Deacetylering Analyser att riva upp samspelet mellan Sirtuins (SIRT2) och specifikt protein-substrat

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. In vitro Deacetylering analys

  1. Rening av SIRT2
    1. Bered en 10 cm odlingsskål av HEK 293T-celler odlade i 8 ml DMEM med 10% FBS och antibiotika och odlas i en 37 ° C, 5% CO2 vävnadskultur inkubator för att vara ca 70% konfluenta nästa dag.
    2. Nästa dag, co-transfektera 4 | ig pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector tillverkad i vårt lab), 4 | ig pCMV- dR8.2 dvpr (förpackning vektor) och 0,5 | ig pCMV-VSV-G (hölje vektor) 18 med användning av polyetylenimin (PEI) i ett förhållande av 3 | il PEI / pg DNA.
    3. Ändra media efter 12 timmar.
    4. Supernatanten efter 36-48 timmar.
    5. Ta bort skräp genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
    6. Efter filtrering genom 0,22 um filter, göra 1 ml alikvoter av SIRT2 lentivirus och hålla vid -80 ° C.
    7. Tö SIRT2 lentivirus på is (det är viktigt att lagra viruset vid -80 ° C när viruset inte används).
    8. Infektera en 6-brunnars platta med 80 till 90% sammanflytande HEK 293T-celler med 1 ml lentivirus i närvaro av 8 pg / ml polybren.
    9. Placera virusinfekterade celler i 37 C inkubator tills nästa dag (24 h).
    10. Byt medium efter 24 timmar.
    11. 48 h efter infektion, ta infektionseffektivitet genom att detektera GFP-positiva celler under ett fluorescensmikroskop.
    12. Om infektion effektivitet är bra (åtminstone 40-50% infekterade celler), byt medium med odlingsmedium innehållande 2 ug / ml puromycin för att selektera för stabila SIRT2 över uttryckande celler.
      Anmärkning: Detta tar ca 2 veckor, och mediet byts var 3-4 dagar. Icke-infekterade celler dör under denna urvalsperioden och endast infekterade celler med SIRT2 lentivirus växa.
    13. Analysera uttryck av Flag-märkt SIRT2 genom western blotting med användning av en anti-Flag-antikropp (1: 1000 spädning) efter att ha kört 40 | j, g av totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel innan purifblue-processen (rekommenderas) 19,20.
    14. För att rena aktiv SIRT2, dela celler i förhållandet 1: 3 genom trypsinisering för att få tillräckligt med rätter av HEK 293T-celler stabilt överuttrycker Flag-SIRT2 (tio 10 cm rätter kommer att möjliggöra rening av tillräckligt med protein för efterföljande experiment).
      1. Att trypsinize cellerna, ta bort odlingsmedium och eliminera kvarvarande serum genom att skölja celler med sterila DPBS. Tillsätt långsamt 2,5 ml av en 0,25% trypsin-EDTA-lösning för att täcka cellmonoskiktet, inkuberas vid rumstemperatur under 30 till 45 sek. Efter avlägsnande av Trypsin-EDTA-lösning, inkubera vid 37 ° C tills cellerna börjar att lossna. Lägg sedan till odlingsmedium och överföra celler till nya rätter.
    15. Avlägsna odlingsmedium, tvätta cellerna två gånger i PBS och samla cellerna genom trypsinering, följt av centrifugering vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C.
    16. Lyse cellpelleten i 500 pl lysbuffert A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) innefattande en proteashämmare cocktail och 1 | iM TSA under 30 min vid 4 ° C under konstant rotation.
    17. Centrifugera vid 14.000 xg under 15 min vid 4 ° C och avsättning supernatanten till ett nytt rör.
    18. Utföra immunoutfällning med användning av en anti-Flag-antikropp konjugerad till agarospärlor såsom beskrivs nedan.
      1. Lägga 200-300 | il av anti-Flag-antikropp konjugerad till agarospärlor mot proteinet lysatet (10-20 mg totalt protein).
      2. Inkubera över natten vid 4 ° C med konstant omrörning.
      3. Samla immunoprecipitat genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
      4. Tvätta pelleten 5 gånger med 10 ml lyseringsbuffert A vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C. Efter varje tvätt, pelletera pärlorna och ersätta supernatanten med buffert A.
    19. Förbereda 1x Flag peptidlösning (inklusive en proteashämmare cocktail och 1 pM TSA i PBS).
    20. Tillsätt 500 l 1X flagga peptide lösning på agaroskulor och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C under konstant rotation.
    21. Samla in supernatanten genom centrifugering vid 6000 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
    22. Upprepa föregående två steg.
    23. Ta pärlor från supernatanten genom filterrören och centrifugering vid 15.000 xg i 1 min vid 4 ° C.
    24. Koncentrera eluerade provet tills den slutliga proteinkoncentrationen är 1 | j, g / | al med användning av ett ultrafiltreringsmembran.
    25. Kontrollera reningsprocessen genom att utföra elektrofores med användning av ett ^ g av det eluerade provet.
    26. Stain gel med en kommersiellt tillgänglig färglösning för att bekräfta SIRT2 rening.
    27. Hålla renat SIRT2 vid -80 ° C.
  2. Rening av Acetylerad protein-substrat
    1. Preparera 10 cm x 10 cm odlingsskålar med HEK 293T-celler att vara ca 70% konfluenta nästa dag.
    2. Nästa dag, co-transfektera celler med 5 mikrogram av en flagga märkt plasmidvektor expressing protein-substrat samt 5 ^ g av den specifika acetyl-transferas som kan acetylera proteinet med användning av PEI vid ett förhållande av 3 | il PEI / pg DNA.
      Obs: Om den specifika acetyl-transferas inte är känd, co-transfektera med en blandning av kända histon acetyl-transferaser (hattar) såsom p300, CBP, GCN5, TIP60 och PCAF.
    3. Byt medium efter 12 timmar.
    4. Dagen före lysering av cellerna, behandla cellerna med 1 | iM TSA och 2 mM nikotinamid (NAM) över natten genom att ersätta odlingsmediet med medium innehållande TSA / NAM att maximera acetylering nivåer av proteinet-substratet genom att hämma deacetylaser.
    5. 48 h efter transfektion, ta bort odlingsmedium, tvätta cellerna två gånger i PBS och samla upp celler genom trypsinering, följt av centrifugering vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C.
    6. Lyse cellpelleten i 500 | il lysbuffert A per skål (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) innefattande ett proteas inhibitors cocktail, 1 | iM TSA och 2 mM NAM under 30 min vid 4 ° C under konstant rotation.
    7. Centrifugera vid 14.000 xg under 15 min vid 4 ° C och avsättning supernatanten till ett nytt rör.
    8. Utföra immunoutfällning med användning av en anti-Flag-antikropp konjugerad till agarospärlor såsom beskrivs nedan.
      1. Lägga 200-300 | il av anti-Flag-antikropp konjugerad till agarospärlor mot proteinet lysatet (10-20 mg totalt protein).
      2. Inkubera över natten vid 4 ° C med konstant omrörning.
      3. Samla immunoprecipitat genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
      4. Tvätta pelleten 2 ggr med 10 ml lyseringsbuffert A vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C. Efter varje tvätt, pelletera pärlorna och ersätta supernatanten med lysbuffert A.
      5. Tvätta pelleten 3 gånger med 10 ml lyseringsbuffert A utan NAM vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C. Efter varje tvätt, pelletera pärlorna och ersätta supernatanten med lysbuffert A. Det är important inte att föra över alla NAM till deacetylering reaktionen.
    9. Förbered 1x Flag peptidlösning (inklusive proteashämmare och en iM TSA i PBS).
    10. Tillsätt 500 pl av 1x Flag-peptid lösning på agaroskulor och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C under konstant rotation.
    11. Samla in supernatanten genom centrifugering vid 6000 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
    12. Upprepa föregående två steg.
    13. Ta pärlor från supernatanten genom filterrören och centrifugering vid 15.000 xg i 1 min vid 4 ° C.
    14. Med användning av ett ultrafiltreringsmembran, koncentrera eluerade provet tills proteinkoncentrationen är 1 | j, g / ul.
    15. Utföra elektrofores genom att köra 1 pl av det eluerade provet på en 4-12% SDS-PAGE-gel.
    16. Bekräfta acetylering av protein-substrat genom western blotting med användning av antikroppar mot Ac-K (1: 1000 spädning) och proteinsubstrat (spädning beror på den specifika antikropp som används).
    17. hålla purierad acetylerad protein-substrat vid -80 ° C.
  3. I vitro Deacetylering reaktion
    1. Förbereda deacetyleringen buffert B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 0,5 pM TSA)
    2. Förbereda 3 olika reaktioner i olika rör i 20 ^ il slutlig volym (tabell 1).
    3. Inkludera ytterligare reaktioner för att bekräfta deacetylering av protein substratet genom SIRT2 (tillval). Tillsätt 2 mikrogram av renat deacetylering null mutant SIRT2 (detta kan göras med hjälp av det protokoll som beskrivs i 1.1 efter att ha använt en pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -FLAG lentivector) till reaktionen i stället för deacetylas aktiv SIRT2 eller lägga till 10 mM nikotinamid (NAM ) till reaktionen för att inhibera deacetylering aktiviteten av SIRT2 (tabell 1).
    4. Inkubera reaktioner under 3 timmar vid 30 ° C under konstant omrörning.
    5. Stoppa reaktionen genom tillsats av 20 pl av 2x provbuffert och koka proven feller 10 min vid 95 ° C.
    6. Utföra elektrofores genom att köra reaktionsblandningen på en 4-12% SDS-PAGE-gel och detektera acetyleringen status av proteinet-substratet genom western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp (1: 1000 utspädning) 19,20.

2. In vivo Deacetylering analys

  1. SIRT2 Överuttryck i odlade celler
    1. Förbered 10 cm odlingsskålar med HEK 293T-celler stabilt överuttrycker pCDH-puro-GFP-tom vektor, till pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag och pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -FLAG (som beskrivs i 1.1) vara ca 70 % konfluenta.
    2. Alternativt, förbereda 10 cm odlingsskålar med celler ca 70% konfluenta och utför övergående överuttryck med användning av 5 ^ g av vektorerna som nämnts ovan med användning av PEI vid ett förhållande av 3 | il PEI / pg DNA.
    3. Utföra western blotting av totala cellextrakt med användning av en anti-Flag-antikropp (1: 1000 spädning) för att demonstrera överuttryck av Flag-tagged SIRT2 19.
  2. RNA-interferens till Knockdown SIRT2 i odlade celler
    1. Förbered en 10 cm odlingsskål av HEK 293T-celler att vara ca 70% sammanflytande nästa dag.
    2. Nästa dag, co-transfektera 4 | ig pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 | ig pCMV- dR8.2 dvpr (förpackning vektor) och 0,5 | ig pCMV-VSV-G (kuvert vektor) 18 med användning av polyetylenimin (PEI) vid ett förhållande av 3 | il PEI / pg DNA.
      Obs! Knacka ner SIRT2 använder vi enkla hårnål shRNAs i pLKO.1 lentivirusvektorn utformats av RNAi Consortium (TRC).
    3. Följ proceduren som beskrivs i 1.1 för att producera shSIRT2 lentivirus och infektera målceller för knockdown SIRT2.
    4. Utföra western blotting av totala cellextrakt med användning av en anti-SIRT2 antikropp (1: 1000 spädning) för att demonstrera effektiv SIRT2 knockdown efter att ha kört 40 | j, g av totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
    5. Alternativt,förbereda 10 cm odlingsskålar med celler ca 70% sammanflytande och utföra gående knockdown av SIRT2 använder siRNA efter tillverkarens instruktioner.
    6. Utföra western blotting av totala cellextrakt med användning av en anti-SIRT2 antikropp (1: 1000 spädning) för att demonstrera effektiv SIRT2 knockdown efter att ha kört 40 | j, g av totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
  3. Immunoprecipitation och Immunoblotting att upptäcka Acetylerade nivåer i odlade celler
    1. 12 h före insamling cellpelletar från antingen celler som överuttrycker SIRT2 (se 2.1 ovan) eller SIRT2 knockade celler (se 2.2 ovan), tillsätt 1 pm TSA till odlingsmediet för att hämma icke klass III histondeacetylaser.
    2. Avlägsna odlingsmedium, tvätta cellerna två gånger i PBS och samla cellerna genom trypsinering, följt av centrifugering vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C.
    3. Tillsätt 10 ml lysbuffert A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) innefattande en proteashämmare cocktail, 1 | iM TSA och 2 mM NAM.
    4. Inkubera vid 4 ° C under 30 min under konstant rotation.
    5. Samla supernatanter genom centrifugering vid 20.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
    6. Beräkna proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-proteinanalys.
    7. Överföring 1 mg av totalprotein till nya rör i en slutlig volym av 1 ml med användning av lysbuffert A. Användning Tabell 2 som en referens för att framställa proteinprover från celler antingen överuttrycker SIRT2 eller efter SIRT2 knockdown.
    8. Utföra en immunutfällning med användning av en antikropp mot det specifika proteinet-substrat tillsammans med protein A / G (40 ^ il pärluppslamningen rekommenderas). Alternativt kan du använda en anti Ac-K-antikropp konjugerad till agarospärlor (20 pl pärluppslamningen brukar räcka) att immunfälla alla acetylerade proteiner.
    9. Inkubera proverna vid 4 ° C under Constant rotation över natten.
    10. Samla immunoprecipitat genom centrifugering vid 1000 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
    11. Tvätta pärlorna 5 gånger med 1 ml buffert A vid 1000 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
    12. Resuspendera pärlor i 40 pl 2x provbuffert.
    13. Koka prover för 10 min vid 95 ° C.
    14. Utföra elektrofores genom att köra de eluerade prover (40 | il från steg 2.3.12) på en 4-12% SDS-PAGE-gel utan att störa pärlorna samtidigt överföra de eluerade proverna.
    15. Detektera acetylerade nivåer av proteinet-substratet genom Western blotting med användning av en anti-Ac-K-antikropp (1: 1000 spädning), om ett protein-substrat specifik antikropp användes för immunfällning, eller en specifik antikropp mot proteinet-substratet (följ rekommendationer för den specifika antikroppen beträffande utspädning) om anti Ac-K pärlor användes för immunoutfällning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För ett protein betraktas som en legitim deacetylering mål för varje enzym med deacetylering aktivitet både in vitro och in vivo deacetylering analyser måste utföras för att fastställa samspelet mellan deacetylas och dess substrat. För in vitro-deacetylas-analys, är rening av både deacetylas och den acetylerade proteinsubstrat som krävs innan analysen kan göras. Här använder vi den cytoplasmiska sirtuin SIRT2 som den specifika deacetylas som ska studeras. SIRT2 är en deacetylas-enzymet och användningen av en mutant som saknar den deacetylas-aktivitet rekommenderas starkt som en negativ kontroll för deacetylering analysen. Med användning av reningsförfarandet som beskrivs i 1,1, kan både SIRT2 och SIRT2 H187Y med framgång renas vid en slutlig koncentration av 1 ug / ul. Detta kan bekräftas efter att ha kört de renade proteinerna på en gel följt av färgning(Figur 1 A, övre) såväl som efter western blotting med användning av en anti-Flag-antikroppen eftersom både SIRT2 och SIRT2 H187Y är märkta med en Flag-peptid (Figur 2A, nedre). Samma reningsförfarande kan följas för rening av den proteinsubstrat med vissa modifieringar. Proteinet måste acetyleras innan den kan användas för deacetylering analys som innebär att det måste renas i celler som överuttrycker den specifika acetyltransferas eller en blandning av HATs med förmåga att acetylera proteinet. Med användning av reningsförfarandet som beskrivs i 1,2, kan den acetylerade proteinet renas (Figur 1B, övre). För att bekräfta att proteinet faktiskt är acetylerad och kan användas för deacetylering analysen in vitro, är det nödvändigt western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp för att visa ökade acetylerade nivåer av det renade proteinet i celler som överuttrycker acetyl-transferaser (Figur 1B, lower).

Efter framgångsrik proteinrening, kan utföras deacetyleringen-analysen in vitro. Sirtuins, inklusive SIRT2, är klass III histon lysin deacetylaser som skiljer sig från andra deacetylaser eftersom de kräver NAD + för deras enzymatisk funktion. I överensstämmelse med detta kan ingen deacetylering detekteras genom western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp i frånvaro av NAD +, oavsett närvaron av katalytiskt aktivt SIRT2 (Figur 2, spår 2 vs 1). Tvärtom minskade acetylerade nivåer av den acetylerade proteinet när både SIRT2 och NAD + är närvarande i reaktionen tyder på att proteinet kan betraktas som en deacetylering mål för SIRT2. För att verifiera dessa resultat, kan olika negativa kontroller användas. Till exempel ingen skillnad i deacetylering nivåer av proteinet kan detekteras när en deacetylering bristfällig SIRT2 (SIRT2 H187Y) används i stället för den katalytiskt aktiva vildtyp SIRT2 (figur 2, bana 5 vs 4). Liknande effekt kan ses när en väletablerad sirtuin inhibitor, NAM, tillsätts till reaktionsblandningen, vilket innebär att minskningen i de acetylerade nivåer av proteinet förmedlas av deacetylas aktiviteten av SIRT2.

Avvikande deacetylering är involverad i flera cellulära processer och åldersrelaterade sjukdomar. Således är ett viktigt steg i att fördjupa vår kunskap om samspelet mellan en deacetylas och dess substrat för att etablera denna sammankoppling i celler där detta fenomen kan ha en fysiologisk effekt. Dessutom kontrollerar deacetylering i cellodlingssystem in vivo möjliggör studiet av deacetylering händelsen i en cell eller vävnad specifika sammanhang som lättare kan anslutas till en specifik fenotyp eller resultatet. Detta utesluter möjligheten att den detekterade in vitro DEACetylation aktivitet är konstgjord på grund av närvaron av både deacetylas och dess substrat i röret på samma gång, som aldrig kan inträffa under normala fysiologiska betingelser i celler. För deacetylering analysen in vivo, kan celler som överuttrycker både SIRT2 och SIRT2 H187Y samt proteinsubstrat användas efter de förfaranden som beskrivs i 2.1 och 2.2. Cellextrakt framställda från dessa celler kan bekräftas att uttrycka SIRT2, SIRT2 H187Y, och proteinet substratet genom western blotting med användning av specifika antikroppar. I den analys som beskrivs här, alla exogent uttryckta proteiner är taggade för enkel de utförda experimenten (Figur 3, nedre panelen för att detektera HA-tagged SIRT2 / SIRT2 H187Y och mellersta fältet för att detektera Flag-märkt protein-substrat). För att bestämma huruvida mål-proteinet är en deacetylering substrat av SIRT2 är immunutfällning utfördes med användning av en anti-Flag-antikropp för att dra ner målproteinet followed med western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp. Minskning av de acetylerade nivåer av proteinet i celler som uttrycker SIRT2 (Figur 3 övre panelen, bana 3 vs 2) och underlåtenhet att påverka acetylerade nivåer i celler som uttrycker den deacetylas deficient SIRT2 mutanten (fig 3 övre panel, bana 4 vs 3) tyder på att den acetylerade proteinet kan vara en deacetylering mål av den specifika deacetylas in vivo. Detta kan bekräftas ytterligare när SIRT2-medierad deacetylering hämmas efter behandling celler med NAM (Figur 3 övre panel, spår 5 mot 3) om fastställande av särskilda deacetylas-substrat axeln i de studerade cellerna.

Figur 1
Figur 1: Rening av både deacetylas och den acetylerade proteinsubstrat som skall användas för in vitro-deacetylering analysen in. (A) 1 ^ g av både SIRT2 och SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) kördes på en gel efter reningsprotokollet som beskrivs i 1.1. Gelén färgades med en kommersiellt tillgänglig färglösningen och efter avfärgning, både renade proteiner kan detekteras (övre). Proteiner kan detekteras efter överföring i PVDF-membran och Western blotting med användning av en anti-Flag antikropp (lägre). (B) 1 ^ g av proteinsubstrat och hyper acetylerad proteinsubstrat (alfa-enolas användes som ett SIRT2 substrat baserade på masspektrometri opublicerade data som genereras i vårt labb) kördes på en gel efter reningsprotokollet som beskrivs i 1.2. Gelén färgades med en kommersiellt tillgänglig färglösningen och efter avfärgning, kan det renade proteinet substratet detekteras (övre). Acetylering kan detekteras efter överföring i PVDF-membran och Western blotting med användning av en anti-Ac-K-antikropp (mitten). total p roteins kan detekteras med hjälp av en anti-Flag antikropp (lägre). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. I deacetylering vitro assay Renat acetylerad proteinsubstrat (alfa-enolas) inkuberas med SIRT2 eller SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) i närvaro av NAD + (spår 4 och 5). Minskade acetylerade nivåer detekteras genom western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp i närvaro av SIRT2 men inte i närvaro av SIRT2 H187Y (spår 4 vs 5). Ingen deacetylering aktivitet observeras när NAD + inte ingår i reaktionsblandningen (spår 2 vs 4) eller när NAM tillsätts till reaktionsblandningen (spår 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. In vivo deacetylering analys HEK293T celler som stabilt överuttrycker antingen SIRT2 eller SIRT2 H187Y samtransfekterades med proteinsubstrat (alfa-enolas) och hattar att öka acetylerade nivåer av proteinet (bana 2 mot 1). Deacetylering kontrollerades in vivo efter immunfällning med användning av en anti-Flag-antikropp för att dra ned proteinsubstrat och western blotting med användning av en anti Ac-K-antikropp. Acetylering minskas betydligt under de SIRT2 överuttryckande celler jämfört med den SIRT2 H187Y överuttryckande celler (spår 3 vs 4). Den SIRT2 medierad deacetyleringav proteinsubstrat hämmas när cellerna behandlas med NAM (spår 5 mot 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

reaktioner 1 2 3 4 (tillval) 5 (tillval)
renat acetylerat proteinsubstrat (10 mikrogram) + + + + +
buffert B + + + + +
renat SIRT2 (2 mikrogram) - + + - +
NAD + (1 m |) - - + + +
renat SIRT2 H187Y (2 mikrogram) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tabell 1: Reaktions ingredienser.

prover överuttryck knockdown
1 pCDH-puro-GFP-tom vektor pLKO1 tom vektor eller si ctr
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 sh SIRT2 en eller si SIRT2 1
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -FLAG pLKO1 sh SIRT2 två eller si SIRT2 2

Tabell 2: Proteinprover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Projektet beskrivs här stöddes av ett bidrag från NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) samt av Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - den Lefkofsky Family Foundation / Liz och Eric Lefkofsky Innovation Research Award till AV Vi vill att tacka medlemmar av laboratoriet (Carol O'Callaghan och Elizabeth Anne Wayne) för kritisk läsning och redigera detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics