इन्फ्रारेड मैट्रिक्स की मदद से लेजर Desorption electrospray ionization द्वारा पूरे शरीर मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (आईआर MALDESI)

Bioengineering

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Nazari, M., Bokhart, M. T., Muddiman, D. C. Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). J. Vis. Exp. (109), e53942, doi:10.3791/53942 (2016).

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Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के लिए परिवेश आयनीकरण सूत्रों पिछले एक दशक में ज्यादा रुचि का विषय रहा है। मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption electrospray आयनीकरण (MALDESI) इस तरह के तरीकों, का एक उदाहरण है जहां मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) (जैसे, desorption की स्पंदित प्रकृति) और electrospray आयनीकरण (ईएसआई) (जैसे, मुलायम-आयनीकरण की सुविधाओं ) संयुक्त रहे हैं। MALDESI का प्रमुख लाभ में से एक अपने निहित बहुमुखी प्रतिभा है। MALDESI प्रयोगों में, एक पराबैंगनी (यूवी) या अवरक्त (आईआर) लेजर resonantly एक अंतर्जात या exogenous मैट्रिक्स उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मैट्रिक्स के चुनाव analyte निर्भर नहीं है, और लेजर तरंगदैर्ध्य उत्तेजना के लिए इस्तेमाल पर पूरी तरह निर्भर करता है। आईआर MALDESI प्रयोगों में, बर्फ की एक पतली परत के एक ऊर्जा को अवशोषित मैट्रिक्स के रूप में नमूना की सतह पर जमा किया जाता है। आईआर MALDESI स्रोत ज्यामिति तरल नमूनों के विश्लेषण के लिए प्रयोगों (डो) के सांख्यिकीय डिजाइन के साथ ही बॉय का उपयोग कर अनुकूलित किया गया हैogical ऊतक नमूनों। इसके अलावा, एक मजबूत आईआर MALDESI इमेजिंग स्रोत विकसित किया गया है, जहां एक ट्यून करने योग्य मध्य आईआर लेजर एक कंप्यूटर नियंत्रित XY translational मंच और एक उच्च शक्ति को हल मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ सिंक्रनाइज़ है। , Voxel प्रति शॉट्स, नमूना मंच के कदम आकार, और desorption के बीच में देरी और स्रोत के लिए घटनाओं को स्कैन की संख्या एक कस्टम ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) लेजर की पुनरावृत्ति दर के उपयोगकर्ता चयन अनुमति देता है। आईआर MALDESI इस तरह के फाइबर और रंगों और जैविक ऊतक वर्गों के एमएसआई के फोरेंसिक विश्लेषण के रूप में आवेदन की विविधता में इस्तेमाल किया गया है। अलग अंतर्जात चयापचयों से ऊतक वर्गों के भीतर बहिर्जात xenobiotics को लेकर analytes का वितरण मापा जाता है और इस तकनीक का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल आईआर MALDESI पूरे शरीर ऊतक वर्गों के एमएसआई के लिए आवश्यक प्रमुख कदम का वर्णन है।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) microprobe मोड में एक नमूना की सतह पर असतत स्थानों पर एक किरण (लेजर या आयनों) द्वारा एक सतह से नमूने के desorption शामिल है। प्रत्येक रेखापुंज बिंदु पर, एक जन स्पेक्ट्रम उत्पन्न होता है और अधिग्रहण स्पेक्ट्रा, स्थानिक स्थान, जहां से वे एकत्र किए गए थे के साथ साथ, एक साथ नमूना के भीतर कई analytes नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संवेदनशीलता और मास स्पेक्ट्रोमेट्री की विशिष्टता के लिए युग्मित इमेजिंग के इस लेबल मुक्त तरीके एमएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,2 में सबसे तेजी से विकसित क्षेत्रों में से एक बनने में मदद की है।

मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) सबसे आम आयनीकरण एमएसआई विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया विधि है। हालांकि, और MALDI के निर्वात आवश्यकताओं एक कार्बनिक मैट्रिक्स के लिए जरूरत reproducibility, नमूना throughput, और नमूने के प्रकार है कि विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है पर महत्वपूर्ण सीमाओं मुद्रा। वायुमंडलीय दबाव (एपी) कब का एक नंबरnization तरीकों इन प्रतिबंधों 3 नाकाम करने के लिए हाल के वर्षों में विकसित किया गया है। ये परिवेश आयनीकरण तरीकों एक वातावरण है कि ज्यादा अपनी प्राकृतिक अवस्था के करीब है और विश्लेषण करने से पहले नमूना तैयार कदम को आसान बनाने में जैविक नमूने के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption electrospray आयनीकरण (MALDESI) इस तरह के एक आयनीकरण विधि 4,5 का एक उदाहरण है।

आईआर MALDESI प्रयोगों में, बर्फ की एक पतली परत ऊर्जा को अवशोषित मैट्रिक्स के रूप में ऊतक सतह पर जमा किया जाता है। एक मध्य आईआर लेजर पल्स बर्फ मैट्रिक्स द्वारा अवशोषित कर लेता है, और resonantly रोमांचक ओह द्वारा सतह के पानी की विधा खींच से तटस्थ सामग्री के desorption की सुविधा है। एक orthogonal electrospray का आरोप लगाया बूंदों और में desorbed तटस्थ विभाजन के बाद आयनित एक ईएसआई की तरह फैशन 4-6 में हैं। बहिर्जात बर्फ मैट्रिक्स के अलावा के ऊतकों में अंतर्जात पानी पर पूरी तरह भरोसा है, क्योंकि यह एसी में मदद करता है से अधिक पसंद हैअलग ऊतक डिब्बों में पानी की सामग्री में बदलाव के लिए गिनती, और ~ 15 गुना ऊतक इमेजिंग प्रयोगों में 7.8 desorption 6 बढ़ाने और आयन बहुतायत में सुधार करने के लिए दिखाया गया है।

इस काम में, हम आईआर MALDESI एमएसआई ने एक नवजात माउस पूरे शरीर में विभिन्न अंगों भर में चयापचयों का वितरण प्रकाश में लाना करने का उपयोग। आईआर MALDESI स्रोत के समायोज्य मापदंडों के एक सिंहावलोकन दिया जाता है, और ऊतक वर्गों के सफल इमेजिंग के लिए आवश्यक कदम प्रदर्शन कर रहे हैं।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल आईआर MALDESI एमएसआई प्रयोगों प्रदर्शन के लिए सभी आवश्यक कदम का वर्णन है। में गहराई के बारे में आईआर MALDESI स्रोत के अनुकूलित ज्यामिति और लेजर, मंच के साथ अपने तुल्यकालन, और मास स्पेक्ट्रोमीटर विवरण अन्यत्र 5,6 पाया जा सकता है। पशु ऊतक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नमूने संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और उत्तरी कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी के नियमों के अनुसार प्राप्त किया गया।

1. ऊतक तैयार

  1. एक धूआं हुड में सूखी बर्फ के एक माध्यमिक कंटेनर के अंदर एक साफ बीकर में isopentane की 200 मिलीलीटर रखने ~ द्वारा एक isopentane / ड्राई बर्फ स्नान तैयार करें। हर समय सुरक्षा दस्ताने और सुरक्षा चश्मे का प्रयोग करें जब isopentane / ड्राई बर्फ स्नान और ऊतकों को संभाल रहे हैं।
    1. Avertin अधिक मात्रा से 2 दिन पुरानी पूरे नवजात माउस पिल्ला (7.5 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन) euthanize, और फिर isopentane / ड्राई बर्फ स्नान में ऊतक फ्रीज ऊतक संरचना को बनाए रखने के लिए। एक पूर्व साफ प्रयोग करेंसंदंश की एड जोड़ी जगह और isopentane / ड्राई बर्फ स्नान से cryomold में माउस पिल्ला हटा दें। -80 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर फ्लैश जमी ऊतक स्टोर।
  2. सुरक्षात्मक दस्ताने का प्रयोग, एक 40 मिमी cryostat नमूना डिस्क के लिए इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) बढ़ते मध्यम की एक परत लागू होते हैं। धीरे अक्टूबर लेपित नमूना धारक पर जमे हुए पूरे माउस जगह सेक्शनिंग के लिए वांछित अभिविन्यास में डिस्क के लिए माउस का पालन करने के लिए।
    नोट: OCT पूरी तरह सेक्शनिंग के लिए नमूना डिस्क के लिए ऊतक पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अक्टूबर में पूरी तरह से नहीं एम्बेड ऊतक करो और अतिरिक्त बचने के रूप में अक्टूबर एमएसआई विश्लेषण पर हानिकारक प्रभाव के लिए जाना जाता है। ऐसे जिलेटिन के रूप में अन्य मीडिया, यह 9 टुकड़ा करने की क्रिया से पहले ऊतक क्रायो एम्बेड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. Peltier नमूना धारक पर डिस्क (OCT और ऊतक खंड के साथ) cryostat और प्रेस Peltier बिजली का बटन में रखें। नमूना थर्मल संतुलन के लिए आने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  4. नमूनों डिस्क की जगह (ऊतक के साथ पर मुहिम शुरू कीयह) डिस्क धारक के अंदर है, और विश्लेषण के लिए वांछित विमान को नीचे ऊतक का सामना। रोटरी microtome cryostat 10 के अंदर रखे का उपयोग कर -20 डिग्री सेल्सियस पर इच्छित मोटाई के वर्गों में ऊतक स्लाइस।
    नोट: पूरे शरीर के लिए विश्लेषण, 25 माइक्रोन मोटी वर्गों में ऊतक टुकड़ा ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए। छोटे क्षेत्रों (जैसे, यकृत, मस्तिष्क, गुर्दे) के लिए, 10 माइक्रोन मोटी वर्गों में ऊतक टुकड़ा।
    1. रोलिंग से कटा हुआ ऊतक अनुभाग को रोकने के लिए विरोधी रोल कांच की प्लेट का प्रयोग करें। अवांछित ऊतक मलबे को हटाने के cryostat वैक्यूम नली और ब्रश का प्रयोग करें। एक बार ऊतक sectioned है, तेज microtome ब्लेड कवर करने के लिए ब्लेड गार्ड का उपयोग व्यक्तिगत चोटों से बचने के लिए।
  5. नमूना थाली पर ओरिएंट माउस अनुभाग और स्लाइड के रूप में संभव के रूप में बंद ऊतक खंड पर लाकर एक पूर्व साफ कांच खुर्दबीन स्लाइड पर पिघलना माउंट, यह 10 छूने के बिना।
    नोट: मात्रात्मक एमएसआई के लिए अनुभवबयान, कोट ऊतक बढ़ते करने से पहले एक स्वचालित वायवीय स्प्रेयर का उपयोग कर एक आंतरिक मानक के साथ स्लाइड, और पिघलना माउंट लेपित स्लाइड 11 पर ऊतक अनुभाग।
  6. microtome ब्लेड इजेक्टर का उपयोग ऊतक सेक्शनिंग करने के लिए इस्तेमाल ब्लेड निकालें, और सुरक्षित रूप से उचित "तेज बेकार" कंटेनर में ब्लेड त्यागें।
  7. 3.2 चरण तक cryostat अंदर कांच स्लाइड रखें ऊतक के cryopreservation बनाए रखने के लिए।

2. आईआर MALDESI तैयारी / अंशांकन

  1. मध्य आईआर लेजर पर मुड़ें और कंप्यूटर पर लेजर नियंत्रण आवेदन शुरू। लेजर नियंत्रण आवेदन निर्माता द्वारा आपूर्ति का उपयोग कर वांछित तरंगदैर्ध्य चुनें। आईआर MALDESI प्रयोगों आम तौर पर 2,940 एनएम पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
    नोट: हाल के प्रयोगों के मध्य आईआर लेजर तरंग दैर्ध्य की निर्भरता और कहा मतभेद है जो analyte विशिष्ट 8 होना प्रकट साथ बर्फ मैट्रिक्स की जांच की है।
  2. हरिण चालू करेंई नियंत्रक, कस्टम उपयोगकर्ता नियंत्रण कार्यक्रम (RASTIR) शुरू करने, और घर बटन का उपयोग चरण की स्थिति जांचना।
  3. electrospray समाधान तैयार है। आमतौर पर, सकारात्मक आयन मोड में electrospray विलायक के लिए 0.2% फार्मिक एसिड के साथ 50:50 (वी / वी) मेथनॉल / पानी का उपयोग करें। प्रयोग के अनुसार electrospray विलायक रचना का चयन करें। उदाहरण के लिए, नकारात्मक आयन मोड में इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए electrospray आपरिवर्तक के रूप में 5 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करें।
    नोट: स्विचिंग आईआर MALDESI एमएसआई polarity के लिए, संशोधक के रूप में 1 मिमी एसिटिक एसिड का उपयोग करें। इस आपरिवर्तक दोनों positive- और नकारात्मक आयन मोड 12 में स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत प्राप्त करने के लिए इष्टतम मिला था।
  4. electrospray विलायक के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें, और नए विलायक के साथ सिलिका केशिका फ्लश।
  5. एमएस प्रवेश के साथ धुरी पर ईएसआई emitter संरेखित ऐसे ईएसआई मौके दूरी के रूप में स्रोत मापदंडों का उपयोग, स्पॉट इनलेट दूरी, ऊंचाई नमूना, और विलायक प्रवाह की दर है कि सांख्यिकीय का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है ऊतक वर्गों 6 के विश्लेषण के लिए ई। नोट: ऊतक वर्गों के एमएसआई के लिए इन मानकों और मूल्यों के लिए अनुकूलित एक योजनाबद्ध चित्रण के लिए चित्रा 1 देखें।
  6. electrospray शुरू करने और अपनी स्थिरता (> 10 मिनट) कुल आयन वर्तमान (घरेलू) जो, इस बिंदु पर, केवल परिवेश यौगिकों के होते हैं की निगरानी के द्वारा मूल्यांकन। आमतौर पर, <10% 10-15 ओवर मिनट की एक घरेलू भिन्नता स्थिरता का एक अच्छा संकेत है।

आकृति 1
चित्रा 1. आईआर MALDESI योजनाबद्ध और मानकों। (ए) आईआर MALDESI स्रोत सेटअप (पैमाने पर नहीं) और समायोज्य मापदंडों के योजनाबद्ध। (बी) अनुकूलित पैरामीटर मान ऊतक वर्गों की इमेजिंग के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शीर्षक "> 3। बर्फ मैट्रिक्स के बयान

  1. सावधानी: मंच पर नमूना रखने से पहले electrospray बंद कर दें।
  2. कैमरा देखने के भीतर आईआर MALDESI नमूना थाली पर पिघलना घुड़सवार ऊतक रखें।
  3. यकीन हाथों ईएसआई emitter के स्पष्ट हैं और electrospray पुनः आरंभ करें।
  4. ऊतक की सतह पर पानी का संक्षेपण को रोकने के लिए सूखी नाइट्रोजन के साथ आईआर MALDESI स्रोत और शुद्ध बाड़े के उपयोग दरवाजा बंद कर दें। एक बार जब बाड़े तक पहुँच के अंदर सापेक्ष आर्द्रता <3%, डीसी बिजली की आपूर्ति (~ 12 वी) Peltier थाली करने के लिए है, जो नमूना प्लेट ठंडा हो जाएगा पर बारी। नोट: Peltier ठंडा चरण में ठंडा करने की प्रक्रिया कहीं और 13 में विस्तार से चर्चा की है।
  5. करने के लिए -9 चरण कूल डिग्री सेल्सियस, और घुड़सवार ऊतक थर्मल संतुलन (~ 5-10 मिनट) के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. नाइट्रोजन शुद्ध करना बंद करो और स्रोत का उपयोग दरवाजा खोलने के द्वारा परिवेश सापेक्ष आर्द्रता के लिए ऊतक का पर्दाफाश। बर्फ की एक पतली परत सह पर जमा हो जाएगाPeltier मंच के एलडी सतह और हवा से पानी की desublimation के कारण ऊतक अनुभाग मुहिम शुरू की।
    नोट: प्रयोगशाला में सापेक्ष आर्द्रता 10-15% नीचे है, बाड़े के अंदर गर्म पानी की एक बीकर जगह बर्फ मैट्रिक्स परत के गठन की सुविधा के लिए।
  7. बाद बर्फ मैट्रिक्स परत का गठन किया है, का उपयोग दरवाजा बंद करने और 10 ± 2% के सापेक्ष आर्द्रता कम करने के लिए सूखी नाइट्रोजन के प्रवाह को पुनः आरंभ। इस स्तर पर सापेक्ष आर्द्रता रखने के लिए नाइट्रोजन प्रवाह दर को समायोजित, अनुभव से बर्फ के गठन और उच्च बनाने की क्रिया का संतुलन प्रयोग 6 भर में बर्फ की एक निरंतर परत बनाए रखने के लिए हो पाया।

4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग डेटा अधिग्रहण

  1. RASTIR जीयूआई (चित्रा 2) का उपयोग करना, "लेजर स्थिति" बटन पर क्लिक करके विश्लेषण स्थिति के लिए मंच से चलते हैं। लेजर के समायोजन डायोड का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए एक ऑफ ऊतक क्षेत्र ablated दिया जाएगा। एक ऑफ ऊतक पुनः में एक लेजर शॉट आगइलाके लेजर कैमरा देखने के लिए सम्मान के साथ ऑफसेट जांच करने के लिए। लेजर स्थिति अद्यतन करने के लिए "लेजर परीक्षण आग" बटन पर क्लिक करें।
  2. "कैमरे की स्थिति" पर लौटने और लेजर पृथक स्थान (चित्रा 2-1) पर लेजर संरेखण लजीला व्यक्ति रखकर RASTIR में लेजर स्थिति अद्यतन करें।
  3. (चित्र 2-2) ब्याज (आरओआई) बटन के क्षेत्र क्लिक करें और विश्लेषण किया जा रहा ऊतक अनुभाग के लिए आकार और लागत पर लाभ की स्थिति को समायोजित। इस तरह के एक्स और वाई दिशाओं (मिमी में) (चित्रा 2-3) में कदम आकार के रूप में इनपुट उचित प्रयोगात्मक मानकों, और "परियोजना का नाम" बॉक्स (चित्रा 2-4) में MSI फ़ाइल नाम।
    1. जब एक रॉय ड्राइंग, ऑफ ऊतक है कि नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के एक हिस्से शामिल हैं। शिखर चुनने के लिए इस बंद ऊतक अनुभाग (चरण 5.4) का प्रयोग करें।
      नोट: ऊतक पर लेजर के desorption व्यास (स्थान आकार) लगभग 150 माइक्रोन है; हालांकि, उच्च स्थानिक प्रस्तावों यूएसआई द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैएनजी oversampling विधि 14,15।
  4. लटकती बॉक्स, voxel प्रति लेजर दालों (पूर्णांक मान) की संख्या, और लेजर ट्रिगर और मास स्पेक्ट्रोमीटर संकेत अधिग्रहण (चित्रा 2-5) के बीच देरी से उचित लेजर आवृत्ति का चयन करें। आम तौर पर एक 10 मिसे देरी समय के साथ, 20 हर्ट्ज पर voxel प्रति दो लेजर दालों का उपयोग पूरी तरह से एक आईआर-MALDESI एमएसआई प्रयोगों में सामग्री desorb को माप 5 के लिए जन विश्लेषक तक पहुंचने के लिए उत्पन्न आयनों की अनुमति है।
    नोट: उच्चतम पुनरावृत्ति दर है कि लेजर पर काम करने में सक्षम है चुनें। हाल ही में यह दिखाया गया था कि उच्च पुनरावृत्ति दर का उपयोग analyte detectability 16 में सुधार होगा।

चित्र 2
आईआर MALDESI एमएसआई ऑपरेशन के लिए चित्रा 2. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस। RASTIR स्कैन नियंत्रण कार्यक्रम का स्क्रीनशॉट प्रस्तुत किया है। perf के लिए कदमएक एमएसआई प्रयोग कर रहे हैं (1), लेजर हाजिर लगाने (2) एक रॉय ड्राइंग, (3) चरण कदम आकार (मिमी) का चयन, (4) फाइल करने के लिए एक नाम दे रही है, (5) सही संख्या को चुनने orming वांछित पुनरावृत्ति दर, और (6) इमेजिंग और एमएस स्थापना के लिए सूची की जाँच के साथ-साथ voxel प्रति दालों की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. इस तरह के आयनीकरण मोड, electrospray वोल्टेज, विलायक प्रवाह की दर, केशिका तापमान, और मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर में इंजेक्शन समय के रूप में मास स्पेक्ट्रोमीटर मानकों को चुनें। पूरे शरीर आईआर MALDESI एमएसआई में इस्तेमाल किया मानकों का एक उदाहरण के लिए 1 तालिका को देखें।
    नोट: जैविक नमूने और MSI विश्लेषण में जुदाई तरीकों की कमी की जटिलता के कारण, आईआर MALDESI स्रोत एक उच्च शक्ति को हल करने और उच्च जन सटीकता साधन के लिए युग्मित है। एक अधिग्रहण विधि Analys के लिए लोड किया जा सकताइस तरह के समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (पी आर एम) 7 या polarity स्विचन एमएसआई 12 के रूप में es।
  2. एक बार सभी मापदंडों (लेजर, मंच, और मास स्पेक्ट्रोमीटर) चुना गया है, तुल्यकालन के लिए "हाथ मिलाना" मोड में एमएस जगह है, और एमएस अधिग्रहण शुरू।
  3. RASTIR इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, सभी चरणों सूची में चित्रा (2-6) बक्से की जाँच करके पूरा कर रहे हैं सत्यापित करें, और प्रोग्राम लोड। एक बार प्रोग्राम लोड किया गया है, "भागो" बटन उपलब्ध हो जाएगा। प्रेस भागो एमएसआई संकेत अधिग्रहण शुरू करने के लिए।
  4. इमेजिंग प्रयोग के पूरा होने पर, मास स्पेक्ट्रोमीटर अधिग्रहण रोकने के लिए और स्टैंडबाई मोड में साधन जगह है। , बाड़े के लिए नाइट्रोजन शुद्ध करना बंद कर दें Peltier थाली करने के लिए बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं और मंच नियंत्रक और लेजर बंद।
  5. उपयोग दरवाजा खोलो, स्रोत बाड़े के अंदर से electrospray emitter टिप को हटाने, और सुरक्षात्मक दस्ताने का उपयोग बढ़ाया गर्म धातु एमएस प्रवेश को हटा दें। सावधानी: बढ़ाया धातु एमएस इनलेट बहुत गर्म हो जाएगा।
  6. दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहने हुए, 15% नाइट्रिक एसिड में अल्ट्रासोनिक स्नान द्वारा विस्तारित धातु केशिका इनलेट 10 मिनट के लिए, तो एचपीएलसी ग्रेड पानी में 10 मिनट के लिए एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल में 10 मिनट के लिए साफ है, और अंत में। नाइट्रोजन की एक धारा के तहत धातु केशिका इनलेट सूखी, और एमएस में डालें। नोट: बाद में उचित कचरे के कंटेनर में विलायक फेकें।
आर "शैली =" चौड़ाई: 216px; "> 3.8-4.2 केवी चौड़ाई: 216px; "> 140,000
पैरामीटर मूल्य
आयनीकरण मोड सकारात्मक
electrospray वोल्टेज
विलायक फ्लो दर 2 μl / मिनट
केशिका तापमान 275 डिग्री सेल्सियस
स्कैन रेंज मी / z 250-1,000
स्कैन का प्रकार पूर्ण स्कैन
इंजेक्शन समय 110 मिसे
सुलझाने की शक्ति

तालिका 1 साधन पूरे शरीर आईआर MALDESI एमएसआई में इस्तेमाल मापदंडों।

5. डेटा विश्लेषण

  1. ऐसे MSConvert 17 और imzML कनवर्टर 19 के रूप में मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इस तरह के mzXML 17 या 18 imzML के रूप में डेटा प्रारूपों के लिए साधन के द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा फ़ाइलों को परिवर्तित।
  2. MSiReader v1.0, एक खुला स्रोत, उच्च शक्ति को हल एमएसआई डेटा 20 के विश्लेषण के लिए विकसित एक समर्पित प्रसंस्करण कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर शुरू करो। इमेजिंग फ़ाइल MSiReader पर लोड। MSiReader का यूजर इंटरफेस और इसके निर्माण में सुविधाओं में से कुछ के लिए, चित्रा 3 देखें।
  3. उनकी मी / z inputting द्वारा ब्याज की analytes की आयन नक्शे उत्पन्न और मिलियन प्रति भागों में एक उपयुक्त मी / z खिड़की (पीपीएम) या थॉमसन (ध) (चित्रा 3-1) चुनें। उच्च शक्ति को हल (आरपी) उपकरणकम पीपीएम रेंज में एक खिड़की चुनें।
    नोट: उचित मी / z खिड़की साधन है कि आईआर MALDESI स्रोत के लिए युग्मित है आरपी और बड़े पैमाने पर माप सटीकता (एमएमए) पर निर्भर करता है।
  4. इसके अलावा इस तरह के प्रक्षेप (चित्रा 3-2), सामान्य (चित्रा 3-3), ऑप्टिकल छवि ओवरले (चित्रा 3-4), और चोटी उठा (चित्रा 3-5) 20 के रूप में निर्मित सुविधाओं का उपयोग कर डेटा की व्याख्या।

चित्र तीन
चित्रा 3. MSiReader का यूजर इंटरफेस; v1.0 20। एक बार एक फ़ाइल सॉफ्टवेयर में लोड किया जाता है, ब्याज की analytes की आयन नक्शे (1) मी / z और पीपीएम या वें में सहिष्णुता inputting प्रदर्शित कर रहे हैं। जैसे (2) प्रक्षेप या (3) सामान्य बनाने के आगे के विश्लेषण से भी किया जा सकता है। ऊतक के एक ऑप्टिकल छवि भी आयातित और साथ आरोपित किया जा सकताआयन नक्शे (4) बेहतर दृश्य के लिए। अलक्षित चोटी समारोह (5) उठा विश्लेषण के लिए ऊतक (मैजेंटा लाइन) के क्षेत्र और एक संदर्भ के क्षेत्र से दूर-ऊतक (हरे बॉक्स) का चयन करके ऊतक विशेष चोटियों को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

  1. शिखर उठा समारोह का प्रयोग करें ऊतक विशेष मी / z उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मानदंड का उपयोग कर मूल्यों की एक सूची उत्पन्न करने के लिए। नोट: PeakFinder एल्गोरिथ्म दोनों क्षेत्रों की औसत जन स्पेक्ट्रम में मतभेद उपयोग करता है। ये मी / z मानों तो इस तरह के METLIN 21 या लिपिड नक्शे के रूप में मेटाबोलाइट डेटाबेस के खिलाफ खोजा जा सकता है। 22
    1. एक पूछताछ ऊतक क्षेत्र (मैजेंटा बहुभुज आरओआई) और ऑफ ऊतक संदर्भ क्षेत्र (हरी बहुभुज आरओआई) को चुनने का एक उदाहरण के लिए 3 चित्रा को देखें।

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Representative Results

चित्रा 4 में प्रस्तुत छवियों स्थानिक पूरे शरीर के ऊतकों खंड में विभिन्न अंगों में चयापचयों का वितरण दिखा। शरीर के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए अनोखा मी / z मूल्यों MSiReader PeakFinder का उपयोग कर, छवि पीढ़ी के लिए बैच प्रसंस्करण के द्वारा पीछा पाए गए। छवि ओवरले उपकरण (चित्रा 3-4) जिसके परिणामस्वरूप आयन नक्शे के साथ बर्फ मैट्रिक्स बयान से पहले लिया ऑप्टिकल छवि के लिए पंक्ति में इस्तेमाल किया गया था। कोलेस्ट्रॉल, सभी प्रकार के ऊतकों भर में मनाया जाता है जानवर कोशिका झिल्ली (चित्रा 4 ए) में अपनी संरचनात्मक भूमिका से उम्मीद के रूप में, जबकि अन्य चयापचयों विशिष्ट अंगों या ऊतक डिब्बों (चित्रा 4 बी-डी) के भीतर अलग वितरण दिखा रहे हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि आईआर MALDESI एमएसआई छवियों; ई। चार Metaboliएक पूरी माउस अनुभाग के भीतर यौगिकों के स्थानीयकरण का प्रदर्शन ते आयन नक्शे। लिपिड वर्ग प्रत्येक छवि के नीचे सही में एनोटेट है। ऊतक अनुभाग के ऑप्टिकल छवि आदेश अंगों के दृश्य के साथ सहायता करने के लिए आयन नक्शे के भीतर आरोपित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के ऊपर एक आईआर MALDESI एमएसआई प्रयोग प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन है। मैट्रिक्स आवेदन प्रक्रिया (धारा 3) लगभग 20 मिनट है, जो एक रोबोट स्प्रेयर का उपयोग कर-कोटिंग स्प्रे बनाने की क्रिया या द्वारा MALDI एमएसआई प्रयोगों के लिए एक विशिष्ट मैट्रिक्स आवेदन प्रक्रिया के समान है लेता है। इसके अलावा, आईआर MALDESI मैट्रिक्स क्रिस्टल 6 में analytes के विभाजन पर भरोसा नहीं करता, और बर्फ मैट्रिक्स सार्वभौमिक उनके द्रव्यमान, आकार, या रासायनिक गुणों की परवाह किए बिना सभी analytes के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, बर्फ का उपयोग कम मी / z रेंज ठेठ MALDI प्रयोगों 23 में मनाया में मैट्रिक्स से संबंधित आयनों समाप्त।

हालांकि प्रयोग के भीतर सभी चरणों गुणवत्ता एमएसआई डेटा उत्पन्न करने की जरूरत है, प्रयोग के दौरान electrospray स्थिरता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईआर MALDESI आयन पीढ़ी के लिए आवश्यक है। सापेक्ष आर्द्रता एक इमेजिंग प्रयोग के पाठ्यक्रम खत्म करने के लिए नजर रखी जा करने की जरूरत हैएक निरंतर बर्फ मैट्रिक्स परत बनाए रखें। आईआर MALDESI desorption अपेक्षाकृत बर्फ की मोटाई 6 के लिए अभेद्य है; हालांकि, कुछ इमेजिंग प्रयोगों के कई घंटे जिसमें एक बर्फ की परत परेशानी हो सकता है अगर निगरानी नहीं ले जा सकते हैं। यह अंत करने के लिए, एक आनुपातिक-अभिन्न-derivate (पीआईडी) नियंत्रक हाल ही में आदेश तापमान और बाड़े के अंदर सापेक्ष आर्द्रता की निगरानी, ​​और जरूरत के रूप में उन्हें समायोजित करने के लिए स्रोत में एकीकृत किया गया है।

चूंकि एमएसआई सतहों से analytes की प्रत्यक्ष नमूना शामिल है, chromatographic विभाजन स्पेक्ट्रा की जटिलता को कम करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। इसके अतिरिक्त, परिवेश प्रयोगशाला वातावरण में मौजूद आयनों ब्याज की analyte (एस) से संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। परिवेश के आयनों से वर्णक्रम जटिलता जैविक नमूने के भीतर यौगिकों की विविध रेंज के साथ संयुक्त उच्च जन सटीकता और उच्च शक्ति को हल करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर आईआर MALDESI (और अन्य परिवेश एमएसआई सूत्रों) के युग्मन की आवश्यकता होती है, एसuch आदेश सही और विस्तृत नक्शे आयन की पीढ़ी की सुविधा के लिए, इस प्रयोग में इस्तेमाल एक के रूप में।

इस काम में, आईआर MALDESI एक पूरी माउस के विभिन्न अंगों में अंतर्जात चयापचयों की एक किस्म के स्थानिक वितरण प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। शिखर MSiReader में एल्गोरिथ्म उठा 500 से अधिक ऊतक विशेष आयनों, जिनमें से कई अलग अलग वर्गों से लिपिड थे की पहचान करने में सक्षम था। इस प्रोटोकॉल भी एक साथ इस तरह की दवाओं और दवा के रूप में चयापचयों बहिर्जात यौगिकों, का वितरण, विभिन्न अंगों 24,25 में निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूरे शरीर दवा वितरण की पढ़ाई के लिए सोने के मानक पूरे शरीर autoradiography 24 है। हालांकि, इस पद्धति, समय लेने वाली है radiolabeled यौगिकों की आवश्यकता है, और माता पिता के नशीली दवाओं और इसके चयापचयों के बीच भेद नहीं कर सकते, क्योंकि यह analytes की आणविक संरचना के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। आईआर MALDESI के साथ पूरे शरीर एमएसआई, इन मुद्दों पर गतिरोध उत्पन्न करते हुए भी सक्रिय करने केविश्लेषण जैविक matrices के अलावा बिना, परिवेश वातावरण में प्रदर्शन किया जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR-MALDESI Source Custom-made N/A Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development.
Q Exactive Plus  Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer
Water, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH365-4
Methanol, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH230-4
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
Tunable mid-IR Laser Opotek Inc. IR Opolette Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser
Nitrogen Gas Arc3 Gases AG S-NI300-5.0 Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300)
Cryostat Leica Biosystems CM 1950 Cryomicrotome
High Profile Microtome Blades Leica Biosystems 3802123 Leica DB80HS
Mounting Medium (OCT) Leica Biosystems 3801480 Surgipath FSC 22 mounting medium
Cryostat Specimen Disc Leica Biosystems 14047740045 40 mm diameter
Glass Microscope Slides VWR 48312-003 Frosted, selected, pre-cleaned

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References

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