HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

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Neuroscience

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

인간 면역 결핍 바이러스 1 (HIV-1) 바이러스 감염의 급성 단계에서 뇌를 침범하고, 생산적으로 자신의 활성화로 이어지는, 미세 아교 세포 및 뇌 상주 식세포 모두 감염 - 두 호스트 유래 염증 매개과 가용성 HIV-1 출시 이러한 문신과 (1,2 검토) gp120의 같은 virotoxins. 그 결과, 만성 신경 염증성 상태는 HIV-1 관련 신경인지 장애 (HAND) 3-5의 발병에 기여하는 것으로 생각된다 CNS에서 설립된다.

HIV-1 문신 또는 마우스의 중추 신경계 내에서 인터루킨 (IL) -17A의 만성 과발현은 미세 혈관 진공 6,7 발생하는 것으로 나타났다. 이것은 만성 신경 염증은 뇌 혈관계에 영향을 HAND의 병인에 기여할 수있는 가능성을 제기한다. 또한이 문제를 조사하기 위해, 우리는 뇌 혈관의 struc을 정량화하는 방법을 개발했다투 레스.

이 논문은, 세그먼트 길이, 총 세그먼트 길이를 의미 모세관 직경 및 얇은 스컬 피질 창을 통해 모세관 네트워크의 생체 내 이미징에 사용한 총 모세관 체적 평균 모세관 노드 모세관 세그먼트 수를 정량하는 방법을 설명한다 (전술로부터 개질 프로토콜) -8,9-뿐만 아니라 이광자 현미경을 사용하여 뇌 부분의 생체 촬상. 생체 얇은 스컬 피질 창이 대뇌 환경의 보존을 가능하게 때문에 뇌 조각 모세관 네트워크의 생체 촬상의 재구성을 가능하게하면서,이 결합 방법은, 뇌 혈관 파라미터 론적 정량 제공 입체 완료 모세관 네트워크 - 후 상용 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다.

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Protocol

동물 자원에 로체스터 대학위원회의 대학은이 논문에서 수행되는 모든 절차를 승인했다.

1. 수술 전 준비 (쥐)

  1. 필요한 모든 장비와 수술 영역을 준비합니다. 미리 70 % 에탄올을 사용하여 절차를 수행하는 동안 사용되는 모든 도구를 살균. 선택적으로, 유리 구슬 살균기를 사용하거나 도구를 소독하기 위해 압력솥.
  2. 이소 플루 란 기화기에 연결 이소 플루 란 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 1 L / min의 속도로 4 %에 이소 플루 란 수준을 설정합니다.
    주 : 성상 세포 특이 신경교 섬유 성 단백질 (GFAP) 프로모터 (HIV 두드리는의 Tg 생쥐)에 의해 구동 독시사이클린 (DOX) 유도 성 HIV-1 타트 트랜스와 여기에보고 된 실험 쥐 10 HIV의 효과를 조사하기 위해 사용 하였다 이전에 7,10 설명 된대로 -1, 뇌 혈관 구조에 신경 염증을 유도.
  3. 부드럽게 및 마우스를 관찰 유도 챔버 팁# 39;의 복원 정 반사. 복원력 반사가 억제되면, 2 % 이소 플루 레벨을 설정하고 수술 벤치 노즈콘을 유도 챔버로부터 공기 흐름을 재.
  4. 빨리 물을 주입 가열 패드로 유도 챔버에서 마우스를 이동합니다. 코 콘을 통해 이소 플루 란 (1.5 %)을 계속 적용. 호흡 수 (RR) 모니터링을 통해 평가 개별 마우스 허용 오차에 따라 마취를 조정합니다.
    주 : RR의 우울증은 뇌 혈류 및 혈관 직경의 평가를 변경하는 가스 생리적 파라미터를 교란 할 수있다. 분당 55-65 숨 사이 RR을 유지하기 위해 시도합니다. 심장 박동수 (HR)도 마취 깊이를 평가할 수있다; 혈관 직경에 대한 생리 학적 변화를 방지하기 위해 분당 300-450 박동 사이에 인사를 유지한다. 일반적으로 마취는 주어진 마우스 1 L / 분에서 1.5-2.0 %의 이소 플루 란 사이에 충분한 것입니다.
  5. 또한 마취의 깊이를 확인하는 발가락 핀치를 수행합니다. 마우스는, 통신을 응답하지 않으면수술을 줬어.

얇은 두개골 두개골 창 2. 준비

  1. 마우스의 눈에 인공 눈물 젤을 적용합니다. 완전히 가위 전기 면도기를 사용하여 마우스의 두피에서 머리카락을 제거합니다.
  2. 포비돈 요오드 용액을 도포하여 두피 살균; 건조 할 수 있습니다. 그 후, 광학 현미경 하에서 완전히 두정골 마킹, 꼬리 정면 뼈 및 브레 그마 노출 마우스의 두피로부터 피부를 제거한다.
  3. 쉬운 제거를위한 멤브레인을 건조시키기 위해 두개골에 10 % 염화 제이철 용액의 소량을 적용한다. 부드럽게 두개골을 긁어 # 45분의 5 집게로 건조 된 세포막을 제거합니다.
  4. headplate 창 주위에 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 부드럽게 윈도우의 중심에있는 관심 영역을 유지하는 마우스의 두개골에 대하여 headplate를 누른다. 접착제를 중합 headplate에 치과 용 시멘트의 드롭을 적용합니다.
  5. 얇은 층을 적용headplate 윈도우의 가장자리를 따라 접착제의 식염수를 개최하여 저수지를 만들 수 있습니다. 접착제가 건조되면, 마우스 headplate 하네스에 headplate 나사.
    참고 :이 절차에 사용되는 마우스 headplate 하네스는 금속베이스와 2 개의 금속 열이있는 구조입니다. 각 열에서 하나의 봄과 하나의 날개 너트가있다. headplate는 스프링의 위쪽에 배치되고, 헤드 레벨이며 움직이지 않을 때까지 날개 너트가 체결된다.
  6. 6,000 rpm으로 설정 microtorque 드릴에 부착 된 드릴 비트를 사용하여 headplate 창에서 어떤 접착제를 제거합니다. 선박의 구조가 손상 될 수 있습니다 마우스 두개골의 과열을 방지하기 위해 모든 10 ~ 15 초를 중지합니다.
    1. 새로운 드릴 비트를 사용하여, 중간 선 (headplate 윈도우의 지름의 3 분의 1)에서 측면 microtorque 드릴 1.5 mm를 놓습니다. 4,000 rpm에서 얇은에이 위치 주변의 두개골을 시작합니다. 직접적인 하락 압력으로 두개골을 부드럽게 드릴을 이동합니다.
    2. 중지의 DRIL링 모든 10 ~ 15 초 마우스 두개골의 과열을 방지합니다. 이 시간 동안 압축 공기 용기를 사용하여 축적 된 두개골 먼지를 제거합니다.
    3. 5 ~ 10 초 동안 두개의 온도를 실온 식염수 방울을 사용합니다. 부드럽게 두개골의 숱을 계속 부드러운 티슈로 모든 유체를 제거합니다.
  7. 두개골의 최종 박형화를 들어, 저장소 내에 headplate 식염수 소량을 넣고 가볍게 작은 혈관을 명확하게 보일 때까지 관심 영역 위에 치과 microblade 스윕.

생리 학적 매개 변수 3. 모니터링

  1. 두개골이 완전히 희석되면, 홀더에서 마우스를 분리하고 다시에 놓습니다. 부드럽게 명확하게 내측 허벅지를 노출 모두 뒷다리를 테이프.
  2. 가위 전기 면도기와 모두 중간 허벅지 위에 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드와 허벅지를 커버하여 수술 부위를 소독.
  3. 대퇴 정맥 위의 중간 오른쪽 허벅지에 피부를 꼬집어및 동맥 # 5 집게를 사용. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
    참고 : 왼쪽 허벅지가 수술 합병증 (혈관 기형, 파열 된 선박)의 경우에 예약되어 있습니다.
  4. 수술 부위에 0.9 %의 식염수를 약 3 ~ 5 방울을 적용합니다. 이것은 혈관의 큰 확대율뿐 아니라 혈관의 수분 사이트를 유지하고 건조 방지 가능하다. 퉁명스럽게 두 #에게 45분의 5 집게를 사용하여 대퇴 신경 혈관 다발로 해부에 의해 동맥에서 대퇴 정맥을 분리합니다.
  5. 약 1cm 간격 대퇴 동맥 아래 수술 봉합의 두 3cm 조각을 놓습니다. 카테터 삽입시 과도한 혈액 손실을 방지하는 데 도움이됩니다 혈관 지혈대를 만들 수있는 상부 봉합 시계 방향으로 돌립니다.
  6. 봄 가위를 사용하여 대퇴 동맥에 작은 절개를합니다. 카테터는 동맥 내에서 안전하게 될 때까지 절개 사전을 통해 동맥에 카테터를 놓습니다.
  7. 혈액 응고를 방지하기 위해 카테터를 통해 헤파린 10 μL (100 IU / ㎖)을 주입한다. 그런 다음, 수술 간단한 중단 패턴에서 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질로 오른쪽 허벅지를 닫습니다.
  8. 복강 오른쪽 하복부에 우레탄을 50 μL (1.2 밀리그램 / g)을 주입한다. 5 분 후 복강 우레탄 100 ㎕의 총 왼쪽 하단 사분면에 다른 50 μL 주입으로 반복합니다. 병용 마취의 깊이을 위해 마우스를 다시 검사하는 동안 천천히 약 0.25 %로 이소 플루 란 수준을 줄일 수 있습니다.
    참고 :이 장을 관통하지 않도록 후방 복부 벽을 따라 복강 내 표면 바늘을 유지합니다. 이것은 복부 직근 (μ)를 협지함으로써 달성 될 수있다멀리 내장에서 다음 주입 scles.
  9. 모세관을 사용하여 카테터의 동맥 혈액 40 μL 샘플을 수집한다. 염수로 채워진 네 방향 스톱 콕과 헤파린 채워진 주사기 장착 혈압 변환기에 카테터를 연결.
  10. 카테터의 의도하지 않은 제거를 방지하기 위해 수술 장치 혈압 변환기를 테이프. 평균 동맥압의 모니터링을 시작합니다.
  11. 혈액 가스 분석기 입력 포트에 혈액 채워진 모세관 튜브를 삽입합니다. 모든 혈액이 추출되면, 진입 포트로부터 모세관을 제거한다. O 2, CO 2 혈액 가스 농도는 혈액 가스 분석 장치에서 인쇄 용지에 나타날 것이다.

형광 염료 4. 주입

  1. # 5 집게를 사용하여 중간 왼쪽 허벅지에 피부를 꼬집어. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. 덱스 트란 복합 빨간색 발광 로다 민 염료를 준비(70 kDa의) (생리 식염수에 녹인 10 ㎎ / ㎏).
  2. 대퇴가 부착 된 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 vein.Using 찾아 주사기의 130 μL 라인에 영상에 적합한 형광 염료의 이전에 제조 된 솔루션을 그립니다. 주사기에 완전히 염료를 그리기 단단히 주사기 벽을 쓸어 넘겨 모든 기포를 제거합니다.
    1. 벤드 딱딱한 표면 베벨면이 위로에 대해 그것을 누르면 약 30도 각도로 30 G 바늘. 염료와 바늘을 작성하고 100 μL 샘플을 떠나, 초과 액체를 폐기합니다.
  3. 천천히 대퇴 정맥 내로 염료의 100 μL 샘플을 주입한다. 바늘을 제거한 후, 어떤 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 안정적으로 부드럽게 압력을 적용합니다. 염료가 5 분 동안 순환하도록 허용합니다.
    주 : 대안 적으로, 오른쪽 대퇴부 정맥 다른 수술 부위의 생성을 통해 상기 혈액 손실을 방지하기 위해, 형광 염료의 주입 대신에 사용될 수있다. 또한, 만약동물은 수술 부위에서 미친 듯이 출혈이 너무 많은 헤파린이 카테터를 세척하기 위해 주어진 것을 표시 할 수있다. 이 10-15 분 내에 응고가없는 마우스가 여전히 출혈의 경우, 새로운 마우스로 실험을 재시작 고려한다.
  4. 조심스럽게 그 위에 마우스를 뒤집어 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질하여 왼쪽 허벅지를 닫고 마우스 headplate 하네스에 배치합니다.

생체 내 두 광자 이미징 5.

  1. 연속 마취 수준을 유지 확인한 이광자 현미경 수술기구를 이동. headplate 저장조에 0.9 % 식염수의 소량을 배치하고 식염수에 접촉되도록 현미경 대물 저하. 브라이트 감상 목표를 사용하여 관심 영역을 찾습니다
  2. 형광 염료에 적합한 파장에 두 광자 레이저 여기를 설정합니다. 25X O를 사용하여 두 개의 광자 영상화를 시작bjective.
    이 실험에서 우리는 780 nm의 파장에서 흥분했다 적색 발광 로다 민 염료에 접합 된 덱스 트란을 사용합니다. 발광 36분의 607 대역 통과 필터는 염료로부터의 형광을 검출하고, 발광 대역 통과 필터를 20분의 480 동맥자가 형광을 검출하기 위해 사용 된
  3. 보기 화면 베드 모세관을 찾은 두 광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세관 광학 줌 2. 획득 된 이미지를 사용하여이 영역을 확대.
  4. 이미지가 완료되면, 참수 하였다 경추 탈구하여 마우스를 희생.

6. 예 생체 내 두 광자 이미징

  1. 극세 가위를 사용하여, 마우스의 정면 뼈 interparietal 뼈 두피 절개를. 포인터 손가락과 엄지 손가락으로 두개골의 측면에 피부를 보호합니다.
  2. 중간 interparietal 뼈 아래에있는 여분의 미세 가위를 놓고 시상 봉합 따라 두개골을 잘라. 브레 그마 마킹 후 약 3 mm의 두개골을 절단 중지합니다.
    참고 : 뇌를 절단 방지하기 위해 두개골을 절단 할 때 상승 압력을 적용합니다.
  3. # 5 포셉 사용하여 뇌에서 두개골을 분리하고 조심스럽게 뇌의 표면에서 모든 수막을 제거합니다. 남은 수막 실수로 뇌를 가르기 수 있습니다 극도의주의는 이러한 문제를 방지하기 위해주의해야한다. 뇌가 두개골에서 분리 될 때까지 조심스럽게 천천히 앞으로 전진 뇌에서 # 5 집게를 밀어 넣습니다.
    주 : 하향 압력이 뇌 천공 피하기 위하여 사용되어야한다는 것을.
  4. 생쥐의 특정 뇌 절편 도구에서 뇌를 놓습니다. 뇌를 통해 인공 뇌척수액의 방울을 적용하여 뇌를 씻으십시오.
  5. 브레 그마에 브레 그마 0에서 뇌의 2mm 코로나 부분을 제거 -2. 위쪽으로 향하게 0 브레 그마 인공 뇌척수액을 포함하는 오목 유리 슬라이드에 관상 섹션 (섹션의 가장 두개골 부분)을 놓습니다. 조심스럽게 뇌 SL을 커버유리 커버 슬립 얼음.
    참고 :이 혈관 구조를 변형 수 있으므로 한 번 뇌 섹션에 배치 된 유리를 눌러 피하십시오.
  6. 현미경 스테이지를 이동시켜 슬라이드 및 커버 슬립에 0.9 % 식염수의 소량을 배치. 이 식염수와 접촉 할 때까지 현미경 목표를 낮 춥니 다. 시야 목표를 사용하여 뇌의 중간 선을 찾습니다.
  7. 이광자 촬상을 시작하고 다시 25X 대물를 사용 정중선을 찾아. 관상 부분의 피질 표면에서의 종 방향 균열에 대해보고이 작업을 수행. 중간 선에 영상 화면의 오른쪽 가장자리를 놓고 옆으로 세 개의 완전한 프레임 (중간 선에서 약 1.5 mm)를 뷰어 화면을 통해 이동합니다.
    이 실험에서, 촬상 파라미터 단계 5.2 주에 언급 된 것과 동일 하였다 참고.
  8. 모세 혈관이보기 화면에서 거의 볼 수있는 깊이를 찾습니다. 초점 추가 (20)의 평면을 낮 춥니 다μm의 Z는 스택의 탑을 결정한다.
  9. 1 μm의 이미지 두께를 설정합니다. 100 ㎛에 대한보기 화면을 내리고 화소의 1 % 미만이되도록 과포화 걸쳐 레이저 파워를 조정한다.
    참고 : Z - 스택 이미지가 100 연속 500x500x1 μm의 일련의 이미지에서 컴파일됩니다. 보다 정확한 후 처리 계산 될 것이다 Z 스택 크다. 일반적으로 100 ㎛ 이상의 Z - 스택을 수집하기 위해 시도합니다.
  10. 인접 XY 아이콘 다음 XY 반복 아이콘을 누릅니다. Z-스택이 완료되면, 완료 아이콘 시리즈를 눌러 파일을 저장한다.

7. 데이터 처리

  1. ImageJ에 소프트웨어에서 생체 모세관 이미지를 엽니 다. 수동 이광자 소프트웨어로부터 얻어지는 값에 기초하여 거리 비율에 픽셀을 설정한다.
    1. 도구 메뉴에서 * 바로 * 아이콘을 선택합니다. OPPO 한 모세관 벽으로부터 연장되는 선을 그립니다사이트 모세관 벽과 ImageJ에 의해 제공되는 길이를 기록한다.
      명확 모세관 벽의 모서리를 시각화하기 위해 이미지를 확대 할 필요가있을 수 있으므로주의.
    2. 모세관을 따라 다른 위치에서 단계를 반복 7.1.1뿐만 아니라에 대한 이미지에 여러 개의 모세 혈관.
  2. 이러한 아미라으로 분석 소프트웨어에 Z-스택 파일을 엽니 다. 하위 응용 프로그램 도구 모음에서 필라멘트 편집기 아이콘을 선택
    1. 상단 또는 Z-스택의 하단을 약 20 이동할 수있는 뷰어를 시청 두께를 설정합니다.
    2. 추적 아이콘을 선택하고로드 된 이미지 위로 커서를 이동합니다. 도 2c에 설명 된 위치에서 모세 혈관에 배치 노드; 세그먼트는 자동으로 인접한 노드 사이에 나타납니다. 전체 Z - 스택을 통해 모세 혈관을 추적합니다.
      주 : THR 모세관을 추적하기 위해 엔드 포인트와 분기점 사이의 노드를 배치 할 필요가있다Z-스택 oughout.
    3. 이러한 노드를 제거하려면, 중급 제거 아이콘을 클릭합니다.
      참고 :이 제거 선택한 아이콘을 선택하고 선택 단일 아이콘을 사용하여 루프를 선택하고 수동으로 제거해야합니다 잘못된 루프 세그먼트를 만들 수 있습니다. 루프를 추적하는 동안, 같은 지역에 계속 표시하면, 노드가 다른 모세 혈관에 배치했다 가능성이 높습니다.
    4. 추적이 완료되면, 자동적으로 추출 된 파라미터를 포함한 혈관 스프레드 시트를 열 그래프 정보 아이콘을 선택한다. 노드와 세그먼트의 수는 기본보기 화면에서 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

얇은 두개골 대뇌 피질의 창은 대뇌 피질의 모세 혈관의 생체 내 두 광자 이미징 (그림 1)을 허용한다. 이미지에 적합한 지역은 수많은, 별개의 모세 혈관 (그림 1A)를 보여줍니다. 한 시야에서 더 동맥 세포벽 형광도 존재하지 않으며, 11 번째 고조파 발생량 (도 1b)에 의해 유도 된 이러한 콜라겐과 같은 다른 형광 형광 신호가있을 수있다.

뇌 슬라이스의 준비가 완료되면, 약 1.5mm의 정중선이 위치하고 이미징 영역 (도 2a). 100 ㎛ Z-스택 아미라 분석 소프트웨어 (도 2B)에서 분석에 사용되는 입체 화상을 생성한다. 모세관 네트워크는 수동으로 시작 및 모세관의 단부, 또는 임의의 위치에 하나의 모세관 B에서 노드를 배치함으로써 추적된다다른 (그림 2C)에 목장. 이 형태 학적 매개 변수를 자동으로 추출하는 완전 골격 화 이미지 (그림 2D)를 생성한다. 모세관 노드, 세그먼트의 개수는 세그먼트 길이, 총 세그먼트 길이, 및 마우스 뇌 조각의 이광자 생체 외 이미징을 사용하여 추출 될 수 총 모세관 체적 (도 2)를 의미한다.

그림 3은 본 논문에서 제시 한 방법을 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 실험에서, HIV의 신경 염증의 트랜스 제닉 마우스 모델 (10)을 사용 하였다. 문신 virotoxin HIV의 생산은 12 주 독시 싸이클린 풍의 음식으로 문신 + 마우스에서 유도되었다. 대조군은 동일한 음식을 공급 TAT- 한배 새끼 이루어져 있었다. 측정 모세관 파라미터 중 어느 문신 + 및 TAT- 마우스 간에는 유의 한 차이가 없었다. 따라서, 뇌 12 주 '노출 TISHIV-1 문신에 고소 뇌의 미세 혈관의 진공 원인이 부족하다. 대조적으로, 우리의 이전에 게시 된 데이터는 더 뇌 혈관 7의 진공에 문신 결과 만성 CNS 식을 연장 (20주)을 보여준다. 따라서, 여기에 표시된 데이터 (그림 3) 마우스의 중추 신경계 내에서 문신 유도 혈관 재 형성의 반응 속도에 관해서 중요한 새로운 정보를 제공합니다.

그림 1
피질 모세관 직경도 1 취득. (A) 얇은 스컬 피질 윈도우 준비 및 형광 염료 정맥 주입에이어서, 이광자 현미경 영상 대뇌 혈관계에 사용 하였다. 실험에서는, 780 nm에서 흥분 적색 발광 색소 로다 민 접합 된 덱스 트란을 사용하고, 형광 발광 36분의 607 대역 통과 필터를 통해 가시화 하였다. (11)를 통해 표시 유발할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
골격 화 모세관 네트워크도 2 세대. (A) 마우스를 정맥 내 주사 한 형광 염료 및 희생시켰다. 뇌 2mm 관상 섹션은 브레 그마 0 브레 그마 -2 사이 촬영하고, 영상은 정중선 0 브레 그마로부터 약 1.5 mm로 하였다. 에이 C57BL / 6 마​​우스에서 영상 (블랙 박스)에 대한 선택 대뇌 피질의 위치의 대표 이미지가 표시됩니다. 이 지역, SOM우리가 이전에 문신 + 마우스 (12)이 사이트에서 발생할 수있는 뇌 혈액의 조절 곤란을 보여 주었다 때문에 atosensory 피질이 선택되었다. (B) 모세관 네트워크 인 Representational 세 가지 차원 Z 스택 이미지. (C)도이 방법을 수동으로 추적하는 데 사용 혈관 정량화하는 동안 모세 혈관. (D) 골격 화 Z 스택 이미지의 대표 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
문신의 FO virotoxin 후보 HIV에 노출 된 마우스 대 TAT- 마우스의 뇌 혈관 구조의 그림 3. 정량R 12주. 성상 세포 고유의 아교 섬유 성 단백질 (GFAP) 프로모터 (HIV 문신-Tg가 마우스)에 의해 구동되는 독시 싸이클린 (DOX) 유도 HIV-1 문신의 형질 전환 유전자를 가진 쥐에 HIV-1에 의한 신경 염증의 효과를 조사하기 위해 사용되었다 뇌 혈관 구조는 7로서 설명했다. 이 마우스 (문신 +, N = 3) 문신 유도의 만성 (12주) 요법에 노출 된 (DOX의 예., 12 주). TAT- 마우스 (N = 4) (이 마우스는 HIV-1 문신을 표명하지 아니하므로 문신 + 마우스의 비 형질 전환 한배 새끼에 대응하고) 나이 대조군으로 사용 하였다. 문신 + 마우스처럼 TAT- 마우스는 또한 DOX 노출 12 주를 받았다. 사람들은 문신 (TAT-)에 노출되지 않은 대 12주 (TAT +)에 대한 타트에 노출 된 마우스에서, 노드 (A)의 수가 통계적으로 유의 한 차이는, 세그먼트의 수 (B)는, 세그먼트 길이를 의미 없었다 (C), 또는 모세관 전체 길이 (D), 모세관 직경 (대문신 + 마우스, 우리는 6 촬상 영역에서 모세관 (14)을 분석 하였다; TAT- 쥐), 우리는 (4) 화상 영역에서 모세관 7) (E)를 분석하거나, 총 모세관 체적 (F. 데이터가 정상적으로 (샤피로-Wilk 시험에 의해 결정) 배포되지 않은 때문에, 정확한 윌 콕슨 순위 합 시험 (P <0.05이 경우 결정) 통계적 유의성. 계산하는 데 사용되었다 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 기재된 방법은 실험 모델 / 설정 광범위한 뇌 미세 혈관 구조를 분석에 적용 할 수있다. 이 방법의 성공을 위해, 세 가지 중요한 단계를 마스터해야합니다. 첫째, 얇은 두개골 창은 두개골 또는 기본 뇌에 손상을주지해야합니다. 그것은 숱이 중 두개골에 구멍을 내거나, 또는 열 유도 혈관 누설의 원인이 쉽다. 형광 염료의 초점이 비행기로 누출과 모세 혈관을 모호하므로이 영상을 방해 할 수 있습니다. 두개골 자주 얇은 두개골 준비하는 동안 휴식 경우, 가장 가능성이 너무 큰 하향 압력에 의해 발생합니다. 버에 최대한 가깝게 microtorque 드릴을 잡고 두개골에 하향 압력을 감소 더 촉각 제어 할 수 있습니다.

둘째, 동맥 카테터 최대한 빨리 동맥이 절단 된 후 발생한다. 빨리 카테터를 삽입하지 않으면 COMP 것이다 과도한 혈액 손실이 발생할 수 있습니다마우스의 생리 무결성 romise. 카테터를 삽입하는 어려움으로 인해 대퇴 동맥 카테터에 비해 상대적으로 큰 크기로 보통이다. 그것의 직경을 감소시키기 위해 카테터를 늘릴 필요가있다. 또한, # 5 포셉 팁 카테터의 배치를 쉽게하기 동맥 만든 개구를 잡고 확대하기 위해 사용될 수있다.

우레탄 마취가 가능한 한 빨리 투여 될 수 있도록 제, 생체 내 수술 절차의 기간은 최소화되어야한다. 이소 플루 란 마취 따라서 모세관 직경 데이터를 기울일, 대뇌 혈관의 혈관 확장 (13)을 일으킬 수있다.

그것은 아미라 분석 소프트웨어가 자동으로 수동 추적 혈관의 반경을 추출 할 수 있음을 인정해야한다; 생체의 뇌에서 Z 스택 이미지를 분석하기 위해이 기능을 사용하는 경우에는, 값이 부정확하다. 이 AF 때문이다뇌를 제거 터가 뇌 모세 혈관은 더 이상 가압없고, 형태 학적으로 왜곡 될 수 있습니다. 모세 혈관은 정상적인 생리 조건 하에서 가압되기 때문에 생체 내 모세 혈관 직경의 측정은이 문제를 회피.

또한이 방법은 제한되지 않고되는 것에 유의하지 않으면 안된다. 첫째, 중요한 훈련은 생체 내 이미징 준비를 마스터해야합니다. 연구원은 효율적이 기술적으로 어려운 기술 (얇은 두개골 대뇌 피질의 창 및 동맥 카테터)을 수행하는 것을 배워야한다; 어느 기술에 오류가 실험을 손상시키고 데이터를 무효화 할 수있다. 둘째, 생체 Z - 스택의 분석은 시간 집약적이다. 하나의 Z 스택 이미지의 골격 화는 2.5 시간까지 걸릴 수 있습니다. 이 분석은주의 서를 포함 TR 골격 화 공정의 일관성 (있도록 숙련 연구원에 의해 완성되는 것이 또한, 바람직하다혈관의 acing).

일단이 프로토콜의 모든 측면을 수득 데이터 시야 당 단위 부피당 모세관 또는 모세관과 같은 모세관 밀도를 보여 다른 전통적으로 사용되는 방법에 비해 더욱 깊이있는 혈관 파라미터 생리 정확한 정량을 제공 지배된다. 생체 내 이미징 기법을 포함하는 다른 파라미터에 대한 연구를 허용 할뿐만 아니라 길이 연구에서 검사 할 수있다, 적혈구 속도, 세동맥 팽창 및 적혈구 플럭스 7,12, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 용이하게 적응 뇌 미세 혈관 구조에 관한 연구 문제를 연구하기 위해 수정 될 수있다. 이러한 연구는 다른 신경인지 질병에 모세관 형태의 병원성 변화를 정량, 또는 모세 혈관 밀도의 나이와 관련된 변화를 측정 포함 할 수있다. 따라서, 본 논문에서 제시 한 방법은 quantitat을위한 다양하고 강력한 도구입니다뇌 혈관 구조의 필자의 분석.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

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References

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