preparación de todo el órgano de Corti en sólo tres piezas. Además del beneficio de la preservación de la arquitectura longitudinal del órgano de Corti, esta technique permite la recopilación de datos simplificada y almacenamiento. Una limitación de toda la disección de montaje es que destruye las estructuras circundantes tales como el ligamento espiral, la estría vascular, la membrana de Reissner, y la membrana tectorial. Otra limitación es la dificultad técnica y longitud de tiempo para una sola disección. Esto es sobre todo debido a la frágil naturaleza del órgano de Corti y pequeño margen de error al quitar el ligamento espiral / de la pared lateral. Una vez dominado, toda la disección de montaje de una sola cóclea se puede realizar en aproximadamente 20 - 30 min.

Mientras que el protocolo anterior describe un método de disección todo el montaje para el ratón adulto, esperamos poder aplicar esta técnica a otros organismos modelos utilizados en el campo auditivo. Nuestro laboratorio está modificando esta técnica para la disección de la cóclea de rata. La cóclea grande de la rata está encerrado en una cápsula ótica más grueso que está más densamente calcificado que el ratón. Así, el hueso temporal debe ser Excised con grandes tijeras. Antes de la fijación y descalcificación con EDTA, la cápsula ótica se debe abrir con tijeras para permitir un mejor acceso al tejido coclear. También el proceso de descalcificación es más largo y puede tomar hasta 3 semanas dependiendo de la edad de la muestra. Para toda la disección de montaje, el tamaño de la laberinto óseo afecta la técnica. El aumento del tamaño de la cóclea de rata proporciona una distancia ligeramente más grande entre el ligamento espiral / de la pared lateral y órgano de Corti, proporcionando un mayor margen de error para los cortes individuales. Sin embargo, mientras que el tejido más grande puede proporcionar más material de entender para la manipulación de la muestra, también requiere un mayor número de cortes para eliminar toda la longitud del ligamento espiral / de la pared lateral. Creemos que las modificaciones análogas podrían hacerse para la disección de la cóclea de chinchilla, jerbo, y cuy.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard  pattern forceps Fine Science Tools 11000-12 can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14060-11 can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes MidSci AVSS2000 can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade Polysciences 18814 TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. 
PBS pH 7.4  Sigma P3813-10PAK can be purchased from other vendors
EDTA Fisher BP118-500 can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator Fisher 05-450-127 can be purchased from other vendors
60 mm petri dish Fisher 50-202-037 can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal Fisher AC134372500 can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope Zeiss Stemi 2000 can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps Fine Science Tools 11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors Fine Science Tools 15001-08 curved 
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors Fine Science Tools 15003-08 straight
48-well plates Fisher 08-772-52 can be purchased from other vendors
8-well chamber slides Fisher 1256518 can be purchased from other vendors
Triton X-100 Sigma X100-500 can be purchased from other vendors
BSA, fraction V Fisher BP1605 can be purchased from other vendors
NGS Vector labs S-1000 can be purchased from other vendors
NHS Vector labs S-2000 can be purchased from other vendors
3D rotator Midsci R3D-710 can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL Licor 929-97401
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media Life Technologies P36930 can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides Fisher 12-550-15 can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1 Fisher 12-548-B can be purchased from other vendors
clear nail polish Local drug store can be purchased from other vendors
cardboard slide folder Fisher 12-587-10 can be purchased from other vendors
plastic slide box Fisher 03-448-10 can be purchased from other vendors

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References

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