マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

Bioengineering

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Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823, doi:10.3791/53823 (2016).

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Abstract

Introduction

止血は制限された時空間コンテキスト1で細胞、タンパク質、イオンと組織の組み合わせと調整活動が必要です。制御されていない活動は、血液凝固に関連する疾患のスペクトルに出血や血栓症および罹患率や死亡率につながる可能性があります。マイクロ流体フローチャンバー実験は、 インビトロで止血を模倣困難な技術です。このアプローチは、血小板のための先導的な役割で止血に参加するプロセスの複雑な相互作用の調査を可能にします。

血管損傷後、血小板は血液の損失を防止するために、露出した内皮下マトリックス(糖)タンパク質に付​​着します。接着に続いて、血小板が最終的にフィブリンおよび事務所の結果によって安定化された血小板のネットワークの形成につながるシグナル伝達を自動およびパラクリンに応答して活性化し、骨材、血栓2を封止巻か。他のほとんどの血小板機能検査、experiとは異なり、フローチャンバーを持つメントは、アカウントへの血流の物理的パラメータ、したがって、参加した細胞や生体分子3,4上のレオロジーの影響を取ります。

チャンバー実験フロー止血(サブ)に影響の重要なパラメータを変化させることによって、止血および血栓症の中で画期的な洞察を生成した接着剤マトリックス、レオロジー及び流れプロファイル、細胞組成、毒素または薬物、イオン強度および多くの存在を含む処理されます。過去20年間では、大規模なサンプル容量(10〜ml)を必要とする低スループットフローチャンバー実験は、多くの場合、小さな平行板室からなり、制御された壁面せん断条件5で全血を灌流するための近代的な技術を含むマイクロ流体室に進化してきました。ハードウェアのセットアップを簡略化しており、以下(血液)のボリュームが必要とされる主な理由Microscalingが大幅に実験をよりアクセスし、versatiレンダリング、アッセイのスループットを増加していますル。例えば、小型の実験動物からの血液は、現在、動物を犠牲にすることなく使用することができます。遺伝的に改変されたマウスの血液サンプルは、このように止血を促進または阻害鍵分子の同定におよび新規の基本的な洞察6に支援しています。

専門の研究室は、多くの場合、まだソフトウェアによってblueprintedすることができリトグラフ金型に重合したポリジメチルシロキサン(PDMS)7からインスタンスのカスタムメイドのフローチャンバーを使用します。その結果、チャンバは、安価な使い捨てであり、容易に事後解析のために分解することができます。また、分岐点または鋭いターンを含む血管の基本的にはどのようなデザインは、コマンド上に構築することができます。この利点は、標準化は既にフローチャンバー実験と主要な問題であり、PDMSは、カスタムメイドの室がこれを支援していないので、その欠点です。この特定の問題、コーティング(条件)、蛍光プローブ、抗凝固剤、温度の上サンプリングと分析の間eratureと時間がすべての悪い8を標準化されています。これらの変数の標準化は、困難、それにもかかわらず、研究室間の結果の比較を可能にするために必要とされます。このトピックでは、生物レオロジー9,10に関する科学と標準化小委員会における血栓止血に関する国際社会の主要な対象です。

血小板濃縮物(PC)は、血小板減少症および/または出血を引き起こす様々な疾患に罹患している患者に輸血されています。しかし、PC中の血小板は、特に貯蔵時間11の関数で、脱感作することが知られており、劣化プロセスは、加齢および一般血小板貯蔵病変と呼ばに連結されました。時々 、このような血小板はかつて12輸血血液循環に復元することが主張されているが、これのための証拠は乏しいです。さらに、PCを構成する血小板の機能は、日常的にテストされていないため、このようなアッセイとの間の関係治療的または予防的有効性は13不明です。マイクロ流体フローチャンバーは、コレクションと発行間の操作のチェーンを最適化するために、PC内の血小板機能を調査するための手段を提供しています。それは我々が以前に14,15を公開しているし、ここに記載されているように、PCの直接(ペアリング)比較のための強力な研究ツールです。

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Protocol

このプロトコルは、ヒト試料の研究のための制度倫理指針に従っており、インフォームドコンセントは、関係する全てのドナーから得られました。ここに記載された実験の承認は、アントワープ大学病院の施設内倫理委員会から入手しました。

注:指定しない限り、温度表示は、常に室温です。

1.準備フローチャンバーのセットアップ

  1. レーン、チューブおよびピンの準備
    1. 渦激しくコラーゲン懸濁液および50μg/ mlの最終濃度になるように、プロバイダにより供給された等張グルコース溶液で1/20に希釈します。
      注:私たちは、主にI型線維の構成された、ウマ腱コラーゲンを使用します。ウマコラーゲンI型はしばしば「HORM「コラーゲンと呼ばれ、歴史的なだけでなく、生物学的な理由の両方のためのアッセイ9のこのタイプの黄金の標準です。ヒトIII型コラーゲンを使用することもできるが、目eはあまりよくコートをフィブリルおよび血小板応答は、強力ではありません。他のコーティング表面は、例えばフォン・ヴィレブランド因子(VWF)、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン-1、またはこれらの16の組み合わせのために、使用することができます。
    2. プロバイダーのコンテナから新しい使い捨てバイオチップを取ります。ここで使用されるバイオチップの寸法はミリメートル3で0.4Wのx 0.1Hのx 20Lです。
    3. ピペットの出口としてチップとマークの一端のマイクロ流体バイオチップのレーン(複数可)に0.8μlの。レーンが1.1.1で調製した塗布溶液を含有するコ​​ラーゲンと5/6日に満たされていることを確認します。気泡がないことを確認してください。
      注:チャンネルは、部分的に(説明を参照)、チャネルの入口にコラーゲン線維の蓄積を回避するためにコーティングされています。
    4. 加湿と密閉容器内の4時間または一晩4℃でインキュベートします。
    5. / v)のウシ血清アルブミンwは(ブロッキング緩衝液(1.0%をピペットでコーティングされたチャネルを遮断他端とマークで、D、0.1%(w / v)のグルコース、10mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)の緩衝化生理食塩水(/ v)の塩化ナトリウム、pH7.4のW、0.9%(HBS)で入口として。車線が完全に空気の泡を避けブロッキング緩衝液で満たされていることを確認します。
    6. 同じサイズ(12センチ)でチューブをカットします。レーンあたり1を使用し、ピンで各チューブを接続します。例えば、二重に実行する二つの条件を比較した実験では、4チューブストレッチと4本のピンを用意する必要があります。
    7. シリンジと26 Gの針または添付コネクタを使用して蒸留水でチューブを洗浄します。
    8. ブロッキング緩衝液でチューブを飽和。 1時間の最小値のため、閉鎖し、加湿容器に保管してください。
  2. ポンプとマニホールドの準備
    1. ポンプを洗浄し、蒸留水でマニホールド、気泡を除去。
    2. 出口で固定10μlのチップを用いたバイオチップレーン(複数可)のうち、ブロッキング緩衝液を吸引します。の表面を清掃してください精密無料ワイプほこりや変性アルコールによるバイオチップは、プリントやほこりを除去します。
    3. 自動化された顕微鏡ステージ上のバイオチップを修正しました。複数のレーンが1回の実行で同時に使用されている場合は、バイオチップコンセントに8レーンマニホールドスプリッタを接続します。
      注:8レーンマニホールドスプリッタは、ポンプやバイオチップに接続されたハードウェアの一部( 図S1)です。これは、添付のソフトウェアで操作者が定義することができるバイオチップ又はレーンの組み合わせ(8個)のレーンすべての動作が利用できることができます。
    4. バイオチップの入口でそれらを修正するためにチューブでピンを使用してください。 HBSで満たされた1.5ミリリットルコニカル試験管に(ピンなし)チューブのもう一方の端を置きます。バッファおよび不十分な付着コラーゲンをブロックし、残りを除去するために、ポンプを使用して、1ミリリットルのHBSですべてのチューブとその接続されたレーンをすすぎます。

血液試料の調製

  1. コレクションとの分離健康なボランティアからの新鮮な全血。17
    1. 抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む真空チューブ内の血液の最初のミリリットルを収集し、排他的に自動血液分析器を用いて完全血球算定(CBC)のために、このサンプルを使用しています。
    2. 避難チューブを用いて、適切な抗凝固剤で血液量を収集します。フィブリン形成が研究プロトコールおよびクエン酸ナトリウムの一部ではない場合がある場合、フローチャンバー実験のための標準的な抗凝固剤は、ヘパリンまたはヒルジンです。
      注:ヘパリンは、結果に記載のすべての実験のための抗凝固剤として使用しました。
      注:血液の量は、実行される実験の数に依存します。 3車線のため、約1管(7ミリリットル)。
    3. 回転子保留中の血液の再構成にチューブを入れます。
      注:このアッセイは、瀉血の3時間以内に完了する必要があります。
    4. 多血小板血漿を準備するために250グラムで15分間遠心分離(PRP)。ゆるく充填されたペレットの乱れを防止するために遠心ブレークを使用しないでください。
      1. 複数のチューブが収集された場合には、単一の円錐形遠心分離管に血液をプールします。
        注:遠心分離は、PRPの収量および差動セル「汚染」に応じて、よりゆっくりと以下の長い行うことができる好ましいです。
    5. 削除して、いくつかの血小板が充填された赤血球を得たPRPと軟膜を捨てます。
      我々の手中に平均1μl当たり13±5×10 3パック赤血球画分中の血小板数がある(平均±SD、n個= 12):注意してください。
  2. 血液再構成
    1. 5分および4ミリリットルあたり20秒、37℃で解凍血液型AB(アカゲザルD負)プラズマ。
    2. 自動血液分析装置を用いて、2.1.5で製造した濃縮赤血球のヘマトクリットを決定します。
    3. 血液バンクに血小板濃度を決定するには、濃縮血小板股関節を用意しましたtは、上記赤血球画分を再構成するために使用されます。
    4. 1ミリリットルのサンプルで40%のヘマトクリットおよび250×10 3血小板/μLをもたらすパックされた赤血球と血小板濃縮物の体積を計算します。
      注:細胞の他の標的力価は、試験プロトコルに応じて、任意に設定することができます。
    5. 転送がクリップピペットチップを使用し、1mlのサンプル容量に達するまで、血小板濃縮物を加える新しいチューブに赤血球と血漿を充填しました。
      注:プラズマは血栓形成率に大きな影響を持っているので、研究の変数に応じて、血漿分画は、全ての再構成のサンプルで同じでなければなりません。例えば、異なるドナーから、または別の抗凝固剤で撮影を繰り返し凍結融解または血漿は、結果に影響を与えることができます。
    6. 静かに反転させて再構成された血液を混ぜ、CBCを行います。
    7. 血小板画分の量が置換された「ブランク」対照試料を調製し0.9%の同じ体積CBCを使用して再構成された血液中の内因性血小板( すなわち、非血液バンク血小板)の濃度を決定するために水中で(M / v)の塩化ナトリウム。
  3. ラベリング
    1. ピペットで1ミリリットル1μlの5 mMのカルセインAM(5μM最終濃度)を含有する試験管に血液を再構成しました。
      注:他の細胞の色素14を使用することができます。
    2. 転倒混和し。
    3. 使用前に37℃で5分間インキュベートします。

3.灌流アッセイ

  1. レーンの底に付着したコラーゲン繊維上の目的に焦点を当てます。理想的には、この焦点を当て戦略の位相差や微分干渉コントラスト(DIC)の設定を使用します。デジタルで選択されたZ-位置を固定するための実験ソフトウェアで「選択されたタイル領域に設定されている現在のZ]を選択します。
  2. メートルの試験ソフトウエアでレーン(XY)に関心領域(ROI)を選択します実験中に記録されますicroscope。
    注:ROIは任意に灌流レーン内で選択した任意の表面積することができます。そのように、これは比較的小さくても、その領域の可変流量プロファイルの副作用を回避するために、近い車線の入口及び出口に血栓形成を分析しないことが望ましいです。 ROIの表面積は、血小板の有意な数を含むか、または信号の平滑化を可能にするために血栓べきです。このプロトコルでは、ROIは2センチ車線の中央に0.62ミリメートル2の結果3等しいサイズのサイドバイサイド画像のデジタルでステッチ集合体です。
  3. 自動化されたステージ上でバイオチップの隣に、これらを反転して位置によって穏やかにサンプルを混ぜます。
  4. 再構成された血液サンプルを含む試験管内のバイオチップの入口に接続されたチューブを置きます。
  5. (希望として、または他のせん断応力)試験管にリンクされ、これらのチャネルを50ダイン/ cm 2のポンプを起動しますポンプのソフトウェアを使用して再構成した血液サンプルを含みます。
    注:他のせん断応力を使用することができます。
  6. レコード画像顕微鏡の取得と実験ソフトウェアを使用してリアルタイムで5分ごとに15秒。
    注:他の時系列が、実験のセットアップに応じて使用することができます。
    注:私たちは、一般的に100倍の倍率(10倍対物レンズと10倍レンズ)を使用しますが、より高い(または低い)倍率が簡単に代替として使用することができます。

4.ウォッシュアウト

  1. すべてのチューブの出口に取り付けられ、次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)、0.5%(v / v)を、水で最終​​的に0.1 MのNaOH、続いて蒸留水を用いてマルチチャンネルマニホールドまたはポンプに接続さを洗い流します。有害廃棄物のバイオチップの入口に固定チューブを捨てます。

5.データ解析

  1. 画像解析ソフトで血栓成長速度を決定します。次のコマンドはZEN2012に特異的です。 血小板の表面被覆率を決定するために、プラグインの画像解析を開きます
  2. 正の信号と相関画素強度を定義するためのインタラクティブなタブを分析すなわち付着血小板または付着血小板中の蛍光閾値を設定します。
  3. 自動的に選択された閾値との間の信号を有する画素を含むもの「オブジェクト」の(μm2の中の)独立した表面領域を含むことになるスプレッドシートを生成するために、 表の作成 ​​に使用します。これは、各時点で行われます。
    注:蛍光閾値を選んだしたら、解析ソフトウェアは自動的に基準を満たす視野に「オブジェクト」を検出します。これらのオブジェクトは、血栓、小さな血小板凝集または単一の血小板であり、画素数をカバーします。すべてのオブジェクトは、別々のスプレッドシートに記載されています。
  4. xml形式でこれらのスプレッドシートを保存し、スプレッドシートプログラムで開きますさらなる計算のために。
  5. 合計して、選択したオブジェクトの合計表面積とは、測定フィールド(μmの2)の総面積で結果を分けます。これは、相対的な表面被覆率(%)を生じるであろう。毎回ポイントのためにそう。
  6. 灌流時間の関数にこれらの表面被覆率をプロットし、線形回帰によって傾きを算出し、その特定の状態の血栓成長の速度論を得ました。

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Representative Results

アッセイ内変動を示すために、3つの同一の再構成された全血試料を、コラーゲン被覆された表面( 図1)を介して同時に灌流しました。これは、8.7%の変動係数をもたらしました。この統計は、関連するサンプル間の信頼性の比較を可能にする許容可能なアッセイ内およびintralaboratory変化を示唆しています。

ここで説明する商業フローチャンバの入口は、測定チャンバに垂直であり、これは、その時点での代わりに層流のわずかに乱流を引き起こすことができます。特に抗凝固療法なしの実験では、これがために血液と固定化されたアゴニストの間に増加した接触時間の目詰まりの原因となります。詰まっ入口は、チャンバー内の下流の読み出しを混乱することができます。したがって、セットアップの一部がフローチャンバー( 図2)を残しをコーティングすることにより最適化されました血小板アゴニストを欠い入口は、それによって一次および二次止血の早すぎる活性化を回避することができます。接着面の部分的なコーティングは、さらに成功し、フィールド16内の他の研究グループによって使用されます。また、この単純な実用的なトリックは、非反応性(コーティングされていない)表面上を流れる血液は、反応性(コーティングされた)部分の上に進み、ここで「トランジション」ゾーンを研究するための資産です。

輸血は、欠損部品で血液を再構成することによってシミュレートしました。この目的のために、健康なドナーからの全血を抗凝固処理は、分画遠心分離およびPC血小板によって血小板減少症をレンダリングされたが、血小板数を増加させるために添加されました。ここで重要な問題は、どのような血小板を目指してカウントされましたか?ほとんどの場合、実際の輸血は、血小板減少症患者における血小板数の正常化にはなりません。むしろ一定の閾値以上の値がを目的とし、正確な目標値が不明確19ですが。血液再構築の文脈におけるマイクロ流体フローチャンバーのアウトカムに対する様々な血小板数の影響を理解するために、いくつかの再構成は、血小板濃度( 図3)を減少させながら行いました。予想されるように、低い血小板数は、灌流時間の関数で少ない接着が得られました。したがって、与えられた研究の中に、血小板数は、サンプル条件20との間の比較を可能にするために標準化されるべきです。血小板数が少ない少ない接着が存在するという単なる事実は、しかしながら、顕微鏡とカメラの設定は、感度を増加させるために適合させることができるので、このアッセイは、血小板試料中の血小板の沈着を測定するために使用することができないことを意味するものではありません。最後に、ほとんどの場合、再構成するために使用される血小板サンプルは、患者19を要求 、ほとんどの輸血の状況に似ている残り自家血小板が含まれています。それはゴロゴロありますであればまったく別不明瞭とどのような自家血小板の役割は、同種異系血小板と輸血の関係にあるが、今後の研究のための興味深い質問です。

健康な自発的なドナーからの血液の回収に続いて、全血をしばしば冷却し、成分の調製の前に一定の室温に保ちました。血小板は、温度変化にしかし敏感である。 図4は、採血後、および灌流時の減少温度の効果を示しています。血栓は、血液を室温( 図4A)に冷却したときに同一の(対の)サンプルと比較して、よりゆっくりと構築することが見出さ研究( 図4B)を通して37℃に維持しました。

循環では、血小板は、上昇した壁せん断応力の条件で血管損傷部位に結合します。マイクロ流体フローチャンバーC内の様々なせん断速度VWF /フィブリノーゲンとoatedエンドポイント( 図5A)で、かつ血栓成長速度( 図5B)の合計血小板粘着のための違いをもたらしました。

最後に、輸血に使用されるPCを調査するために使用することができる方法マイクロ流体チャンバを実証するために、PCの記憶装置の機能における血栓の成長速度を調べました。サンプル調製と実験設定内のすべての変数は、試験期間を通じて標準化しました。したがって、唯一の変数パラメータは、PC蓄積時間であった。 図6 インビトロでの止血の血小板保存損傷の効果を実証する蓄積時間の関数で減少する血栓の成長を示しています。

図1
図1:マイクロ流体フローチャンバー実験でアッセイ内変動マイクロ流体FLO。 W室実験は50ダイン/ cm 2の時に固定化されたコラーゲンで行いました。すべての3つの同一の再構成された全血試料を、並列に、同時に灌流しました。結果は灌流時間の関数で表面被覆のための範囲(ウィスカー)として示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:部分的にコーティングされたチャンネルは 、位相差顕微鏡によって可視化(A)コラーゲン繊維のみ被覆領域で見出されました。 Calcein AMで灌流の5分後(B)のスナップショットは、50ダイン/ cm 2示されているでポンピング再構成された全血試料を標識しました。両方の画像は、100倍の倍率で撮影しました。 ig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:血栓成長速度が再構成された血液中の血小板数に依存 (A)血液を血液バンク血小板を用いて再構成した別の血 ​​小板濃度を得た濃縮物:245のx 10 3 /μL(●)、42のx 10 3 /μL(■)と12 X 10 3 /μL(▲)。コラーゲンコーティングされたチャネルを有するマイクロ流体フローチャンバー実験は50ダイン/ cm 2でのせん断応力で3つのすべてのサンプルに対して同時に行きました。 (B)示されているパネルAでの生データの線形回帰によって計算斜面。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1 ">:" =キープtogether.within-ページFO」ontent 図4
図4:温度及びマイクロ流体フローチャンバーヘパリンバキュテナーに採取した全血を室温(A)でまたは37℃(B)での水浴中で15分間保存しました。 50ダイン/ cm 2行ったのせん断応力で固定化されたコラーゲン上のマイクロ流体灌流。エンドポイント(5分灌流)でのスナップショットが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:固定化VWF /フィブリノゲンへの血小板接着に対するせん断応力の役割(A)。 4つの同一の、カルセインAM標識、再構成された全血4.5ダイン/ cm 2の(●)、50ダイン/ cm 2の(■)、90ダイン/ cm 2の(▲)及び225ダイン/ cm 2の(♦):サンプルは、可変せん断応力とVWF /フィブリノゲン被覆表面上で灌流しました。灌流の3分後に、スナップショットは、すべての4つのチャネルを撮影したものです。 (A)に記載されたサンプルの時間の関数で(B)表面の被覆率は、血栓の成長速度の違いを示す示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:血小板の血栓形成は、貯蔵時間の関数に集中すべてのマイクロ流体フローチャンバー実験は、50ダイン/ cm 2のせん断速度で、コラーゲン被覆された表面に標準化された条件下で行いました。血液はreconstiました血小板日3(●)で二重に試験と同じ濃縮物のサンプルを、7(■)および10(▲)ポストの寄付でtuted。灌流時間の関数で表面被覆量が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

S図1

図S1:マイクロ流体チャンバハードウェアの設定 (A)下大8フルオロ+バイオチップは、顕微鏡の自動化されたステージ上に搭載されている8つの別個のチャネルにポンプ機能を分割するマニホールドと、シリンジポンプに可撓性チューブを介して接続されています。 (B)再構成された血液は、バイオチップ(入口)の選択されたチャンネルに右側の使い捨てチューブを通って流れます。使い捨てチューブはステンレス鋼の流入口に固定されていますセットアップに付属のESS鋼使い捨てピン。 (B)の血流が右から左にあり、長い柔軟なチューブに回収されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

マイクロ流体フローチャンバー実験は、血液の流れに血小板機能を調査するための優れたツールであり、実験的な文脈を変化させるインビトロでの止血を評価するために使用されます。貧しい施設間の標準化9にもかかわらず、我々は我々の研究室内実験変動が許容可能であることを示しています。これは確実に与えられた研究の範囲内(ペアリング)のサンプルを比較することができます。これは、血液バンク条件11における血小板貯蔵の有害な結果である血小板保存病変、のよく文書化現象を利用して検証しました。さらに、我々は最近、血液14,15の再構成以下のマイクロ流体フローチャンバー内のPCの血小板機能上の3つの利用可能な病原体不活化技術の影響を発表しました。

生物物理学的および-化学パラメータが20変化させたとき、血小板は異なる応答します。したがって、せん断応力、細胞数および細胞composiン、温度、コーティング、抗凝固剤と、より多くの要因が研究課題に応じて、このプロトコル内で変更することができます。このプロトコルは、他の研究室は、同様のアッセイを実行することができ、市販されている唯一のハードおよびソフトウェアツールを使用しています。利用可能なハードウェアは、カスタムメイドのセットアップ未満汎用性があり、特にため、基礎研究の目的のために、これは不利であることができます。自身でのアッセイは、堅牢であるが、再現性は、生物学的および時間的変化に苦しんでいます。したがって、アッセイサンプルができるだけ対に十分に大きくなければならない大きさを検討する必要があります。試料はまた、再構成された血液は、短時間しか保存することができるので、時間的に対にされる必要があります。

血小板機能の研究のためのマイクロ流体フローチャンバーは、研究分野を後押ししているが、注意が血液レオロジー上の血小板依存性を拡大解釈するために取られるべきです。まず、フローチャンバーの長方形の形状は、府生理学的ではありません我々は、光が成長血栓に焦点を当ててできるように持っている最高のトン。第二に、血管はプラスチックで作られておらず、血小板機能の血管の弾力性の影響は、したがって、このプロトコルで検討することができません。シリンジポンプは(も少し拍動が)より直線的である一方で第三に、心臓は、拍動流が発生します。最後に、コラーゲン線維の型は、動物由来のもので流下血小板研究のために使用される標準的な材料です。注目すべきはしかし、線維状I型コラーゲンおよび(光透過率)で数十年の経験によって示されるように、血小板機能のための臨床結果は、21,22を凝集、多くの場合、よく相関します。

血小板機能23を研究する多くのアッセイがあります。これらのアドレス1または血小板機能のカップルのほとんどは止血(のモデル)をで動作するように血小板を入れながら。ここに示されているように、血栓形成のリアルタイムイメージングは​​、これまでに、最も包括的です。これは、PLAのほとんどの側面を意味します血管損傷に対するteletの応答が含まれています。ユニークな利点は、血流および全ての血液細胞の存在を含めることです。アッセイは、抗血小板療法24だけでなく、異常な血小板機能25で得られた遺伝的変化に現在使用される薬剤に敏感です。これは、血小板機能の関連する指標として、その値を示しています。このアッセイの総合的な性質は、それにもかかわらず、また、血小板の応答の特定の機能を測定するこれらのアッセイ未満の分析であることを意味します。濃厚血小板上の血液銀行操作の効果は、従ってによりフローチャンバーアッセイによってピックアップすることができますが、それらの原因を解釈するために、追加的な分析が必要です。例えば、我々のデータは、温度が大幅にマイクロ流体フローチャンバーにおける血小板接着に影響を与えることを示しています。しかし、追加の詳細な分析は、冷蔵血小板は形状を変更することが示されていると、クラスタのGPIbαは26を受容体。

らによる最近の研究。16は、システム生物学を血小板するために、基板の定義の妥当性を実証しました。これは、コラーゲンへの結合にはあまり重要であるが、固定化VWFへの血小板の結合は、高剪断速度を必要とするため、また、基板の機能に剪断速度を変化させることの組み合わせが重要です。したがって、調査の質問に応じて、選択がどの基板上に形成することができ、それらのそれぞれの流量が含まれるべきです。

結論として、我々は血液銀行、輸血医療のコンテキストで血小板機能を研究するためのマイクロ流体フローチャンバー実験のためのプロトコルを提示します。標準化の努力が9,10,28-30現在進行中であり、これらの勧告のほとんどが提示プロトコルに含まれています。血液の再構成はのモデルであります輸血が、追加の検証作業は、臨床転帰との関連性を示す必要があります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Heparin Becton, Dickinson and Company 368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Hirudin Blood tube Roche 6675751 001
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Tube 5 ml Simport 11691380
Conical tube 15 ml Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 ml Greiner bio-one 227261
10 ml Syringe BD 309604
Precision wipes Kimtech 5511
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect Cellix MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Software microfluidic pump Cellix N/A Venaflux Assay
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Bleach 10% in house preparation in house preparation
0.1 M NaOH in house preparation in house preparation
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Hematology analyzer Sysmex N/A
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Platelet incubater Helmer PF-48i
Incubation water bath GFL 1013
Pipette Brand A03429
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vortex VWR 58816-121

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References

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