זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lin, G. W., Chang, C. c. Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining. J. Vis. Exp. (108), e53883, doi:10.3791/53883 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pisum Acyrthosiphon כנימת האפון, עם הגנום רצף וגמישות פנוטיפית שפע, הפך מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים. כמו כנימות אחרות,. Pisum להפיץ במהירות באמצעות רבייה משריצה פרתנוגנטית, שבו עובר לפתח בתוך תאי ביצה באופנת פס ייצור בovariole. בעבר הקמנו פלטפורמה חזקה של כל הר הכלאה באתר המאפשרת זיהוי של ביטוי mRNA בעוברי הכנימה. לניתוח הביטוי של חלבון, אם כי, הוקם פרוטוקולים לimmunostaining ovarioles של כנימות משריצות מיניות לא הניב תוצאות משביעות רצון. כאן אנו מדווחים תנאים מותאמים להגדלת חדירות רקמות ולהפחית מכתים רקע, אשר שניהם היו בעיות בעת החלת גישות הוקמו. אופטימיזציות כוללות: (1) דגירה של K (1 מיקרוגרם / מיליליטר, 10 דקות) proteinase, שנמצא F החיוניאו חדירת נוגדן בעוברי אמצע וכנימה בשלב מאוחר; (2) החלפה של אלבומין בסרום סרום עז / שור הרגיל עם מגיב חסימה מסופק על ידי digoxigenin (DIG) מבוסס חיץ להגדיר ו( 3) יישום של מתנול ולא מי חמצן (H 2 O 2) להלבנת peroxidase אנדוגני; אשר הקטין באופן משמעותי את מכתים הרקע ברקמות הכנימה. תנאים אלה קריטיים מותאמים לimmunostaining יאפשר איתור יעיל של מוצרי גן בעוברים של. pisum וכנימות אחרות.

Introduction

כנימות הן חרקים hemipteran עם גופים רכים (1-10 מ"מ) קטנים. הם ניזונים צמחים על ידי מציצת לשד השיפה עם איברי פה פירסינג. בנוסף, הם מסתמכים על חיידק endosymbiotic לחייב, aphidicola Buchnera, לסנתז חומצות אמינו חיוניות שחסרות בתזונת SAP השיפה. יש כנימות היסטורית חיים מורכבות הכוללת רבייה משריצה פרתנוגנטית במהלך האביב וphotoperiods ארוך ביום הקיץ ורבייה מינית מֵטִיל בֵּיצִים מופעלת על ידי photoperiods קצר-היום שבמהלכו הם שכבו במספר מוגבל של ביצי overwintering 1,2. באביב ביצים אלה בוקעים לייצר הדור הראשון של כל הנקבה הכנימות (fundatrices), הבאות סיבובים רבים של רבייה פרתנוגנטית עד סתיו. רביית הבתולים המחזוריות בכנימות, שם חלופי שלבים מיניים ומיניים במחזור החיים השנתי, כבר נחשבו 1,2 חידוש אבולוציוני. בכנימות המשריצות פרתנוגנטית, עובר מתרחש בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles). לעומת זאת, עובר מֵטִיל בֵּיצִים מיני לפתח בביציות המופרות. מלבד פלסטיות רבייה, כנימות יכולות להציג polyphenism אגף הבין דור: בתגובה לאותות צפיפות ואיומי טורף, הנקבות מיניות unwinged יכולות viviparously לייצר צאצאים מכונפים להגירה למרחקים ארוכים. פרסום רצף הגנום של כנימת אפון Acyrthosiphon pisum חור' רצף הגנום הראשון לבסיס חרקים מאפשר hemimetabolous חקירה נוספת של פלסטיות רבייה, polyphenism אגף, ותכונות אחרות כוללים אינטראקציות חרקים צמח, vectoring הנגיפי וסימביוזה בכנימות על מולקולרי בסיס 3.

בנוסף להגנום רצף, כלים לאפיון ביטוי גנים ותפקוד נדרשים לקידום כנימת האפונה כאורגניזם מודל בוגר 4. שתארנו פרוטוקולים חזקים של כל הר 5-7. התערבות RNA (RNAi) באמצעות הזרקת RNA פעמיים תקועים והאכלה שמשה במשך השתקת גנים בנימפות כנימה ומבוגרים, אבל תנאים יציבים לגן מציאה בעוברים לא דווחו 8-10 עדיין. Immunostaining, גישה מבוססת נוגדנים שיכולים לזהות ביטוי חלבון בדגימות לפני ואחרי מציאה RNAi, שבוצע בעוברי כנימת האפונה 11-13. עם זאת, גידול בשיעור של חדירות וחיסול מכתים רקע רקמה הוא עדיין לא מספק תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining בעוברים המשריצים מיניים של כנימת האפון. לדוגמא, מצאנו כי החדירה של נוגדן לרקמות ירידה בעוברי gastrulating (שלבי 8-10) ושעובר עם ניצני איבר מורפולוגית לזיהוי (שלבי 13-14) היו בקושי חדיר לנוגדן. בנוסף, מכתים רקע היה דמיין בviviparo מינישלנו עובר כנימת אפונה מוכתמת באמצעות נוגדנים נגד סמן germline Vasa כמו גם שנגד חלבון Engrailed / Invected הביע במגזרים העובריים 12,13. למעשה מכתים רקע עדיין היה נראה בבירור בעוברים מוכתמים עם הנוגדנים משני בלבד.

על מנת להגדיל את החדירות מבלי לפגוע שלמות רקמות כנימה, אנחנו טיטרציה זהירות ריכוז proteinase K ונקבעו תנאים אופטימליים לעיכול רקמה על עוברי כנימה. על מנת להימנע מהכתמה אינה ספציפית בכנימת האפון, חיפשנו תרכובות שיכולים לחסום ביעילות עוברים ולדכא פעילות של peroxidase אנדוגני (POD), אנזים מועסק להגברת אותות במהלך immunostaining. מגיב חסימה הניתן על ידי קבוצת חיץ מבוססת digoxigenin (DIG), ולא עז בסרום הנורמלי משמש באופן מסורתי (NGS) / אלבומין בסרום שור (BSA), צמצם באופן משמעותי מכתים רקע. יתר על כן, מתנול נמצא inhiנשך את פעילות POD אנדוגני בצורה יעילה יותר מאשר מי חמצן (H 2 O 2). פרטים בדבר תנאי כנימה ספציפית אלה לimmunostaining על עוברים יהיו מתוארים בסעיפים הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות של כנימות

הערה:. זן המעבדה של כנימת אפון המשריצה פרתנוגנטית pisum נאסף במקור בטייוואן המרכזי וכבר גדל על צמחי מארח (sativum Pisum האפונה הגינה או פול שעועית הרחב) תחת photoperiod ארוך יום ליותר מ -300 דורות (דור אחד: ~ 10 ימים).

  1. נביטה של ​​זרעים
    1. משרים את הזרעים של צמחי מארח במים ברז למשך 3-5 ימים על RT. למלא במים טריים פעם ביום.
      הערה: לחלופין, לשים זרעים של צמחי מארח ישר לתוך אדמה לחה יכול לגרום לנביטה גם כן.
    2. לגדול זרעים נובטים 10 בסיר קטן (בקוטר סנטימטר 9 x 7 ס"מ) עם אדמה בתא הצמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C.
    3. כ -10 ימים לאחר הצמיחה מתחילה, להעביר כנימות על צמחים שגובהם הוא יותר מ -8 סנטימטרים.
  2. העברת הכנימות שמור כל סיר של צמחים בתוך כוס זכוכית 1 ליטר, להעביר 8 כנימות בוגרות על צמחים באמצעות מכחול, ולאחר מכן לאטום את הכוס עם חיפוי אווירי חדירה כגון רשת גזה כדי למנוע כנימות לברוח.
  3. דגירה כנימות בתא צמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C. מים בכל עציץ של צמחים אחת ליום.
  4. לקבלת הדור הבא של כנימות, לחזור צעדי 1.1.3-1.2.2 עשרה ימים לאחר העברת הכנימה העיקרית.

2. Dissection וקיבוע של השחלות

  1. טרי להכין paraformaldehyde% 4 (PFA) ב1x שנאגרו מלוח פוספט (PBS) כחיץ הקיבעון.
  2. מלא גם אחד של צלחת מקום עם PFA (כ -500 μl), למקם את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה, ולצלול כנימה בוגרת בתוך PFA לנתיחה.
  3. לנתח השחלות על ידי מחזיק את הראש והבטן עם סט אחד של מלקחיים, חיתוך פתוח הגבציפורן של הבטן, וגורר את השחלות מחלל הבטן.
  4. תקן שלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של PFA ב RT במשך 20 דקות.
  5. חיץ קיבעון למזוג עם טפטפת העברה (או זכוכית או חד פעמי) ולאחר מכן לשטוף השחלות עם 0.2% TritonX-100 ב 1x PBS (PBST) 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. קל רועד במיקסר / הכתף (זווית סיבוב: 60 ° (F60) מהירות / סיבוב: 8 סל"ד) מומלץ לשני קיבעון וכביסה.

3. טיפול בproteinase K (PK) כדי להגדיל את החדירות של רקמות עובריים

הערה: טיפול PK מוחל על עוברים מהארכה ואילך להקה נבט (שלב 11 של פיתוח). לעוברים צעירים, בשלב זה הוא אופציונאלי.

  1. סדרתי לדלל את פתרון המניות של PK (10 מ"ג / מיליליטר) עם 1x PBS ל1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז עבודה.
  2. דגירה השחלות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של PK (כ -500 μl) במשך 10 דקות עם רעד קל.
  3. soluti למזוג PKעל ולאחר מכן לשטוף את השחלות עם 700 μl של גליצין (2 מ"ג / מיליליטר) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
  5. תקן השחלות שוב עם חיץ קיבעון במשך 15 דקות ב RT עם רעד קל.
  6. בטל supernatant ולשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.

4. מתנול דגירה לפעילות דיכוי peroxidase אנדוגני (POD)

הערה: הדגירה מתנול אינה מוחלת על עוברים נתון לאפיטופים מכתים או נוגדן Phalloidin שמתנול רגיש.

  1. סדרנו ליבש השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 1: 3, 1: 1, 3: 1) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
  2. מייבשים השחלות עם מתנול 100% עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
    הערה: אפשר עדיין להשיג תוצאות משביעות רצון של מכתים מרקמות כנימה שאוחסנו במתנול 100% ב -20 ו# 176; C למשך חודש אחד.
  3. סדרנו רעננות השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 3: 1, 1: 1, 1: 3) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.

5. נוגדן מכתים

  1. לדלל את פתרון 10x חסימה מסט החיץ מבוסס DIG (DIG-B) ל1x.
    הערה: פתרון חסימת 1x DIG-B הוא יעילה יותר להפחתת הרקע מכתים מאשר מגיב הסטנדרטי החסימה המורכבת של 5% (V / V) בסרום עז נורמלי (NGS) ו -0.5% (V / V) אלבומין בסרום שור (BSA ) בPBST 0.2%.
  2. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B החסימה ל2.5-4 שעות על RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    הערה: לשלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר, 200 μl הוא הנפח המינימאלי לחסימת מדגם ומכתים נוגדן.
  3. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון 1x DIG-B חסימה טרי המכיל נוגדן ראשוני בdiluti המתאיםעל יחס. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    הערה: לניסוי המתואר כאן, השתמש בדילולים אופטימליים הבאים של נוגדנים עיקריים: (1) נוגדן ApVas1: 1: 500 לצביעת chromogenic, 01:50 למכתים immunofluorescence; (2) נוגדן אנטי-טובולין α: 1: 500; (3) נוגדנים חד שבטי 4D9: 01:25.
  4. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
  5. דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B חסימה עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל.
  6. למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון DIG-B חסימה טרי 1x המכיל נוגדנים משני ביחס דילול מתאים. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל.
    1. השתמש ביחסי הדילול הבאים של נוגדנים משני: (1) למכתים immunofluorescence: 1: 500 לIgG אלקסה פלואוריד 633 עיזים נגד ארנב או אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי העכבר IgG; (2) לצביעה chromogenic: 1: 200 לIgG נגד ארנב העז biotinylated.
      הערה: הנוגדנים משני biotinylated מוחל לאינטראקציה עם avidin ביוטין-המורכב (ABC) בזיהוי מבוסס המצע (chromogenic), שדרכו אותות הצביעה מוגברים באופן משמעותי.
    2. עבור מכתים immunofluorescence, לבצע צביעה בחושך כי הנוגדנים משני הוא רגיש לאור.
  7. לשטוף את נוגדנים משני עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.

6. מכתים גרעיני וF- אקטין

הערה: זו מיושמת רק למכתים immunofluorescence.

  1. כתם השחלות עם PBST 0.2% המכיל DAPI (2 ng / μl) וPhalloidin-TRITC (100 ננומטר) לשעה 2 ב RT בחושך.
  2. לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  3. דגירה השחלות עם O ההרכבה הבינוני / N ב 4 ° C עם רעד קל.

7. איתותים פיתוח

הערה: זו מיושמת רק לצביעת chromogenic.

  1. הכן של 100 μlמגיב avidin ביוטין-מורכב (ABC) לשיפור האותות על ידי הוספת 1 μl של מגיב (avidin) בμl 98 של PBST 0.2%, ערבוב ביסודיות באמצעות pipetting העדין, והוספת 1 μl של מגיב B (ביוטין מצומדות עם peroxidase חזרת ), ואחריו ערבוב מיידי. דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
  2. דגירה השחלות (כולל תאי ביצה משויך) בתערובת של חומרים כימיים ו- B במשך 30 דקות ב RT עם רעד קל.
  3. לשטוף את התערובת של חומרים כימיים ו- B עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  4. העבר את השחלות שקועות בPBST לטוב על צלחת המקום עם טפטפתי פלסטיק.
  5. הכן פתרון מצע של 3,3'-diaminobenzidine (DAB): לפזר לוח DAB אחד ועוד אחד אחרת מי מכיל אוריאה מימן ב 1 מיליליטר של DDH 2 O באמצעות vortexing הנמרץ דקות 1.
    הערה: DAB, מצע מזרז של peroxidase, הוא אַב צֶבַע פופולרי עבור immunostaining. היא מייצרת brמשקע שלו ולא מסיס לאחר שמתחמצן על ידי peroxidase. ניתן לשפר אותות חלשים על ידי הוספת כלוריד ניקל לפתרון המצע (ריכוז סופי 0.05-.08%).
  6. הסר את פתרון PBST שנותר בבאר ולמלא עם פתרון מצע DAB לפיתוח אות 100 μl.
  7. צג עוצמת האותות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
  8. עצור תגובות על ידי הסרת פתרון DAB, ואחרי מילוי עם 1x PBS באופן מיידי. חזור על לשטוף פעמיים.
  9. העבר את השחלות חזרה לצינור 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לשטוף עם 1x PBS או PBST פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  10. דגירה השחלות בהרכבה בינונית מבוסס גליצרול O (70% גליצרול) / N ב 4 ° C עם רעד קל.

8. הרכבה עוברים בכנימות

הערה: העובי של עוברי כנימה משתנה בין שלבי התפתחות. אסטרטגיות ההרכבה ובכך שונה כדי להתאים מוקדם (germaria ושלבים 0-10), אמצע (שלבים11-18), ומאוחר עוברים (שלבים 19-20), שהם הפגינו באיור 2 - D. בימוי עובריים ואחרי מיורה et al. 12

  1. העבר את השחלות יחד עם הרכבה בינונית למגש התא עם טפטפתי פלסטיק ולבחון דגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.
  2. חותך את calyces קשור עם oviduct לרוחב באמצעות סיכות חרקים ולאחר מכן להעביר ovariole מבודד לכוס ריקה גם עם טפטפתי. מרכיבים את הנפח הסופי 50-100 μl באמצעות הרכבה בינונית.
  3. העבר את ovariole לשקופית עם טפטפתי זכוכית ולאחר מכן לנתח תאי ביצה באמצעות סיכות חרקים.
    הערה: לעוברים מבוגרים משלב 6 של פיתוח, הפרדת תאי ביצית הציעה; לgermaria ושני תאי הביצה הראשונים צעירים מן השלב 6, הפרדה היא אופציונלית.
  4. להעביר את תא ביצה גזור לשקופית נקייה באמצעות טפטפתי זכוכית.
  5. שים coverslip (גודל: 22 x 22מ"מ) מעל germaria גזור או תאי ביצה (המכיל עובר בשלבי 1-10 של פיתוח) לאט כדי למנוע בועות.
    1. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים בשלבי 11-18 פיתוח) בשקופית עם גשר coverslip חד-צדדי ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
    2. תאי ביצת ההר (המכילים עוברים מעל גיל 19 שלב של פיתוח) בשקופית עם גשר דו צדדי coverslip ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ"מ) בחלק העליון של המדגם.
  6. למלא את החלל מתחת לcoverslip העליון עם תקשורת הרכבה כדי למנוע התייבשות המדגם.
  7. במתינות לגלגל את העובר על ידי הזזה coverslip להשיג את הכיוון הנכון להסתכלות.
  8. לאטום מסביב לקצה של coverslips (כולל coverslips הגשר) עם לק.

ניתוח 9. הדמיה

  1. התערבות ההפרש לעומת זאת תצלום (DIC) תמונות של כל הר עובר עם compouND מיקרוסקופ מצויד באופטיקה דסק"ש ועדשה אובייקטיבית יבשה (10X, 20X, 40X) מחוברת למצלמה. התקן את התוכנה להעברת תמונה בין המצלמה והמחשב באמצעות הוראות יצרן.
  2. לרכוש תחזיות של העוברים שכותרתו fluorescently עם מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה 14. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצילום, Z-ערימה, ו3D מקרין עם תוכנת הדמיה.
    1. הפעל את השקופית הפוכה, למצוא את המדגם רכוב עם 10X אובייקטיבי, ומקיף את אזור הדגימה עם עט מבוסס משומן בסדר.
      הערה: זה עושה את זיהוי המדגם קל יותר כאשר הוא מחפש את זה דרך יעדים של מיקרוסקופ confocal.
    2. להוסיף טיפה של שמן על החלק העליון של אזור coverslip שהצד נגדי מתויג כמתואר ב9.2.1.
  3. מצא את מישור המוקד ב40X מטרת נפט טבילה ואז לשנות למטרת נפט טבילה 63X. באופן ידני להעביר את השליטה להתמקד בסדר ולעשותwn כדי ללכוד את מישור המוקד הטוב ביותר.
    הערה: להתבוננות פרטים מבניים של germaria ועוברים מוקדמים, אנו ממליצים להשתמש 40X יעדים או אלה עם הגדלה גבוהה יותר.
  4. סרוק את העובר בערוצי עירור שונים ולקבל תמונת Z- מחסנית.
    הערה: לרקמות כנימת אפון, להפחית את עוביו של כל סעיף אופטי עד 1.5 מיקרומטר או פחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר זה, ביצענו שלם ההר-immunostaining על עוברים של כנימות מיניות אפונה (איור 1 א). נקבות אלה לייצר צאצאי רביית בתולים וviviparously. נקבת עוברים אלה מתפתחים בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles) (איור 1 ואיור 2 א). לפני מיקרוסקופיה, ovarioles גזור הן מטרות הצביעה; עם זאת, הפרדת תאי ביצה נדרש להתבוננות בעוברים תחת מיקרוסקופ (איור 2 ב - ד).

גידול של חדירות רקמות

Proteinase K טיפול (PK) הוא גישה סטנדרטית לשיפור חדירות רקמות, אבל לעוברים של כמה אורגניזמים-כגון מודל כelegans Caenorhabditis (נמטודות), melanogaster דרוזופילה (זבוב), וDanio rerio (צעד -זהו דג הזברה) הוא אופציונאלי. בכנימת האפון, הדרישה לטיפול PK היא שלב תלוי: לgermaria ועוברים לפני gastrulation (שלבים 0-7), ניתן להשמיט טיפול PK; אבל לעוברים תחת סיומת germband (שלב 11) או בשלבים מאוחר יותר בשלב זה מומלץ מאוד. לדוגמא, במהלך אותות עובר אמצע בקושי זיהו בעוברים ללא טיפול PK (איור 3 א - ג). לעומת זאת, עוצמת אות הייתה משופרת באופן משמעותי בעוברים נתון לעיכול PK (איור 3 א '- ג', "- C").

הפחתת מכתים רקע

רמה גבוהה של פעילות peroxidase אנדוגני (POD) זוהתה ברקמות עובריות של כנימות. כדי לדכא את פעילות אנזים זה, את העוברים-קבוע paraformaldehyde הודגרו בנוכחות הי"דמימן מי חמצן (H 2 O 2), מגיב משותף לחמצון של POD. התוצאות שלנו הראו כי טיפול H 2 O 2 לא לדכא את הפעילות של POD אנדוגני ביעילות בעוברים בשלב מאוחר (איור 4 א, ​​ד). לעומת זאת, מכתים רקע הופחת במידה רבה בעוברים נתון לדגירת מתנול (איור 4, C, E, F). לפני היישום של עוברי נוגדן הראשוניים היו חסום בתמיסה המכילה NGS וBSA כפי שתואר בפרוטוקולים סטנדרטיים עבור מכתים נוגדן. עם זאת, מכתים רקע שייר בעוברי הכנימה זוהה (איור 3 א '- ג'). בעיה זו נפתרה לאחר החלפת NGS / BSA עם מגיב חסימה המסופק על ידי קבוצת חיץ לניסויי DIG-תיוג כגון הכלאה באתר (איור 3 א "- C"). כך אנו מסיקים שהפוסט-קיבעון עם מתנול ודגירה עם DIG-Bהחסימה מגיב שניהם חיוניים להפחתת מכתים רקע בעוברי הכנימה.

טיפול PK ומגיב חסימת DIG-B נדרשים לא רק לזיהוי אותות אפקטיבי באמצעות גישות chromogenic אלא גם ניאון. צביעה אקטין עם phalloidin או הכתמה לאפיטופ מתנול רגיש, לעומת זאת, לא עובדת בעוברים נתון מראש קיבעון עם מתנול, שיכול להרוס את צורת יליד אקטין או נוגדנים. בהתאם לכך, יש להימנע טיפול זה בעת ביצוע immunostaining הקרינה. מלבד ביטול צעדי טיפול מתנול immunofluorescence מאפשר ניסויים רב-תיוג בעוברי הכנימה. באמצעות מיקרוסקופ confocal, למשל, חלבון Vasa1 כנימת האפון (ApVas1) בתאי נבט, α-טובולין בmicrotubules, F- אקטין בסיבים מיקרוסקופים, וה- DNA בגרעין יכול להיות מסומן במקביל ומדמיין (איור 5 א ', ג'). בהשוואה לchroשיטת mogenic (איור 5), confocal חתך דגימות של שכותרתו fluorescently מספקת רזולוציה טובה יותר של אותות מקומיים כגון ApVas1 בתאי נבט plasm נבט וcellularizing בעוברי כנימה המוקדמת (איור 5 ג ', ד' - ד '"). אימוץ התנאים לתיוג תאי נבט שתוארו לעיל, חלבון Engrailed / Invected במגזרים של הלהקה נבט הארכה היה גם מוכתם עם הנוגדן 4D9 ​​(איור 6). זה מראה כי הפרוטוקול שלנו לchromogenic וניאון כולל-immunostaining שיטות ניתן ליישם ביעילות לגילוי אותות בשני תאי מין ושושלות תאים סומטיים בכנימות.

איור 1
איור 1. פרתנוגנטית כנימות אפונה משריצה. () נימפה ראשונה-instar מתעורר מנקבה בוגרת משריץ מינית. 12. Ovariole מכיל germarium בקצה (חיצים), 1-2 ביציות, ו5-7 תאים עובריים. גוט וcauda בדרך כלל קשורים לשחלות גזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור איור 2. אסטרטגיות להרכבת עוברי כנימה בשלבים שונים של פיתוח. מתאר () של התפתחות עוברית בovariole גזור מנקבה בוגרת משריץ פרתנוגנטית. oogenesis הקצר (שלב ושלבי 0-2 germarial) ואחריו עובר (שלבים 3-20). קווי המתאר של עובר: F ormation של blastoderm syncytial (שלבים 3-5); blastulation (שלבי 6-7); gastrulation (שלבי 8-10); התארכות של להקה נבט (שלבים 11-14); katatrepsis (שלבי 15); ההודעה katatrepsis והכחשת להקה נבט (שלבים 16-17); organogenesis (שלבי 18-20). מקשי צבע הם בחלק התחתון של הדמות. (ב, ב ') Germarium ושלבי 0-10 עוברים. אין גשר coverslip נדרש. (C, C ') שלבי 11-18 עוברים. גשר coverslip נדרש. (ד, ד ') בשלבים 19-20 עוברים. גשרי coverslip זוגיים נדרשים. מתגלגל העוברים על ידי הזזה coverslip יכול ליצור זוויות שונות של התבוננות. גדלים של coverslips: 22 x 22 מ"מ ב( ב), 18 x 18 מ"מ (C) ו- (ד). העובי של coverslips: 0.13-0.16 מ"מ. בימוי עובריים ואחרי מיורה et al 12 קיצורים: ז:. germarium; רח ': שלב.קבצים / ftp_upload / 53,883 53883fig2large.jpg "target =" .com / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
. 3. טיפול איור proteinase K והשוואה של חומרים כימיים עם תופעות חסימה שונות קדמית של תאי ביצה הוא לשמאל; כל תצוגות רוחב למעט עוברים הראו ב( B ", ג ', ג'"), שהנם גב. כל עוברים מוכתמים באמצעות נוגדני ApVas1 (דילול 1: 500) ואותות של ApVas1 מפותחים בתוך 10-20 שניות. ראשי חץ מצביעים מיקום של תאי נבט. (- C) עוברים ללא טיפול של proteinase K (PK). אותות ApVas1 בתאי נבט הם בקושי זיהו. ('- ג', "- C") השוואה של מכתים רקע בגוש עובריםked עם NGS וBSA ('- ג') ושל מגיב החסימה המסחרי בשטפי DIG ובלוק מאגר הסט (DIG-B) ("- C"). רקע מופחת באופן משמעותי בעוברים הראו ב( "- C"). קיצור: ב: חיידקים. ברים סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
. מכתים רקע 4. צמצום איור עם מתנול הקדמי של עוברים הוא לשמאל; כל תצוגות גב. מטופלים עוברים עם PK להגדלת חדירות של נוגדן. ראשי חץ מצביעים מיקום של תאי נבט. (A, B, D, E) השוואה בין הטיפוליםעם מי חמצן (H 2 O 2) ומתנול. עוברי מגואלות נוגדנים משני בלבד. H 2 O 2 טיפול (0.3% w / v, 10 דקות): רקע גבוה (A, D); טיפול מתנול (100%, 60 דקות): רקע נמוך (B, E). (C, F) מכתים נוגדן ראשוני על עוברים שטופלו במתנול. תנאי טיפול מתנול זהים לאלה המשמשים לעוברים הראו ב( B, E). נוגדן ApVas1 מעדיף תוויות תאי נבט העובריים. ברים סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור צביעת 5. Immunofluorescence על עוברים מוקדמים. A, C - D) ו1: 500 ב( B). (א) אותות הכתמה, הכוללים ApVas1, α-טובולין, F- אקטין, וה- DNA הגרעיני, מזוהים באמצעות ארבעה ערוצים עם אורכי גל שונים. מקשי צבע של אותות מוצגים בחלק התחתון של הדמות. תמונה (B) דסק"ש של תוצאת chromogenic להשוואה. ApVas1 מועשר בgermarium ואילו עוצמת הניגוד של לוקליזציה האחורית של ApVas1 (ראשי חץ) בעובר בשלב 3 היא לא ברורה כמו שניתן לראות ב( C, C). (C, C ") העשרה של אותות ApVas1 בביצה אחורית. אותות המקומיים לאזור האחורי של תא הביצה (ראשי חץ) משופרים על ידי לערום תמונה. מכיוון שאותות של F- אקטין וα-טובולין להסוות אלה של ApVas1 באופן חלקי באחוריים (C), תמונה המיוצרת על ידי סריקה-מתועל אחת מוצג ב( ג '). (D - D '') חתך Confocal של ApVas1 המקומי באזור האחורי של העובר בשלב 4. תמונות מוצגות ב( ד) ו- ') הם ApVas1 זוהו בשטח ומטוסי מוקד מרכזיים, בהתאמה. ") הוא התמונה הממוזגת של כל החלקים מאותו העובר כ( ד) ו- ') קיצורים: כ: אסטר; fc, תאי זקיק; POC, ביצית פוטנציאלי; sp:. ציר; TC, מיתרים טרופיים. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. Immunostaining על מגזרים עובריים.terior של תאי ביצה הוא בצד השמאל. עוברים שטופל PK מגואלות הנוגדנים חד שבטיים נגד 4D9 Engrailed / Invected, אשר באים לידי ביטוי במגזרים עובריים. מקשי צבע של אותות מוצגים בחלק התחתון של הדמות. (, ") המכתים immunofluorescence בעובר בשלב 13. (א), תמונת confocal נערמה מתמונות של Engrailed / Invected, α-טובולין, F- אקטין, וstainings DNA הגרעיני. תמונת confocal מראה את ההכתמה של Engrailed / Invected בלבד '). ללא ההתערבות של אותות מערוצים אחרים, אותות מוצגים טוב יותר. מכתים (B, C) ​​Chromogenic על עוברים בשלבים 13 ו -17 של פיתוח, בהתאמה. שלב-13 עובר (B). (ג) העובר בשלב 17. משלבי 13 עד 17, מספר הגדל וההולך של מגזרים בבטן מסומנים על ידי 4D9. שליטה שלילית (ד) כתם (-Ctrl)ing רק עם נוגדנים משני מצומדות עם אלקסה פלואוריד 633. אין כמעט אותות immunostaining מזוהים על ovariole בלי נוגדן ראשוני. עם זאת, autofluorescence של חיידקים (קו מקף) בשלב 7 ו -13 של תאי ביצה מזוהים בננומטר גל עירור 488. קיצורים:: בטן; ב: חיידקים; H: ראש; T: בית חזה. ברים סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהינו תנאים אופטימליים קריטיים לimmunostaining המוצלח בכנימת האפונה. Pisum, אורגניזם מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים 3,15. תנאים אופטימליים להגדלת חדירות רקמות והפחתת מכתים רקע משופר העצמה וספציפיות של אותות. הם שונים מפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining במודלים של בעלי חיים אחרים בצעדים ליצירה נקבוביות בקרום תא וחסימת נוגדן שאינו ספציפי מחייב.

לimmunostaining וכלאה באתר, K עיכול proteinase (PK) הוא אחת הגישות הנפוצות להגדלת חדירות רקמות 16-19. במכתים נוגדן של רקמות כנימה, התוצאות שלנו הראו כי: (1) עיכול PK משופר באופן משמעותי אותות immunostaining בעוברים משריצים פרתנוגנטית במהלך הארכת להקה נבט (שלבי 11-14) (איור 3 ב '', ג ''), למרות שאותות חלשים היו עדיין גלויים בעוברים נטולי טיפול PK (איור 3, C); ו- (2) לעיכול PK היה חובה לעוברים מkatatrepsis ואילך (שלבי 15-20) (איור 4C, F ואיור 6 ג). לעוברים משריצים מיניים לפני katatrepsis, הנפח של תאי הביצה סביר הגורם לבעיה החדירה כי immunostaining המוצלח בעוברי מֵטִיל בֵּיצִים מיניים מוקדמים המתגוררים בהטילו ביצים-שהם כמעט שווי ערך בגודלו לקאמרי ביצה מינית הבוגרת ביותר אינו דורש עיכול PK 20. לכן, מתארך וקיפול של הלהקה נבט (שלבי 11 עד 14) בשטח המוגבל של תאי ביצה מיניים עלולים לעכב את הכניסה של נוגדן, וזה PK שמאפשר החדירה של נוגדן על ידי יצירת נקבוביות בקרום תא בין מבנים עובריים נתקעו. לעומת זאת, הארכת הקו הישר של הלהקה נבט בביצים המיניות עשויה להסביר מדוע הוא מוכתם אפילו בהיעדר PK. הסרת מעטפת vitelline / סיסית יכולה גם לעשות עוברים מֵטִיל בֵּיצִים מיניים נגישים יותר לנוגדן. לעוברים לאחר katatrepsis (שלבי 16 עד 20), טיפול PK הוא חיוני לשני morphs מיני והמיני בגלל עוברים עבים cuticled 19 (איור 4C, F ואיור 6 ג).

עם זאת, המצב הציע לעיכול PK (1 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 10 דקות) דורש התאמה נוספת אם שלמות מבנים עובריים או את עוצמת האותות אינה משביעה רצון. זה נגרמים בעיקר על ידי פעילות PK שעשוי להשתנות מתצוו אצווה. לדוגמא, אם רקמות עובריות ניזוק לאחר עיכול PK, ריכוז של PK ניתן לצמצם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר. כמו כן, אם עוצמת אות חלשה, הרחבה של דגירה 15-20 דקות היא כך מומלצת. העוברים הבשלים ביותר (שלב 20) נתון לדגירת PK הממושכת עד 20 דקות ב1.0 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז, האוVer, בדרך כלל להציג אותות חלשים, המצביע על כך עיכול PK הוא עדיין לא שלם. עיכול ממושך יכול לשפר אותות מכתים אך הוא אופציונאלי, במיוחד כאשר דפוסי ביטוי זוהו בשלב 18 עוברים דומים לאלה בשלב 20 עוברים. בהשוואה לעוברים בשלב 20 של פיתוח, את העוברים 18 הבמה עם מורפולוגיה דומה אך עם כמות פחותה של ציפורן גוף בדרך כלל יכולים להניב עוצמת אות חזקה יותר.

במהלך פיתוח אות, מכתים רקע יכול להיות מורם על ידי הפעילות של אנזימי אנדוגני שיכול לחצות להגיב עם מצעים. בעוברי כנימת אפון, פעילות של phosphatase אנדוגני אלקליין (AP) וperoxidase (POD), אשר שניהם conjugates נוגדן משותף לעיכול מצעי אות, זוהתה. פעילות hydrolase של AP אנדוגני יכולה להיות מודחקת ביעילות בכל עובר על ידי levamisole (מידע לא מוצג). עם זאת, טיפול בעוברים עם hydrog 0.3-0.6%en מי (H 2 O 2) יכול רק לחסל את פעילות POD אנדוגני לפני katatrepsis אבל לא היה מספיק לעוברים גדולים יותר (איור 4 א, ​​ד). הדגירה מתנול, גישה חלופית לdenaturing חלבונים אנדוגניים, הודגמה כיעילה בכנימות 21 (איור 4, E). שלא כמו H 2 O 2, שניזקי כנימת רקמות במהלך דגירה ממושכת של 30 דקות או יותר, מתנול אינו לעכל או לעוות את העוברים בכל שלב של פיתוח (איור 4C, F). כתוצאה מכך, מתנול הוא חלופה טובה יותר לדיכוי פעילות POD אנדוגני בעוברי כנימה. אם מכתים רקע שייר מזוהה, אשר מתרחש בדרך כלל לעוברים הבוגרים עם שכבה מעובה של ציפורן, דגירה O / N במתנול ב 4 ° C-פי הניסיון שלנו-יכולים לצמצם עוד יותר את פעילות POD אנדוגני.

מכתים רקע שיורי זוהה בעוברים חסומים בחלבונים בסרום כגון סרום נורמלי חמור (NDS), עז בסרום נורמלי (NGS), אלבומין בסרום שור (BSA), או תערובות שלהם 13 (איור 3A'-ג '). אימוץ מגיב מסופק מסחרי חסימה משמש לכלאה באתר, לעומת זאת, נותר ברקע immunostaining יכול להיות משמעותי בוטל 5 (איור 3 א '' - ג ''). למרות המרכיבים של מגיב החסימה הם קניינית, סביר להניח שמכיל חלבונים שאינם בסרום שיכול לחסום epitopes הלא ספציפית של חלבוני כנימת אפונה. מגיב החסימה גם עבד הרבה יותר טוב מאשר סרה בעלי החיים בpersicae Myzus כנימת אפרסק הירוק. כמו כן, בM עיכול PK persicae ודגירת מתנול הביאו חדירת נוגדן משביעה רצון והפחתת רקע -. בדומה לתוצאות משופרות שהושג בא pisum (מידע לא מוצג). אנו צופים כי תנאי optimizאד להגדלת חדירות רקמות והפחתת רקע, אם אחד משתמש בצביעה או הקרינה chromogenic, יחול על מינים רבים כנימה אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2) Sigma-Aldrich 18304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody Developmental studies hybridoma bank AB_528224 For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody Our laboratory N/A For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. 
Austerlitz Insect pins ENTOMORAVIA N/A For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope Canon EOS 5D For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray Kartell Labware 357 For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics Leica Microsystems DMR For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set Sigma-Aldrich (Roche) 11585762001 For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps Ideal-tek N/A For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. 
Glass dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine Bioshop N/A For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 Invitrogen A11017 For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 Invitrogen A21072 For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer ELMI laboratory equipment RM-2M For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy Leica Microsystems SP5 For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol  Burdick and Jackson AH2304 For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides  Thermo scientific 10143560 For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101030 For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses Marienfeld 0101050 For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) Santa Cruz Biotechnology sc-32293 For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish N/A N/A For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA) VWR MK262159 For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC Sigma-Aldrich P1951 For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper N/A N/A For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. 
Proteinase K Merck 124678 For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. 
Pyrex spot plate N/A N/A For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets  Sigma-Aldrich D4168 For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope Leica Microsystems EZ4 For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787 For creating pores (punching) on the cell membrane. 
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector laboratories PK-6101 For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium Vector laboratories H1000 For clearing of aphid embryos and mounting.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
  2. Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
  3. The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8, (2), e1000313 (2010).
  4. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24, (7), 353-360 (2008).
  5. Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217, (4), 275-287 (2007).
  6. Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68, (4), 186-196 (2008).
  7. Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21, (3), 265-277 (2014).
  8. Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38 (2006).
  9. Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).
  10. Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
  11. Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1, (1), e21 (2003).
  12. Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295, (1), 59-81 (2003).
  13. Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50, (4), 413-421 (2006).
  14. Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).
  15. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28, (7), 747-755 (2006).
  16. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, (2), 81-85 (1989).
  17. Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  18. Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121, (12), 4227-4236 (1995).
  19. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, (4), 345-358 (2001).
  20. Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18 (2014).
  21. Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19, (11), 682-688 (1971).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics