Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

1Immunology Program, Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore
Published 1/10/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver en enkel och snabb försöksförfarande för generering av primära fibroblaster från öronen och svansar av möss. Förfarandet kräver ingen speciell djurträning och kan användas för generering av fibroblastkulturer från öronen som lagrats vid rumstemperatur under upp till 10 dagar.

Cite this Article

Copy Citation

Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Primärceller härrör direkt från vävnad och tros vara mer representativ för den fysiologiska tillstånd av celler in vivo än etablerade cellinjer. Men primära cellkulturer har oftast en begränsad livslängd och måste ofta återinföras. Fibroblaster är en lättillgänglig källa av galvaniska element. Här diskuterar vi ett enkelt och snabbt experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Protokollet kan användas för att etablera primära fibroblastkulturer från öronen lagrade vid RT under upp till 10 dagar. När protokollet följs noggrant, är osannolika trots användningen av icke-steril vävnad lagras under längre tid i vissa fall föroreningar. Fibroblaster förökar sig snabbt i kultur och kan utökas till betydande antal innan de genomgick replika åldrande.

Introduction

Primära celler härrör från levande vävnad och odlas under in vitro betingelser. Det antas allmänt att primära celler liknar närmare det fysiologiska tillståndet och genetisk bakgrund av den vävnad från vilken de härrör än odödliga eller tumörcellinjer 1. Av den anledningen, galvaniska element utgör en användbar modell för att studera biologiska frågor 2,3. Men till skillnad från etablerade cellinjer som växer på obestämd tid, primära celler genomgå småningom åldrande i kultur och måste ofta återinföras.

Vanligen använda primära celler innefattar fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-celler, benmärgshärledda makrofager (BMDM) och benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC). Fibroblaster är ofta utnyttjas som primär cellkulturmodell. De erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra primära celler. Cellkulturer lätt etablerade, lätt underhållna och kräver ingen purification av celler före odling. De har snabb initial spridning och inga krav på specialiserade medium eller aktiveringsprotokoll. Fibroblaster kan effektivt transfekteras med hjälp av biologiska, kemiska och fysikaliska protokoll 4,5. Det finns en möjlighet att lagra öron för upp till 10 dagar vid RT före upprättandet cellkulturer. Fibroblastkulturer bidrar till visualisering av cytoplasmatiska processer och lämpar sig för omprogrammering i inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) 6.

Fibroblaster är viktiga celler i bindväv som utsöndrar kollagen proteiner och extracellulära matrix 7. De ger den strukturella ramen i många vävnader 8 och spelar en viktig roll vid sårläkning och vävnadsreparation 9,10.

Här beskriver vi en enkel och snabb (<4 h) protokollet för att upprätta fibroblastkulturer från öron och svansar av möss 11. Protokollet kräver minimal muserfarenhet för att skörda vävnader (i motsats till andra protokoll 12,13) ​​och kan användas för att etablera kulturer från öronen lagrade i medium vid RT under upp till 10 dagar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Möss inhystes i patogenfria förhållanden i enlighet med de institutionella riktlinjerna tills eutanasi (Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer vid National University of Singapore och den nationella rådgivande kommittén för försöksdjurs Research (NACLAR) riktlinjer).

1. Möss

  1. Beställa en mus av den lämpliga genetiska bakgrunden. Protokollet är baserat på vävnad härledd från en C57BL / 6-mus.

2. Framställning av Komplett Medium

  1. Bered fullständigt medium genom tillsats av följande komponenter till Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium: 10% fetalt kalvserum (FCS), 50 pM 2-merkaptoetanol, 100 | iM asparagin, 2 mM glutamin, 1% penicillin-streptomycinlösning.

3. Framställning av enzymlösningar

  1. Förbered kollagenas D lösning i en 15 ml konisk botten rör.
    1. Väg 10 mg kollagenas D. Dissolve kollagenas D i 4 ml komplett medium.
  2. Bered pronas lösning i en 1,7 ml mikrocentrifugrör.
    1. Väg 10 mg pronas.
    2. Tillsätt 5 | il 1 M Tris-buffert (pH 8,0). Tillsätt 1 pl av 0,5 M EDTA (pH 8,0).
    3. Fyll på med 494 l sterilt vatten.
    4. Inkubera pronas lösningen vid 37 ° C i ett vattenbad under 30 minuter.

4. Framställning av kollagenas D-pronas Mix (≤2 Tails)

Obs: Utför efterföljande steg i en steril cellkultur huva.

  1. Tillsätt 250 pl av pronas lösningen till 4 ml kollagenas D-lösning.
  2. Passera kollagenas D-pronas blandningen genom ett 0,2 | im sprutfilter in i ett sterilt 15 ml koniskt bottenröret.

5. Utvinning av fibroblaster från Öron och Tail Vävnader

  1. Euthanize möss enligt lämpliga institutionella riktlinjer.
  2. Placera autoklaveras kirurgiska instrument (sax och pincett) i cellkultur huva.
  3. Tillsätt 10 ml fullständigt medium i två 10 cm cellodlingsskålar vardera.
  4. Skär öron (~ 1 cm radie) och 5 cm av svansen (från svansspetsen) av en mus med sax och inkubera under 5 min i 40 ml 70% etanol i ett sterilt 50 ml koniskt bottenröret.
  5. Lufttorka öron och svans genom att placera dem i en öppen 10 cm cellodlingsskål i huven för 5 min. När de väl torkat, överföring öra och svansbitar till två odlingsskålar märkt "öron" och "svans" innehållande 10 ml fullständigt medium såsom beskrivs i steg 5,3.
  6. Ta bort hår från öronen och svansen med sax.
  7. Skär öron och svans i bitar mindre än 3 mm i storlek med hjälp av sax.
  8. Överför skurna vävnaderna i 1,8 ml cryotube flaskor märkta "öron" och "svans" och lägg tillräcklig kollagenas D-pronas lösning för volymen att nå 1,8 ml märket på flaskan.
  9. Pnätkorsen cryotube vialer horisontellt på en skakapparat och skaka proverna vid 200 rpm i 90 minuter vid 37 ° C.
  10. Efter 90 minuters inkubation, ta bort cryotube flaskor från shaker och placera flaskorna i huven.
  11. Tillsätt 10 ml komplett medium i två 10 cm cellodlingsskålar, märkta "öron" och "svans" vardera, och sätta en 70 ìm cell sil i varje maträtt.
  12. Placera de spjälkade öron- och svans vävnader i 70 ìm cell sil i enlighet märkta rätter tillagade i steg 5.11 och kraftfullt slipa vävnaderna med en 10 ml spruta kolv för> 5 min. Skaka cell sil ibland på medellång till tvätta cellerna ut ur cellen silen.
  13. Pipet cellsuspensionen från varje skål i två 15 ml koniska bottenrören märkta "öron" och "svans". Tvätta skålen och sil med ytterligare 10 ml komplett medium och tillsätt mediet till de lämpliga 15 ml koniska bottenrören.
  14. Centrifugera ner cellensuspension 7 min vid ~ 580 x g och 4 ° C med användning av en kyld cellcentrifug.
  15. Avlägsna supernatanten, tillsätt 10 ml komplett medium till cellpelleten i 15 ml konisk botten rör och suspendera cellerna.
  16. Upprepa steg 5.14 och 5.15.

6. Odling av cellblandningen

  1. Avlägsna supernatanten. Se till att cellpelleten förblir ostört.
  2. Återsuspendera cellerna i 10 ml komplett medium och tillsätt respektive blandning till två 10 cm cellodlingsskålar märkta "öron" och "svans".
  3. Lägg 10 pl amfotericin B-lösning (stamlösning: 250 | ig / ml) till odlingen.
  4. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
  5. På den tredje dagen, byt medium med 10 ml färskt fullständigt medium innehållande 10 | il av amfotericin B för att ta bort skräp (figurerna 1 och 2).

7. Under kultur fibroblaster

  1. When kulturen når ca 70% konfluens (dag 3-4 av kultur) avlägsna mediet och tvätta cellerna med 5 ml steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Ta bort PBS och tillsätt 2 ml sterilt 1x trypsin-EDTA-lösning till cellerna.
  3. Inkubera cellerna i 5 minuter vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
  4. Efter 5 minuter, knacka försiktigt kulturen skålen och tillsätt 6 ml komplett medium till cellerna.
  5. Överför cellsuspensionen till en 15 ml koniskt bottenröret och snurra röret i 5 minuter vid ~ 450 x g och 4 ° C med användning av en kyld cellcentrifug.
  6. Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellpelleten i 5 ml komplett medium.
  7. Seed 2 x 10 5 celler i en 10 cm cellodlingsskål och inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator under 3-4 dagar innan upprepa stegen 7,1 till 7,6.

8. Beredning av Ears för sändning

Obs: Utför than efterföljande steg i en steril cellkultur huva.

  1. Euthanize möss enligt lämpliga institutionella riktlinjer.
  2. Placera autoklaveras sax och pincett i cellkultur huva.
  3. Tillsätt 50 ml fullständigt medium i en 50 ml konisk botten rör.
  4. Skär öron (~ 1 cm radie) av en mus med en sax.
  5. Överför öronen in i 50 ml koniska bottenröret (såsom framställd i steg 3) med hjälp av pincett.
  6. Täta 50 ml koniska botten rör med parafilm före leverans vid RT i en lämplig ruta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Extraktion av fibroblaster från vävnadsresulterar i en signifikant mängd av vävnadsrester (Figur 1). I motsats till vävnadsrester, fibroblaster följa vävnadsodlingsplastytor mellan dag 1 och 3 av odling. Mediet av fibroblastkulturer säkert kan ändras på dag 3 av odling, vilket avsevärt bör minska nivåerna av skräp närvarande i odlings (figur 2). Fibroblaster visar en långsträckt morfologi och en tydlig cytoplasma (figur 1 och 2). Mitotiska celler bör vara närvarande från dag 3 av kultur och framåt och celler bör nå 70-80% av cell confluency inom 3-4 dagars odling. Utbytet från örat och svans vävnader i en 10 cm odlingsskål varierar från 4 till 5 x 10 5 (öron) och 5 till 6 x 10 5 celler (svans) på dag 3 av kultur. Efter den tredje dagen av fibroblaster isolering, kan cellerna passe och ympades vid 2 x 10 5 celler per 10 cm odlingsskål.

Extraktion av fibroblaster från öron lagrade vid RT under 10 dagar bör resultera i 70-80% cellsammanflytning inom 5 till 6 dagars odling (fig 3). Sådd cellerna vid 2 x 10 5 celler per 10 cm odlingsskål efter dag 5 bör också ge upphov till ungefär 1 x 10 6 celler inom 3-4 dagars odling. Långtidslagring påverkar inte den tid det tar för fibroblaster att ange senescens i vår erfarenhet (data ej visade).

För att kontrollera identiteten hos cellerna efter 3 dagars odling, kan celler märkas för fibroblaster markerings vimentin 14. Med hjälp av ovanstående protokoll, vi rutinmässigt erhålla rena fibroblastkulturer som indikeras av vimentin färgning (Figur 4).

Figur 1
Figur 1. Fibroblast kultur på dag 3 efter extraktion före förändring av medium.Representativa ljusa fält bilder av cellrester (vita pilar) som finns på dag tre av kultur. Bilder fångades 100 gångers förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop. Skalan stapel representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Fibroblast kultur på dag 3 efter extraktion efter tillägg av nya mediet. Representativa ljusa fält bilder av fibroblaster på dag 3 i odling. Bilder fångades på 100 × och 320 gångers förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop. Skalan stapel representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3. Fibroblast kulturen på dag 3 post extraktion från öronvävnader förvarade vid RT under 10 dagar. Representativa ljusa fält bilder av fibroblaster vid dag 3 i odling. Bilder fångades på 100 × och 320 gångers förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop. Skalan stapel representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Märkning av fibroblastkulturer för vimentin. Representant konfokala bild av öron- och svans fibroblaster på dag tre av kultur. Fibroblaster extraherade från vävnaderna märktes under vimentin (röd) och DAPI (blå). De fluorescerande bilder förvärvades av konfokala microskopiera. Skalan stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här ger vi en enkel, billig och snabb experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Extraktionen bör resultera i vidhäftande och snabbt delande fibroblaster inom 3 dagar efter isolering av vävnaden. En viktig begränsning av galvaniska element är åldrande, en permanent tillväxtstopp 15. Med hjälp av protokollet, kan fibroblastkulturer passerats i 5 till 6 gånger innan fibroblaster blir åldrande, vilket indikeras av en flackare celler, öka i storlek (2-3 gånger ökning) och underlåtenhet att expandera.

När du utför isolering av fibroblaster, måste hänsyn tas under avbrottet av vävnader, som otillräcklig skärning eller matsmältningen resulterar i låg återhämtning av fibroblaster. Det är möjligt att slå samman öron- och svans fibroblaster att öka antalet fibroblaster. Ytterligare vävnad inklusive peritonealdialys och lungvävnad behandlas på samma sätt kan tillsättas för att öka tHan antal fibroblaster. Även skräp förekommer i kulturen efter fibroblaster utvinning, rekommenderas att ändra mediet endast efter den tredje dagen som fibroblaster tar tid att följa cellodlingsskålar.

En potentiell begränsning av protokollet är användningen av icke-sterila vävnader och tillhörande risken för mikrobiell kontaminering. För att minska risken för kontaminering, är öron och svans inkuberades i 70% etanol före skörd av fibroblaster. Vidare är den svampdödande amfotericin B tillsättes till den primära kulturen för att förhindra utväxt av jäst och svamp, ett vanligt problem vid faststäl fibroblastkulturer. Mediet innehåller även penicillin och streptomycin för att förhindra bakteriell kontamination. Med hjälp av dessa försiktighetsåtgärder, är föroreningar sällan observeras även vid fastställandet fibroblaster från öron och svansar som hölls vid RT under flera dagar.

En av de viktigaste fördelarna med detta protokoll är abilhet att generera fibroblaster från öron som förvarades i medium vid RT i upp till 10 dagar innan fibroblaster isolering. Vi observerade en måttligt minskad effektivitet i upprättandet öra fibroblaster kultur efter 10 dagars lagring (70-80% konfluens nås inom 5-6 dagar jämfört med 3-4 dagar för nyligen isolerade vävnad). Därför kan öron hos möss bytas av forskare som använder standard sjöfart, trots uttryck transporten rekommenderas. I vår erfarenhet, användarvänlighet få öron och det faktum att vävnaden sällan används för försök förfaranden ofta ger tillgång till vävnad av genetiskt modifierade möss som kan vara tidskrävande att få något annat. För svansar effektivitet återhämtar fibroblaster efter lagring kan variera kraftigt och svansar ska endast användas om öronen är inte tillgängliga för leverans. Slutligen bör de flesta människor att kunna utföra protokollet, eftersom skörden av vävnad kräver minimal kompetens och utbildning i hantering av möss.

Protokollet har endast testats med musvävnad, men bör i princip göra det möjligt för generering av fibroblastkulturer använder vävnad av andra arter även protokollet kan behöva ytterligare optimering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3, (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15, (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9, (1), 115 (2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91, (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22, (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211, (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127, (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11, (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103, (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24, (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60, (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60, (5), 1393-1398 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats