Désacétylation essais pour démêler les Interplay entre sirtuines (SIRT2) et protéines substrats spécifiques

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Essai in vitro désacétylation

  1. Purification de SIRT2
    1. Préparer une boîte de cellules HEK 293T cultivées dans 8 ml de DMEM avec 10% de FBS et des antibiotiques et cultivées dans un 37 ° C, 5% CO 2 culture tissulaire incubateur à environ 70% de confluence le jour suivant culture de 10 cm.
    2. Le lendemain, co-transfecter 4 pg pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector faite dans notre laboratoire), 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (emballage vecteur) et 0,5 pg de pCMV-VSV-G (vecteur d'enveloppe) 18 en utilisant la polyéthylèneimine (PEI) à un rapport de 3 ul d' ADN / pg de PEI.
    3. Changer les médias après 12 h.
    4. Recueillir surnageant après 36-48 h.
    5. Retirer les débris par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
    6. Après filtration de 0,22 um filtres, faire 1 ml aliquotes de SIRT2 lentivirus et de garder à -80 ° C.
    7. SIRT2 lentivirus décongélation sur de la glace (il est important de stocker le virus à -80 ° C lorsque le virus n'a pas été utilisé).
    8. Infecter une plaque à 6 puits de 80 à 90% des cellules 293T confluentes HEK avec 1 ml d'un lentivirus, en présence de 8 pg / ml de polybrène.
    9. Placez les cellules infectées par le virus dans 37 ° C incubateur jusqu'au lendemain (24 h).
    10. Remplacer milieu après 24 h.
    11. 48 heures après l'infection, vérifier l'efficacité de l'infection par la détection de cellules positives à la GFP au microscope à fluorescence.
    12. Si l' efficacité de l' infection est bonne (au moins 40 à 50% des cellules infectées), remplacer milieu par du milieu de culture contenant 2 pg / ml de puromycine pour sélectionner des SIRT2 stables sur des cellules exprimant.
      Remarque: Cette opération prend environ 2 semaines, et le milieu est changé tous les 3-4 jours. Les cellules non infectées meurent au cours de cette période de sélection, et seules les cellules infectées par le lentivirus SIRT2 croître.
    13. Analyser l'expression de SIRT2 étiquetée Flag par transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Flag (1: 1000 dilution) après l'exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10% avant de commencer la purifprocessus de ication (recommandé) 19,20.
    14. Pour purifier SIRT2 actif, des cellules intermédiaires en rapport 1: 3 par trypsinisation afin d'avoir suffisamment de boîtes de cellules HEK 293T stable surexprimant Flag-SIRT2 (Dix boîtes de 10 cm permettront la purification de suffisamment de protéines pour des expériences ultérieures).
      1. Pour trypsiniser les cellules, éliminer le milieu de culture et d'éliminer le sérum résiduel par rinçage des cellules avec du DPBS stériles. Ajouter lentement 2,5 ml d'une solution de trypsine-EDTA à 0,25% pour couvrir la monocouche cellulaire, incuber à température ambiante pendant 30 à 45 secondes. Après avoir enlevé la solution de trypsine-EDTA, on incube à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Puis ajouter le milieu de culture et de transférer les cellules à de nouveaux plats.
    15. Retirer le milieu de culture, laver les cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivies par centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    16. Lyse culot cellulaire dans 500 pi de tampon de lyse A (20 mM HEPES , pH 7,9, 18 mM de KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant un cocktail d'inhibiteurs de la protéase et de 1 uM de TSA pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    17. Centrifuger à 14 000 xg pendant 15 min à 4 ° C et on transfert le surnageant dans un nouveau tube.
    18. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 200 à 300 pi d'anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose au lysat des protéines (10 à 20 mg de protéines totales).
      2. Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation constante.
      3. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Laver le culot 5 fois avec 10 ml de tampon de lyse A à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec le tampon A.
    19. Préparer la solution Drapeau de peptide 1x (y compris un cocktail d'inhibiteurs de la protéase et 1 uM TSA dans du PBS).
    20. Ajouter 500 pi de 1x Drapeau peptidsolution e aux billes d'agarose et incuber pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    21. Recueillir le surnageant par centrifugation à 6000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    22. Répétez deux étapes précédentes.
    23. Retirer les perles à partir du surnageant en utilisant des tubes de filtration et une centrifugation à 15 000 x g pendant 1 min à 4 ° C.
    24. Concentrer l'échantillon élué jusqu'à ce que la concentration finale en protéine est de 1 pg / pl en utilisant une membrane d'ultrafiltration.
    25. Vérifiez procédé de purification par électrophorèse effectuant en utilisant 1 pg de l'échantillon élue.
    26. Gel tache avec une solution de coloration disponible dans le commerce pour confirmer la purification de SIRT2.
    27. Gardez SIRT2 purifiée à -80 ° C.
  2. Purification de la protéine-substrat acétylé
    1. 10 cm x préparer des boîtes de culture de 10 cm avec des cellules HEK 293T à environ 70% de confluence le jour suivant.
    2. Les cellules lendemain, co-transfecter avec 5 ug d'un drapeau tagged vecteur plasmidique expressing la protéine de support, ainsi que 5 ug de l'acétyl-transférase spécifique qui peut acétyler la protéine en utilisant PEI à un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
      Remarque: Si l'acétyl-transférase spécifique est pas connue, co-transfecter avec un mélange d'histones connu acétyl-transférases (HATS) tels que p300, CBP, GCN5, Tip60 et PCAF.
    3. Changer le milieu après 12 h.
    4. La veille de la lyse des cellules, de traiter les cellules avec 1 uM de TSA et 2 mM de nicotinamide (NAM) pendant une nuit en remplaçant le milieu de culture avec un milieu contenant du TSA / NAM afin de maximiser les niveaux de la protéine substrat d'acétylation en inhibant désacétylases.
    5. 48 heures après la transfection, éliminer le milieu de culture, le lavage des cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivie d'une centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    6. Lyse culot cellulaire dans 500 pi de tampon de lyse par boîte A (20 mM HEPES, pH 7,9, 18 mM de KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant une protéase inhibitors cocktail, 1 uM TSA et NAM 2 mM pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    7. Centrifuger à 14 000 xg pendant 15 min à 4 ° C et on transfert le surnageant dans un nouveau tube.
    8. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 200 à 300 pi d'anticorps anti-Flag conjugué à des billes d'agarose au lysat des protéines (10 à 20 mg de protéines totales).
      2. Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation constante.
      3. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      4. Laver le culot 2 fois avec 10 ml de tampon de lyse A à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec un tampon de lyse A.
      5. Laver le culot 3 fois avec 10 ml de tampon de lyse A sans NAM à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après chaque lavage, les billes sédimenter et remplacer le surnageant avec un tampon de lyse A. Il est important pas porter sur toute NAM à la réaction de désacétylation.
    9. Préparer la solution Drapeau de peptide 1x (y compris les inhibiteurs de la protéase et 1 uM TSA dans du PBS).
    10. Ajouter 500 ul de solution peptidique 1x drapeau aux billes d'agarose et on incube pendant 30 min à 4 ° C sous rotation constante.
    11. Recueillir le surnageant par centrifugation à 6000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    12. Répétez deux étapes précédentes.
    13. Retirer les perles à partir du surnageant en utilisant des tubes de filtration et une centrifugation à 15 000 x g pendant 1 min à 4 ° C.
    14. En utilisant une membrane d'ultrafiltration, on concentre jusqu'à ce que l'échantillon élué la concentration en protéine est de 1 ug / ul.
    15. Effectuer l'électrophorèse en exécutant 1 pl de l'échantillon élue sur un gel SDS-PAGE 4-12%.
    16. Confirmer l'acétylation de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant des anticorps dirigés contre l'Ac-K (1: 1000 dilution) et la protéine-substrat (dilution dépend de l'anticorps spécifique utilisé).
    17. Gardez purifiée acétyle protéine-substrat à -80 ° C.
  3. La désacétylation in vitro Réaction
    1. Préparer le tampon de désacétylation B (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM MgCl 2 0,5 pM de TSA)
    2. Préparer des 3 différentes réactions dans des tubes différents dans un volume final de 20 pi (tableau 1).
    3. Inclure des réactions supplémentaires pour confirmer la désacétylation de la protéine substrat par SIRT2 (facultatif). Ajouter 2 pg de désacétylation purifié nulle SIRT2 mutant (ce qui peut être fait en utilisant le protocole décrit en 1.1 après avoir utilisé un lentivirus pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) pour la réaction au lieu de désacétylase SIRT2 actif ou ajouter 10 mM de nicotinamide (NAM ) la réaction d'inhiber l'activité de désacétylation de SIRT2 (tableau 1).
    4. Incuber les réactions pendant 3 heures à 30 ° C sous agitation constante.
    5. Arrêter la réaction en ajoutant 20 pi de tampon d'échantillon 2x et faire bouillir les échantillons fou 10 min à 95 ° C.
    6. Effectuer une électrophorèse en exécutant le mélange réactionnel sur un gel SDS-PAGE à 4-12% et à détecter l'état d'acétylation de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant un Ac-K anticorps anti (1: 1000 dilution) 19,20.

2. Essai in vivo désacétylation

  1. SIRT2 surexpression dans des cellules cultivées
    1. Préparer 10 plats cm de culture avec les cellules HEK 293T surexprimant de manière stable pCDH-puro-GFP-vecteur vide, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag et pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (tel que décrit dans 1.1) pour être environ 70 % confluentes.
    2. En variante, la préparation des boîtes de culture de 10 cm avec des cellules confluentes à environ 70% et d'effectuer une surexpression transitoire en utilisant 5 pg des vecteurs mentionnés ci-dessus en utilisant PEI à un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
    3. Effectuer western blot d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-Flag (1: 1000 dilution) pour démontrer la surexpression de Flag-tagged SIRT2 19.
  2. Interférence ARN à Knockdown SIRT2 dans des cellules cultivées
    1. Préparer un plat de cellules HEK 293T de culture de 10 cm à environ 70% de confluence le jour suivant.
    2. Le lendemain, co-transfecter 4 pg pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 pg pCMV dR8.2 dvpr (vecteur d'emballage) et 0,5 pg de pCMV-VSV-G (vecteur d'enveloppe) 18 en utilisant de la polyéthylèneimine (PEI) dans un rapport de 3 ul d'ADN / pg de PEI.
      Note: Pour abattre SIRT2, nous utilisons des shRNA en épingle à cheveux simples dans le vecteur pLKO.1 lentiviral conçu par Le RNAi Consortium (TRC).
    3. Suivez la procédure décrite au point 1.1 pour produire shSIRT2 lentivirus et infecter les cellules cibles à knockdown SIRT2.
    4. Effectuer un transfert de Western d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-SIRT2 (1: 1000 dilution) pour démontrer l' efficacité SIRT2 effet de choc après l' exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10%.
    5. Alternativement,préparer 10 plats de culture de cellules cm avec environ 70% de confluence et effectuer knockdown transitoire de SIRT2 utilisant siRNA suivant les instructions du fabricant.
    6. Effectuer un transfert de Western d'extraits cellulaires totaux en utilisant un anticorps anti-SIRT2 (1: 1000 dilution) pour démontrer l' efficacité SIRT2 effet de choc après l' exécution de 40 pg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE à 10%.
  3. Immunoprécipitation et immunotransfert pour détecter les niveaux acétylés dans les cellules cultivées
    1. 12 h avant de recueillir les culots cellulaires à partir soit des cellules surexprimant SIRT2 (voir 2.1 ci - dessus) ou SIRT2 renversé cellules (voir 2.2 ci - dessus), ajouter 1 pm TSA au milieu de culture pour inhiber la classe III désacétylases non histones.
    2. Retirer le milieu de culture, laver les cellules deux fois dans du PBS et recueillir les cellules par trypsinisation suivies par centrifugation à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Ajouter 10 ml de tampon de lyse A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM de KCl, mM EGTA 0,2, 1,5mM de MgCl2, 20% de glycerol, 0,1% de NP-40) comprenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase, 1 uM de TSA et 2 mM NAM.
    4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min sous rotation constante.
    5. Collecter les surnageants par centrifugation à 20.000 xg pendant 15 minutes à 4 ° C.
    6. Calculer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéine de Bradford.
    7. Transfert 1 mg de protéine totale dans de nouveaux tubes dans un volume final de 1 ml en utilisant un tampon de lyse A. Utilisation Tableau 2 comme référence pour préparer des échantillons de protéines à partir de cellules surexprimant soit SIRT2 ou après SIRT2 effet de choc.
    8. Effectuer une immunoprécipitation en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine-substrat spécifique avec la protéine A / G (40 ul de suspension de billes est recommandée). Vous pouvez également utiliser un anticorps anti Ac-K conjugué à des billes d'agarose (20 pi perles suspension est généralement suffisant) pour immunoprécipiter toutes les protéines acétylés.
    9. Incuber les échantillons à 4 ° C sous constant rotation pendant une nuit.
    10. Recueillir immunoprécipités par centrifugation à 1000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    11. Lavez perles 5 fois avec 1 ml de tampon A à 1000 g pendant 2 min à 4 ° C.
    12. Remettre les billes dans 40 pl de tampon 2x échantillon.
    13. échantillons Faire bouillir pendant 10 min à 95 ° C.
    14. Effectuer une électrophorèse en exécutant les échantillons élues (40 ul provenant de l'étape 02/03/12) sur un gel de SDS-PAGE à 4-12%, sans perturber les billes tout en transférant les échantillons élues.
    15. Détecter les niveaux acétylée de la protéine substrat par transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Ac-K (1: 1000 dilution) dans le cas d'un anticorps spécifique de la protéine-substrat a été utilisé pour l'immunoprécipitation, ou un anticorps spécifique dirigé contre la protéine-substrat (suivi les recommandations l'anticorps spécifique en ce qui concerne la dilution) dans le cas des billes anti-Ac-K ont été utilisées pour immunoprécipitation.

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Representative Results

Pour qu'une protéine doit être considérée comme une cible de désacétylation légitime pour toute enzyme ayant une activité de désacétylation, à la fois in vitro et in vivo , des essais de désacétylation doivent être effectués pour déterminer l'interaction entre la déacétylase et son substrat. Pour le dosage désacétylase in vitro, à la fois la purification de la déacétylase et le substrat de protéine acétylée est nécessaire avant que le dosage peut être effectué. Ici, nous utilisons la SIRT2 sirtuines cytoplasmique comme déacétylase spécifique à étudier. SIRT2 est une enzyme désacétylase et l'utilisation d'un mutant qui est dépourvu de l'activité de désacétylase est fortement recommandée en tant que témoin négatif pour le dosage de désacétylation. En utilisant la procédure de purification décrite au point 1.1, à la fois SIRT2 et SIRT2 H187Y peuvent être purifiés avec succès à une concentration finale de 1 pg / pl. Cela peut être confirmé après avoir exécuté les protéines purifiées sur gel suivie d'une coloration(Figure 1A, en haut) et après western blot en utilisant un anticorps anti-Flag puisque les deux SIRT2 et SIRT2 H187Y sont étiquetés avec un peptide Flag (figure 2A, plus bas). La même procédure de purification peut être suivie pour la purification du substrat protéique avec quelques modifications. La protéine doit être acétylée avant qu'il puisse être utilisé pour le dosage de désacétylation ce qui signifie qu'il doit être purifié dans des cellules surexprimant l'acétyl transférase spécifique ou un mélange de HATs aptes à acétyler la protéine. En utilisant la procédure de purification décrite au point 1.2, la protéine peut être purifiée acétylé (figure 1B, en haut). Pour confirmer que la protéine est en effet acétylée et peut être utilisé pour le dosage in vitro de désacétylation, par transfert de Western en utilisant un anticorps anti Ac-K est nécessaire pour montrer des niveaux accrus acétylée de la protéine purifiée dans des cellules surexprimant l'acétyl-transférase (figure 1B, lower).

Après purification de la protéine, de l'essai in vitro de désacétylation peut être effectuée. Sirtuines, y compris SIRT2, sont de classe III désacétylases histone lysine qui sont distincts des autres désacétylases car ils nécessitent NAD + pour leur fonction enzymatique. Conformément à cela, aucune désacétylation peut être détectée par transfert de Western en utilisant un anticorps anti Ac-K en l'absence de NAD +, indépendamment de la présence de SIRT2 catalytiquement active (Figure 2, piste 2 vs 1). Au contraire, une diminution du taux acétylée de la protéine acétylée lorsque les deux SIRT2 et NAD + sont présents dans la réaction suggèrent que la protéine peut être considérée comme une cible de désacétylation pour SIRT2. Afin de vérifier les résultats, les différents contrôles négatifs peuvent être utilisés. Par exemple , aucune différence dans les niveaux de la protéine de désacétylation peut être détectée quand un SIRT2 déficient désacétylation (H1 SIRT287Y) est utilisé au lieu du type sauvage SIRT2 catalytiquement actif (Figure 2, piste 5 vs 4). le même effet peut être vu quand un inhibiteur de sirtuine bien établie, NAM, on ajoute au mélange réactionnel, ce qui implique que la diminution du taux acétylée de la protéine est induite par l'activité de désacétylase de SIRT2.

désacétylation Aberrant est impliquée dans plusieurs processus cellulaires et les maladies liées à l'âge. Ainsi, une étape cruciale dans l'approfondissement de nos connaissances sur l'interaction entre un déacétylase et son substrat est d'établir cette interconnexion dans les cellules où ce phénomène peut avoir un impact physiologique. En outre, la vérification désacétylation dans les systèmes de culture cellulaire in vivo permet l'étude de cas de désacétylation dans un contexte spécifique ou d'un tissu cellulaire , qui peut être plus facilement relié à un phénotype ou un résultat particulier. Ceci exclut la possibilité que le détectée dans DEAC in vitrol'activité est etylation artificielle due à la présence à la fois du déacétylase et de son substrat dans le tube en même temps, ce qui ne peut jamais se produire dans des conditions physiologiques normales dans des cellules. Pour l'essai in vivo de désacétylation, à la fois des cellules surexprimant SIRT2 et SIRT2 H187Y, ainsi que le substrat protéique peuvent être utilisés suivant les procédures décrites aux points 2.1 et 2.2. Des extraits cellulaires préparés à partir de ces cellules peuvent être confirmées pour exprimer SIRT2, SIRT2 H187Y, et le substrat de protéine par transfert de Western en utilisant des anticorps spécifiques. Dans l'essai décrit ici, les protéines exprimées sont toutes exogène étiquetées pour faciliter des expériences réalisées (figure 3, panneau inférieur pour détecter SIRT2 HA-tagged / SIRT2 H187Y et panneau central pour détecter substrat protéique Flag-tagged). Pour déterminer si la protéine cible est un substrat de SIRT2 de désacétylation, immunoprécipitation est réalisée en utilisant un anticorps anti-Flag à tirer vers le bas la protéine cible followed par transfert de Western en utilisant un anticorps anti-K Ac. Diminution des niveaux acétylés de la protéine dans les cellules exprimant SIRT2 (Figure 3 panneau supérieur, piste 3 vs 2) et l' incapacité à influer sur les niveaux acétylés dans les cellules exprimant le déacétylase mutant déficient de SIRT2 (Figure 3 panneau supérieur, piste 4 vs 3) suggèrent que la protéine acétylée peut être une cible de désacétylation de la déacétylase spécifique in vivo. Cela peut être confirmé encore lorsque désacétylation de SIRT2 médiée est inhibée après le traitement des cellules avec NAM (Figure 3 panneau supérieur, piste 5 vs 3) établissant l'axe spécifique déacétylase-substrat dans les cellules étudiées.

Figure 1
Figure 1: Purification de la déacétylase fois et la protéine-substrat acétylé à utiliser pour l'analyse in vitro de désacétylation. (A) 1 pg de deux SIRT2 et SIRT2 H187Y (désacétylation mutant défectueux) ont été effectuées sur un gel suivant le protocole de purification tel que décrit au point 1.1. Le gel a été coloré avec une solution de coloration disponible dans le commerce et après décoloration, à la fois des protéines purifiées peuvent être détectées (supérieure). Les protéines peuvent être détectées après le transfert dans une membrane PVDF et un transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Flag (inférieur). (B) 1 pg de substrat protéique et hyper substrat protéique acétylée (alpha-énolase a été utilisé comme substrat SIRT2 basée sur la spectrométrie de masse des données non publiées produites dans notre laboratoire) ont été passés sur un gel suivant le protocole de purification tel que décrit dans le 1.2. Le gel a été coloré avec une solution de coloration disponible dans le commerce et, après détachage, le substrat de la protéine purifiée peut être détectée (supérieure). L'acétylation peut être détectée après le transfert dans une membrane PVDF et un transfert de Western en utilisant un anticorps anti-Ac-K (au milieu). p total roteins peuvent être détectés en utilisant un anticorps anti-Flag (inférieur). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Dans le test in vitro de désacétylation substrat protéique purifié acétylé (alpha-énolase) est mis en incubation avec SIRT2 ou H187Y SIRT2 (désacétylation mutant défectueux) en présence de NAD + (pistes 4 et 5). Diminution du taux acétylés sont détectés par transfert de Western en utilisant un anticorps anti Ac-K en présence d'SIRT2 , mais pas en présence d'SIRT2 H187Y (piste 4 vs 5). Aucune activité de désacétylation est observée lorsque le NAD + ne sont pas inclus dans le mélange réactionnel (piste 2 vs 4) ou lorsque NAM est ajouté au mélange réactionnel (piste 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Dans les cellules in vivo désacétylation test HEK293T stable surexprimant soit SIRT2 ou SIRT2 H187Y ont été co-transfectées avec le substrat de protéine (alpha-énolase) et HATs pour augmenter les niveaux de la protéine acétylés (piste 2 vs 1). Désacétylation a été vérifiée in vivo après immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-Flag à tirer vers le bas le substrat de protéines et western blot en utilisant un anticorps anti Ac-K. Acétylation est significativement diminuée dans les cellules surexprimant SIRT2 par rapport à la SIRT2 H187Y cellules surexprimant (piste 3 vs 4). Désacétylation SIRT2 médiationdu substrat de protéines est inhibée lorsque les cellules sont traitées avec NAM (piste 5 vs 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Réactions 1 2 3 4 ( en option) 5 (facultatif)
protéine-substrat acétylé purifié (10 pg) + + + + +
tampon B + + + + +
SIRT2 purifiée (2 pg) - + + - +
NAD + (1 mu) - - + + +
SIRT2 purifié H187Y (2 pg) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tableau 1: Ingrédients de la réaction.

échantillons surexpression abattre
1 pCDH-puro-GFP-vecteur vide pLKO1 vecteur vide ou si ctr
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag SIRT2 1 ou si le SIRT2 de pLKO1 1
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag SIRT2 2 ou si le SIRT2 de pLKO1 2

Tableau 2: Protéines échantillons.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Le projet décrit ici a été soutenue par une subvention du NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), ainsi que par le Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - La Lefkofsky Family Foundation / Liz et Bourse de recherche Eric Lefkofsky Innovation à AV Nous aimerions à remercier les membres du laboratoire (Carol O'Callaghan et Elizabeth Anne Wayne) pour la lecture critique et l'édition de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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References

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