טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

תאי גזע מושרים ממדגם אדם (hiPSCs) הם טכנולוגיה לפיתוח מהיר של חקר תאי גזע. הם מציעים אלטרנטיבת תאי גזע עובריים (hESC) מחקר עם הרבה פחות 1,2 חסרונות אתיים ומוסריים. למרות שהם אינם זהים epigenetically כדי hESCs 3-5, hiPSCs מציע דרך ייחודית לבנות מודל פנוטיפים התפתחות ומחלות, והם יכולים לנבוע רקמות רלוונטיות למצב המחלה 5-8. שיטות חדשות של hiPSCs יצירת נבדקות ללא הרף כדי לזהות סוגי תאים אופטימלי להתחיל עם, כדרך להכין iPSCs GMP באיכות מתאימה להשתלה, וגם להגדיל את העיתוי ואת היעילות של תהליך תכנות מחדש 6,9-11.

תאי אפיתל דרכי נשימה הם קריטיים בהתפתחות דלקת אלרגית 12, ו האפיתל הוא נהג עיקרי של תגובות אלרגיות שיפוץ דרך נשימה באמצעות אינטראקציה עם immunתאי דואר סטרומה. אפיתל דרכי הנשימה ממלאת תפקיד חיוני מהמוצא וההתמדה של מחלות ריאה כגון אסטמה. עם זאת, תאי אפיתל דרכי נשימה תחתונה קשים להשיג במסגרת רפואית, במיוחד מחולים וילדי ביקורת בריאים. נתונים ממחקרים כמה תומכי ההנחה כי תאי אפיתל מן רירית אף הם פרוקסי תקף ומעשי עבור תאי אפיתל דרכי נשימה נמוכה 13-20, במיוחד כאשר לומדים תגובות מזהמי אוויר אלרגנים. רירית האף מורכבת יותר מ -90% דרך נשימה ריסי בתאי אפיתל דגימה לתאי האפיתל אף אלה (NECs) יכולה להתבצע בקלות אצל ילדים צעירים כמו גיל ארבעה או חמש, כפי שהוא פחות פולשנית מאשר טכניקות דגימת תא / רקמה אחרות והוא קשור לסיכון מינימאלי של תופעות לוואי כגון זיהום 20-23. הוא מציע דרך מהירה ופשוטה לדגום שני ילדים בריאים וחולים ללא ארוכה, מיותר, ולעתים קרובות procedu ברונכוסקופיה הכואבמיל מחייבי הרגעה. מחקרים קודמים מצאו כי תת המחלה קשורה חומרת האסתמה ניתן להבחין הן רירית האף, כמו גם דגימות תאים הסימפונות שנלקחו ילדים אסתמטיים, ביטוי גנים בין שני סוגי רקמות היה דומה כ -90% מהגנים הלא בכל מקום 22 , 24. כמקור iPSCs, NECs להציע יתרונות על פני סוגי תאים אחרים מנוצל לעיתים קרובות. פיברובלסטים משמשים לעתים קרובות דור iPSC, אבל למרות תאים אלה יכולים להיות מתורבתים בקלות מתוך ביופסיה של עור, תהליך זה בדרך כלל דורש הרדמה מקומית, חתך, ותפרים, והיא קשורה עם סיכון מסוים של זיהום. לכן השיג הסכמה מדעת מחולים עבור סוג זה של ביופסיה יכולה להיות קשה 25. חלופה אחת כדי פיברובלסטים היא תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs). עם זאת, זה יכול להיות קשה להשיג דם מספק עבור דור iPSC מחול ילדים. בנוסף, קיימות מגבלות של ap במורד הזרםplications עבור פיברובלסטים iPSCs דם תא נגזר, במיוחד קיבולת הבידול שלהם סוגי תאים מסוימים 5,26. לכן, בהתחשב הנגישות היחסית ואת הסיכון הנמוך של תופעות לוואי בעקבות בגבייתם NECs מהווה מקור תא אידיאלי עבור דור iPSC מאוכלוסיות ילדים.

iPSCs קיבלו הרבה תשומת לב לאחרונה כפלטפורמה ללימוד ההתפתחות האנושית, יצירת מודלים המחלה רומן, כמקור פוטנציאלי של תאים עבור טיפולים אישית. לפני את מלוא הפוטנציאל של הטכנולוגיה הזו יכולה להתממש, את הבסיס המולקולרי של תהליך תכנות מחדש צריך להיות הובהר, אך לעת עתה פרוטוקול זה ואת הנהלים המפורטים בתוך יבהיר את המחקרים התמקדו חשיפות דרכי הנשימה, כמו גם לספק פלטפורמה לומד את ההשפעות של טיפול תרופתי אישי המעורב iPSCs.

העבודה השיתופית של מספר מעבדות הובילה generation של טכניקה מוצלחת לא רק דגימה של רירית האף, אבל גם culturing NECs, ו תכנות מחדש של תאים אלה iPSCs 23. מאמר זה מספק תיאור של פרוטוקול דגימה אופטימלית, culturing, ותנאי תכנות מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הבא אחרי הקווים המנחים של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מוסדות.

1. דגימת האף הרירי

הערה: קבל דגימות נבדקים אשר הינם ללא סימני זיהום ויראלי בדרכי הנשימה.

  1. הכן טרי חרוטי 15 מ"ל לפני הביקור משתתף ולהוסיף 2 מ"ל BEGM (מדיום הגידול תא אפיתל הסימפונות) בתוספת 20 μl סטרילי פן / סטרפטוקוקוס / Fungizone (P / S / F) (0.01%).
  2. מברשת ציטולוגיה להרחיב רק לפני נטילת המדגם, ואל תשכחו לשמור מברשת סטרילית לא נוגע בו לכל משטחים מלבד משטחי האף.
  3. שאל משתתף לשבת בשקט להטות את הראש כלפי מעלה, אל התקרה. יש קטנים או ילדים חסרי מנוחה יותר לשבת על הידיים ו / או בשכיבה כדי למנוע לחבוט המברשת הצדה.
  4. כוון מברשת בחלק האחורי של האף שבו המעבר מצמצם (נראה כמו חור שחור קטן). חלק מברשת למטה ולסובב פרקים כמו המברשת תיוסר nostril.
  5. מניח מברשת חרוטים לצלול BEGM. חותכי מברשת עודפת ולהחליף כובע על צינור. לא מערבולת.
    הערה: אם המשתתף הוא מוכן, להשיג מברשת שנייה באותו אופן אבל בנחיר השני. קבלת רפרוף קל על שני הנחיריים תגרום סבירות גבוהה יותר כי הדגימה תהיה מוצלחת. דגימה באותו הנחיר עלולה לגרום לדימום לא ישפר את המדגם סביר.
  6. שמור דגימות קרובות ל -37 מעלות צלזיוס ככל האפשר במהלך הובלה באמצעות מבחנה עם מים חמים.

2. ספירת תאים ו Cytospin

  1. בעדינות להתסיס את המברשת BEGM ולקחת 10 μl של המדגם עבור ספירת תאים באמצעות hemacytometer. הוסף 10 μl של כתם חי / מת ולספור לחיות תאים רק תחת מיקרוסקופ.
  2. קח 50 μl של המדגם לדלל 200 μl עם 1x PBS. הוסף משפך cytospin המצורף שקופית זכוכית ספין ב 300 סל"ד במשך 2 דקות. בואו להחליק שקופית O / N ו- כתם יבש following להוראות היצרן. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך.
  3. שקופיות כתם עם המה 3 Stain
    1. העבר כל פתרון (מקבע המה, תכלת; המה 3 פתרון אני, ורוד; ו המיתי 3 פתרון שני, כחול עמוק) לתוך צלחת מכתים; שמור מכוסה כשאינו בשימוש. הכנס שקופיות לתוך סירה מכתימה שקופית
    2. טובלים שקופיות ברציפות מקבע במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות פתרון אני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות הפתרון השני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לנקז
    3. לשטוף עם מים ללא יונים עד המים זורמים ברורים. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך
  4. תראה שקף מתחת תאי מיקרוסקופ וספירה, לקבוע אחוז תאי אפיתל. צריך להיות 90% או יותר אם הדגימה היא טובה.

3. תאים מתזמנים

הערה: ביצוע כל הליכי תרבית תאים בתרבות רקמות נכונה מוסמכתמכסה המנוע באמצעות טכניקה סטרילית.

  1. מעיל צלחות עם שור Dermal קולגן (BDC), סוג 1. הוסף 0.5 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל ​​BDC מדולל 49.5 מ"ל 1x PBS. כן פחות אם רק כמה צלחות תשמשנה. מעיל בקבוקון T25 עם 2 מ"ל BDC דגירה O בשכונה סטרילי / N או ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, אם יהיה צורך בכך.
  2. לאחר דגירה, לשאוף כל נוזל נותר. לחשוף צלוחיות לאור UV למשך 30 דקות במנדף סטרילית. צלוחיות חנות עד חודש אחד בכל 4 ° C, אבל להביא אותם RT או 37 ° C לפני זריעת התאים.
  3. שמור מברשת ותאי BEGM על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן זרע. בעדינות מברשת סוויש בתוך חרוטים, אבל לא מערבולת.
    1. פלייט 7 x 10 5 תאים בבקבוק T25. אם יש פחות, להשתמש במיכל קטן, כגון אחד טוב של צלחת 6 באר. צלחת בגודל זה דורש כ 3 x 10 5 תאים.
      הערה: אם אין תאים רבים זה, זה לא מומלץ להמשיך.
  4. מתחת למכסה מנוע סטרילית, לקחת מברשת מתוך צינור gently לסובב מברשת על פני השטח של הבקבוק המצופה, נזהר שלא לשרוט את הציפוי. בטל המברשת במיכל Biohazard המתאים.
  5. לאט פיפטה את התאים הנותרים ב BEGM מתוך החרוטים לתוך בקבוק T25. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. מספר התאים הצפים יקוים וייתכנו כמה פסולת מהאף, אשר מקובל בשלב זה (איור 3 א).

4. תרבית תאים

  1. לאחר זריעת תאים, ולתת להם להתיישב במשך 48 שעות ללא הפרעה (איור 3). לאחר 48 שעות, לאט ובעדינות להוסיף 2 מ"ל חם BEGM ו -20 μl סטרילי פניצילין / סטרפטומיצין / Fungizone (P / S / F).
    הערה: אין לשאוב תקשורת 2 מיליליטר של המקורי.
  2. ביום 4 th לאחר הזריעה, לשאוב את כל הנוזל בזהירות, ולהחליף עם 4 מ"ל טריים, חימם BEGM בתוספת 1x פן / סטרפטוקוקוס (fungizone כבר לא נחוץ). שינוי בתקשורת כל יומיים ולהעריך תאים לצרףment, צמיחה מפגש. כאשר התאים מגיעים ~ 80% המפגש, בדרך כלל בתוך 2-3 שבועות, הם מוכנים להיות passaged.
  3. בקבוק T25 אחת (כ -2.5 x 10 6 תאים כאשר ומחוברות) ניתן passaged לשלוש צלוחיות T25 או בבקבוק T75 אחד. לאחר המעבר הראשון, תאים צריכים להיות חזקים ובריאים, להגיע למפגש על כל שלושה ימים.

5. תאים Passaging

  1. בעדינות לשאוב התקשורת מהצלחת. הוסף 1 מ"ל 0.05% פתרון טריפסין לכל בקבוק T25 לצלחת ומניחים בחממה במשך כ 4min, או עד תאים להתנתק הצלחת. בדוק את רמת הניתוק של תאים כל 2 דקות ואל תשאיר טריפסין על יותר מ 10 דקות.
  2. הוסף 5 מ"ל טריפסין נטרול פתרון (TNS), או מדיה המכילה סרום לנטרל את האנזים. הסר את כל הנוזל ותאי מהבקבוק ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב XG 200 (האצה 0 האטה 0) במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. לשאוב supernaתאי tant ו resuspend BEGM + P / S בהיקף הנדרש הצלוחיות החדשות (4 מיליליטר עבור בקבוק T25, 10 מיליליטר עבור בקבוק T75)
  4. בצעו ספירת תאים עם כתם חי / מת כפי שתואר לעיל (2.1). הוספת הכמות מתאימה של BEGM ותאי כדי הצלוחיות המצופות ולחזור אל האינקובטור. לשמור כמפורט לעיל או cryopreserve מקפיא בינוני (70% BEGM, 20% FBS ו 10% DMSO) בריכוז של 0.5-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.

6. תכנות מחדש כדי iPSCs

הערה: לפני יצירת iPSCs, לפקח על קיום כל התקנות המוסדיות המסדירות את הדור ושימוש iPSCs אדם. טכניקת סטרילית חשובה במיוחד עבור תרבויות iPSC, כמדיום תרבות אינו מכיל אנטיביוטיקה באופן שגרתי. זה קריטי, כי NECs נראה בריא והם שגשוג וחסון לתכנות מחדש מוצלח.

  1. פלייט 5 x 10 5 NECs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 6 היטב. לאחר 24 שעות, להוסיף polybreneכדי BEGM לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו transduce NECs ידי הוספת חלקיקים lentiviral להביע Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc לתקשורת. שואפים להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של ~ 5 27.
    1. כדי קביעת משרד הפנים, להכין דילולים סידוריים של המניות המרוכזות-lentiviral ו transduce HT1080 תאים עם דילולים אלה. לאחר זיהוי הראשון באופן חד משמע ביטוי dTomato בתאי HT1080, לחשב את המספר "יחידות transducing / מיליליטר" כשקלע את מספר תאי dTomato החיובי / גושים קטנים של תאים כל דילול.
      הערה: בדרך כלל, תהיה דילולים כי הן גבוהות מדי (הכל dTomato חיובי) ו נמוך מדי (ללא או רק כמה תאים חיוביים).
    2. בצע ניקוד הדילולים שבו נבדלו תאים חיוביים / גושים קטנים של תאים מזוהים. לקבוע את כייל על ידי תיקון מספר transducing מ"ל / יחידות עם גורם לדילול המתאים. משרד הפנים הוא אזי היחס בין מספרשל transduced תאים למספר חלקיקי הנגיף 27.
      הערה: כל תא dTomato החיובי / גוש קטן מניחה לנבוע חלקיק וירוס אחד.
  2. כ -3 שעות-שלאחר התמר, להסיר תקשורת ולהחליף עם BEGM הטרי. מחק תקשורת lentivirus המכיל באמצעות נהלים שאושרו מוסדי. חזור NECs transduced אל האינקובטור במשך 3 ימים.
  3. ביום 3, להחליף תקשורת עם BEGM הטרי, ולאחר מכן דגירה במשך 3 ימים נוספים. לשאוב בילה התקשורת, לשטוף תאים עם 1x PBS ולהוסיף 1 מ"ל 0.05% פתרון טריפסין אל הבאר. תאי מעבר עם טריפסין כפי שנכתב לעיל (סעיף 5). בזהירות לשאוב תאים supernatant ו resuspend ב 4 מ"ל BEGM + P / S. תאים יכולים להיות passaged כדי באר חדשה של צלחת 6 היטב מצופית BDC, או הוסיפו לתרבויות MEF, אם מוכן (ראו השלב הבא).
  4. כן צלחות מצופות MEF. ביום 4 להוסיף פתרון ג'לטין 0.1% (1 מ"ל / טוב) 2 הבארות של 6 היטב (כדי לבצע +/- Thiazovivin (SPT) ראה שלב 6.6). על הבאיום, להפשיר בקבוקון של MEFs מומת 28.
  5. מניחים MEFs לתוך 10 מ"ל של התקשורת MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). ספין על XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה. גלולה בתקשורת MEF. ג'לטין לשאוב מהצלחת 6 היטב ומוסיפים 1.87 x 10 5 MEFs לכל גם צלחת 6 היטב מצופה ג'לטין. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, או למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
  6. העברת 2 מ"ל של BEGM מכילים transduced תאים לכל גם לתוך 2 בארות צלחת 6 מצופה בעבר היטב דגירה O / N. ביום למחרת, להחליף BEGM עם 2.5 מ"ל לכל טוב של התקשורת תקן hESC המכיל 4 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ"ל. Feed תאים עם התקשורת hESC טרי +/- SPT יומי במשך 10 ימים
    הערה: אפשר להוסיף קוקטייל של מולקולות קטנות (SB431542, PD0325901, ו Thiazovivin (SPT) קוקטייל) כדי לשפר את היעילות ואת קינטיקה של תכנות מחדש עבור NECs 23.
  7. לאחר עשרה ימים, להמשיך להאכיל יומי באמצעות התקשורת hESC ללא SPT. Feed תרבויות יומיים עד מושבות hESC הדמוילהופיע (איור 5 א, המושבה P0). זיהוי מושבות מחסה iPSCs המשוערת על ידי הגרעין הגבוה שלהם: יחס cytoplasmic ו nucleoli הבולט.
  8. מושבות בלו והעברה ידניות עם מורפולוגיה hESC הדמוי להפריד בארות לתרבות והרחבה כקווים נפרדים במערכת מזין חינם. מושבות ניכרות צריכות להסתגל במהירות לתנאים אלה.
    1. לאחר מושבות ציפוי ניכר קווי iPSC המשוערים הדיסקרטיים אלה נחשבים כיום מעבר 1 (P1). תרבויות עדכונים יומיים עם mTeSR1. מעבר ולהרחיב קווי iPSC באמצעות נהלים סטנדרטיים. זה עלול לקחת מספר ימים עד שבוע עבור מושבות p1 להגיע לגודל שבו הם צריכים להיות passaged.

7. שימור iPSCs בתרבות

  1. Feed ולהעריך תרבויות יומיות. ידני באזורי בלו מפגינים בידול גלוי על ידי גירוד עם טפטף זכוכית סטרילית או קצה פיפטה מיקרו. שינוי תקשורת לאחר קטיף יומי.
  2. מעבר תאים לאחר approximately כל ארבעה ימים: בעדינות התקשורת לשאוב, להוסיף 1 מ"ל Dispase חם (1 מ"ג / מ"ל) לכל היטב צלחת 6-היטב (חצי נפח האכלה), ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ -4 דקות. הקצוות של המושבות יתחילו להרים, אשר נראה כמו מתווה לבן ברחבי המושבה. בעדינות לשאוב Dispase ולשטוף 3x עם חימם DMEM / F12.
  3. הוסף 2 מ"ל mTeSR1 ולהשתמש מרים תא להרים את מושבות מהצלחת. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגית או micropipette P1000 כדי triturate התאים בעדינות עד מושבות מחולקות לאשכולות קטנים.
    1. הימנע לייצר אשכולות קטנים מאוד או תאים בודדים, כמו התפשטות הישרדות עוקבת תהיה תת-אופטימלית. כאשר מחדש ציפוי מושבות, 1: 4 ל -1: 6 פיצול ישמור צפיפות מושבה אופטימלית. הוצא בעדינות מושבות תקשורת מהצלחת ולהוסיף חדשות, בארות מצופות matrigel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

החלק הראשוני של האף, שנקרא פרוזדור האף, הוא האזור המוקף סחוס 29. המברשת צריכה ללכת בצורה חלקה בעבר באזור זה של האף, מעבר שסתום האף (ostium internum, או "חור השחור" לראות בחלק האחורי של Nare), ואת המדגם המתקבל חלזוני הנח (איור 1). Turbinates האף הם מבנים גרמיים להגדיל את שטח הפנים של האף 29, מה שהופך אותם במיקום אידיאלי עבור דגימה. האזור הוא מצופה גם על ידי רקמה רירית vascularized, דומות מאוד רפידות של דרך הנשימה הנמוכה והוא גם פעיל את התגובה החיסונית וחשיפה סביבתית.

דגימת הרקמה הנכונה מבטיחה כי התאים לתכנות מחדש הם תאי אפיתל. זה יכול להיות מוערך על ידי ספירת תאי הראשוני cytospin, אלא גם על ידי התבוננות התאים בתרבית. הcytospin, פעם הסתחרר למטה, מיובשים, ומוכתמת, מציגה את האיפור של המדגם. רוב הדגימות מורכבות של תאי אפיתל, אשר הם כמו עמודים ריסי, עם גרעין סיבוב אחד. עם ערכת כתם המה 3, הם כתם צבע כחול בהיר עם גרעין סגול כהה (איור 2), ולעתים קרובות כאשר נלקח ישירות מהאף הם נראים בכבדות יחד. למרות דגימות תאי אף הן בתחילה תערובת של סוגי תאים, כמו גם פסולת מהאף, עם זמן בתרבות עם שינויי תקשורת, לתאי האפיתל להיות (איור 3 א ', ב') שולט. כאשר תאי אפיתל גדלים כדי מפגש, הם בצורת ביצה סדוקה טרי, שבו הגרעין גדול וממוקמים במרכז ואת הציטופלסמה היא מעין "מושיטים" ומותח כמו התא מכין לחלק (איור 3 ב). כאשר התאים גדלים יחד, הם מתחילים לקחת על עצמו יותר של צורת כדורגל, ולהשתלב יחד בנוחות בצלחת (איור3C).

לאחר התאים transduced, יביעו tdTomato סמן ניאון בגרעין. איור 4 מראים את התאים פעם אחת הם כבר transduced, בתחום, קרינה בהירה ועם שני התמונות התמזגו. לא כל תא מבטא את הסמן, ולכן לא כל תא היה transduced, אבל כל אחד גם צריך על יעילות התמר 90 אחוז, וזה יגדיל את הסבירות כי תאים מסוימים ישיגו pluripotency לאחר מצופה על MEFs.

לאחר שיתוף תרבותי עם MEFs וכפי התאים מתחילים ליצור מושבות, הם יפסיקו בהדרגה להביע tdTomato. עם זאת, זה לא האינדיקציה הטובה ביותר של היווצרות מושבה. ההוכחה הטובה ביותר של היווצרות מושבת אישור חזותי. מושבות hESC, אשר הן "תקן הזהב" של pluripotency, הן בעיקר עגולות מורכבות של תאים קטנים, עגולים רבים עם largגרעיני דואר ואת גרעין גבוה יחס הציטופלסמה. כל תא מופיע מורכב ברובו של הגרעינים, האברונים אחרים אינם גלויים לעין. בעקבות קציר מושבת iPSC, ותרבות בתנאים מזינים ללא תקן, שהוקמו זה עתה מושבות iPSC צריכות להיראות כמו עמיתיהם hESC שלהם, ואת התאים הבודדים הם כמעט זהים לזה של פנוטיפ hESC, כפי שניתן לראות באיור 5 ב.

לפני iPSCs ניצול המופקים מתאי אפיתל האף (NEC-iPSCs) בניסויים, מומלץ להעריך את איכות קווים חדשים. זה בדרך כלל כרוך בהערכת קריוטיפ, ביטוי של סמנים pluripotency, והיכולת של iPSCs להתמיין כל אחד 3 שכבות נבט עובריים (האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם). קיבולת בידול ניתן לבדוק בדרכים רבות, אבל כרגע, assay המחמיר ביותר הוא assay התפלצת הרוחני 2,23,30. עוד מבחנים מקיפים כגון תעתיק ו פרופיל epigenomic מועיל כדי לקבוע אם כל פגמים בכרומוזומים מוצגים על ידי תכנות מחדש 23.

איור 1
איור 1. נחות חלזוני. תנועת דגימה ויעד דגימת חלזוני הנח, הוא הצביע על ידי חץ שחור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Cytospin. רוב המדגם מורכב של תאי אפיתל, אשר ארוכים עמודים, עם ריסים בקצה אחד גרעין עגול בקצה השני. לעתים קרובות הם בכבדות יחד כאשר שנדגמו ישירות n האם. חצים מצביעים על תאי אפיתל בודדים."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. לתאי האפיתל אף יסודיים בתרבות. (א) תאים צפים ופסולת רק לאחר המדגם נאסף ו מצופה. (ב) תאים יום אחד לאחר passaged. Cell מורפולוגיה היא עקבית התרבות מורכב בעיקר של תאי אפיתל האף, הגדלה 10X, ו (ג) 5X ההגדלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
התמר איור 4. NECs. תאים להיות transduced לקח את הווקטור ולהראות tdTomato סמן פלואורסצנטי האדום. סמן זה אמור לדעוך כפי שהם ההתקדמות לעבר מדינת פלוריפוטנטיים. (א) תמונה בשדה בהירה של תאי transduced. (ב) תמונה פלורסנט של תאים transduced. (ג) כיסוי של שדה בהיר ותמונות ניאון (לוחות A ו- B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. iPSC גזע מושבות דמויי תאים. (א) גידול על MEFs, המושבה הוא בעיקר סביב בקצוות ומראה לא מעט על מנת בידול. (ב) בתאים בודדים להראות מורפולוגיה hESC הדמוי טיפוסית, עם תאים עגולים קטנים עם גרעינים גדולים.5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאי אפיתל האף (NECs) מהווים פלטפורמה נגישה ללימוד מחלות דרכי הנשימה, ו- NEC-iPSCs להציע דרך מרגשת לחקור את התפתחות המחלה, טיפול ותרפיה 1,31,32. NECs ניתן להשיג בקלות ללא 6,23 נהלים מלחיצים או מזיקים. מניסיוננו, הדגימה של רירית האף כמתואר בפרוטוקול זה נראה פחות מלחיץ נתפס טוב יותר מאשר איסוף דם לילדים. לכן, שיטה זו עשויה להיות שימושית במיוחד באוכלוסיות מטופלים ילדים ורלוונטי לומד מחלות דרכי הנשימה. היתרון השני של NECs הוא שברגע שהם בתרבות, תאי אפיתל נבחרים עם תקשורת מצב התרבות ולהיות הומוגנית. זהו יתרון מאשר באמצעות רקמות מורכבות כגון תאי דם ומקלה על מנת להעריך את ההשפעה של המוצא תא וכתוצאה קווי iPSC תוך שימוש בגישות transcriptomic ו אפיגנטיים.

מתיהדגימה של רירית האף, חשוב כי השטח הנכון של האף ידגם כך לתאי האפיתל בעיקר מאוחזרות, כפי שמעיד הצגת cytospin תחת מיקרוסקופ (איור 2). דגימה נכונה תניב ≥90% לתאי האפיתל. זה קריטי כדי להשיג דגימות מחולים בריאים, ועל מנת להבטיח כי המדגם נאסף כראוי על מנת למקסם את המספר הסלולרי מתקבל מצופה. הצעת הפיתול כמתוארת בפרוטוקול (הסעיף 1.5) מבטיחה כי המברשת באה במגע עם כמה שיותר משטח האף ככל האפשר. זהו רפלקס טבעי לסובב את הראש של אחד כשחפץ זר הוא לכיוון פניו של אחד. לכן, במקרה שילד הפונה שלו או את ראשה או מתרחק, זה הכרחי כי מתבצעת דגימה מהירה ומדויק. שימוש בשיטות אלה יגביר את היעילות של כל צעד השני של הפרוטוקול, ולקבוע את הסבירות של תכנות מחדש מוצלח. מבוקש הילדלשכב, ואף להצמיד את כפות ידיהם תחתם או יש הורה או אח להחזיק את ידיהם היא דרך טובה כדי לעודד אותם לשכב בשקט כדי לעזור להבטיח את אוסף מדגם חלק וללא כאבים.

לאחרונה, כמה טכניקות דיגום אחרות הוערכו עבור מרגוע, ותוצאות לדוגמה, שמבוססות על תוכן התא והרכב וכן רנ"א ודנ"א מניב 33. קבוצת ביקורת דגימה עם מברשת ציטולוגיה לעומת ספוגית פוליאסטר, והם שנדגמו הוא חלזוני הנחה כמו גם nares הקדמי על ידי מתערבל נמרצות את המברשת או ספוגי ברחבי nares. דגימה של חלזוני הנח עם מברשת נמצאה מעט לא נוח, למרות שזה עשה להניב תשואות RNA הטובות ביותר וכלל לתאי האפיתל ריסי ביותר, לעומת ספוגית פוליאסטר. השיטה המוצעת בפרוטוקול זה מאומת ולכן כשיטה הכי האמינה של דגימת האפיטל אף כדרך ללמוד דרכי נשימת נשימההאפיתל.

לאחר המדגם מתקבל, הוא חייב להיות כל הזמן על 37 מעלות צלזיוס. אחת הדרכים היעילות ביותר הוא לחמם כוס מים גדולים מ -37 מעלות צלזיוס ונסטלה אותו לתוך מיכל קלקר להובלה בטוחה בעת ההכנה לפגוש את המשתתף. רגע לפני המדגם נאסף, להוסיף מים קרים כך שהטמפרטורה מובאת על 37 מעלות צלזיוס, ומוסיף את צינור החרוטים עם התקשורת. כאשר המברשת מתווספת צינור החרוטים, להחזיר את הצינור מייד באמבט המים ולשמור אותו שם עד שהוא ניתן חזר למעבדה, ובנקודת הצינור צריך לשים באמבט מים C מוסדר 37 ° עד תאים זורע על בקבוק תרבות. בכל הנקודות, טכניקה סטרילית אמורה לשמש כדי למנוע החדרת סוכנים זרים לתוך התרבות.

כמות ניכרת של השתנות בין הדגימות נתפסה כאשר תאים הועלו בתרבות. השתנות זו נראית נובעת היא המקור התורם וכןאיכות המדגם עצמו. אחת הדרכים להגדיל איכות המדגם היא להשיג מברשת אחת בכל נחיר, או שתי מברשות למשתתף. לאחר זריעת המדגם הטרי, וכפי התאים passaged, מצבם של התאים צריך להיות במעקב קבוע כדי להיות בטוח שהם לנכון לתכנת מחדש. התאים שמרכיבים את המועמדים הטובים ביותר עבור הם אלה שלוקחים לתרבות מתרבים במהירות. זה לא ידוע מדוע תאי מתורמים מסוימים הם חזקים יותר מאלו של תאים אחרים, אבל זה יכול להיות בגלל גורמים כמו גיל, גודל האף, ובריאות של התורם בעת הדגימה. כאשר תשואות מדגמים מעט מאוד תאים, או רק מספר קטן של תאים לצרף מצופות פעם, המדגם אינו צפוי לגדול ל מפגש. אם תרבות נאבק עושה מגיעים למפגש, התאים נוטים להיות חלשים ורבים תאים מתים במהלך passaging. סוג של דגימה זו הוא מועמד עני מאוד לתכנות מחדש, כפי שהוא חיוני כי התאים להיות מתרבים במהירות וחסונה, וכי הםtransduced על מספר המעבר המוקדם ביותר האפשרי. זה לא רצוי transfect תאים גדלים לאט, אם זה נובע משונה תורם, דגימה עניה, או תרבויות passaging רזה מדי. אם תכנות מחדש הוא ניסה עם תרבית תאים עניים, אין זה סביר להמשיך אל הפועל.

הכנת התאים עבור תמרה היא חלק אחד של הפרוטוקול זה הכי קשה להתכונן. בהתבסס על הצמיחה של התאים, 2 x 10 5 5 x 10 5 תאים הם הציעו עבור תמרה וזה עשוי תלויים דגימות חולה ספציפיות. לכן זה עשוי לדרוש כמה בארות מצופות עם מספרים שונים תא כדי לקבל את המספר האידיאלי.

פרוטוקול זה מתאר לא רק את הקלות של דגימה, אלא גם קלות היחסית ובלוחות זמנים של הקמה בתרביות תאים ראשוניות, ועל תכנות מחדש הבא של אלה בתרביות תאים עיקריות קווי iPSC הזדמנויות מחקר קיימא יותר תכליתיות. כלתהליך מהמרפאה כדי הקמת iPSCs דיסקרטית בתרבות לוקח בערך 3 חודשים, ושיטות חדשות עבור קיצור זמני תכנות מחדש מפותחים 6,34,35. שדה זה מתפתח במהירות כדי למצוא דרכים יעילות ומלאות יותר להמיר תאים ראשוניים כדי iPSCs, ובהמשך להבדיל iPSCs לתוך תאים מסוגים והרקמות ספציפיים של עניין. עם זאת, פרוטוקולי בידול עבור רקמות חשובות למחלות דרך נשימה, כגון האפיתל הריאות, עדיין נמצאים הסתדרו 36-38.

יצירת iPSCs מ NECs יש את היתרון של בידוד פשוט יחסית ללא כאבים של תאים. יתר על כן, יתכן כי NEC-iPSCs להציע יתרונות על פני iPSCs נגזר סוגי רקמות אחרים שיכול להיות מנוצל. ההשפעה של אפיגנטיקה iPSC על בידול עוקבות iPSC אינה מובנת לחלוטין, למרות הראיות עולה כי iPSCs אדם לעכבר הנמל זיכרון תעתיק ו אפיגנטיים של תא סומטי שלהםמוצא ושזה סלקטיבי טוב הבידול שלהם לתוך השושלות שויך לסוג התא תורם תוך הגבלת 5,26 גורלות אחרים. בשל החשיבות של רקמת מוצא, וכיצד הם משפיעים על תכונות הפעילות של iPSCs, במיוחד ביחס השמירה של סימני אפיגנטיים רקמות ספציפיות 39-45, קווי iPSC צריכים להיחקר בצורה ברורה יותר כדי להיטיב להבין את ההשפעה של רקמת המוצא. הוכח בעבר כי iPSCs נגזרת NEC נמל חתימת מתילציה גנומית המציין שימור של זיכרון אפיגנטיים של רקמות מוצאם 23. כזה זיכרון אפיגנטיים נשמר NEC-iPSCs עשויה להועיל התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי דרכי הנשימה, כמו מחקרים קודמים הראו כי תאי דם iPSCs נגזר מפגין זיכרון אפיגנטיים של תאי דם ממוצא הם מובחנים בקלות רבה יותר לתוך תאי דם מאשר פיברובלסטים או iPSCs החלקה נגזרות שריר חסרת blooד תא ספציפי 5,26 זיכרון אפיגנטיים. לאור הפוטנציאל העצום של תאים בדרכי הנשימה הנגזרות iPSC למחלות ריאה דוגמנות, זה יהיה חשוב לחקור האם NECs מייצגים סוג תא האופטימלי עבור בידול של iPSCs לתוך / רקמות תאים בדרכי הנשימה. בנוסף, זיכרון ביציבות התמיד בתפקיד עשוי לייצג הכרומוזומים את מיקום עמיד לשינוי תכנות ומועמדי מצבי מחלה של תאי תורם. כמו פרוטוקולים להמיר iPSCs כדי הפרוקסימלי סוגי תאי ריאות דיסטלי מפותחים 36-38, אלה NEC-iPSCs עשוי להיות יתרון במחלות דרך נשימת דוגמנות כגון אסטמה, COPD, סיסטיק פיברוזיס, ורבים אחרים בלימוד השפעות סביבתיות על התפתחות ריאות הומאוסטזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות במתקן לתאי גזע פלוריפוטנטיים ואת Core הדמיה Confocal בבית החולים סינסינטי ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ו 2U19AI70235 (GKKH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29, (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28, (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7, (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10, (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322, (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26, (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8, (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6, (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91, (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5, (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30, (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127, (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129, (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41, (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135, (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115, (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7, (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29, (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34, (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13, (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122, (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2, (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8, (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30, (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4, (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20, (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5, (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9, (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75, (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13, (5), 541-549 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics