L'immobilizzazione di Multi-biocatalizzatori in perline alginato per cofattore Rigenerazione e migliorata Riusabilità

Chemistry

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Summary

Presentato è il protocollo per biocatalizzatori cellule intere co-immobilizzazione per la rigenerazione del cofattore perfezionata riutilizzabilità, utilizzando la produzione di L-xilulosio come esempio. La rigenerazione cofattore è ottenuta accoppiando due ceppi di Escherichia coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari; il biocatalizzatore immobilizzazione whole-cell si ottiene incapsulamento delle cellule in perline alginato di calcio.

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Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

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Abstract

Abbiamo recentemente sviluppato un sistema semplice, riutilizzabile ed accoppiato biocatalitico whole-cell con la capacità di rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per una migliore resa produttiva e sintesi sostenuta. Qui descritta è la procedura sperimentale per lo sviluppo di un sistema costituito da due E. ceppi coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari. Insieme, questi due enzimi possono funzionare co-operativamente per mediare la rigenerazione di cofattori costosi per migliorare la resa del prodotto del bioreaction. Inoltre, è riportato il metodo di sintetizzare una forma immobilizzata del sistema biocatalitico accoppiato per incapsulamento di cellule intere in perline di alginato di calcio. Come esempio, presentiamo i migliorata biosintesi di L-xilulosio da L-arabinitol accoppiando E. coli che esprimono gli enzimi L-arabinitol deidrogenasi o NADH ossidasi. In condizioni ottimali tramite una concentrazione iniziale di 150mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, che è superiore a quelli riportati in letteratura. La forma immobilizzata dei biocatalizzatori cellule intere accoppiati dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa ottenuto nel primo ciclo dopo 7 cicli di successive riutilizzo, mentre il sistema cella libera perso quasi completamente l'attività catalitica. Pertanto, i metodi qui riportati fornisce due strategie che potrebbero favorire la produzione industriale di L-xilulosio, così come altri composti a valore aggiunto che richiedono l'uso di cofattori in generale.

Introduction

Riduttiva biotrasformazione cellula intera utilizzando microrganismi è diventato un metodo molto diffuso per la sintesi chemo-enzimatica di vista commerciale che terapeutico biomolecole importanti 1 - 3. Esso presenta diversi vantaggi rispetto all'uso di enzimi isolati, in particolare l'eliminazione dei processi di purificazione a valle costose e la dimostrazione di una maggiore durata 4 - 7. Per i percorsi biocatalitici in cui sono richiesti cofattori per la formazione del prodotto, sistemi di cellule intere hanno il potenziale di fornire la rigenerazione del cofattore situ tramite l'aggiunta di poco costoso donatori di elettroni co-substrati 5,8,9. Tuttavia, questa capacità è diminuita per le reazioni che richiedono una concentrazione stechiometrica di rare o costose co-substrati 10 - 13. Insieme con scarsa riutilizzabilità di cellule intere, questo impedisce la creazione di un produ scalabile e continuoSistema ction. sono richieste modifiche strategica dei sistemi di cellule intere per queste biotrasformazioni cofattore-dipendente di superare i limiti di cui sopra. In particolare, la combinazione di biocatalizzatori cellule intere che lavorano insieme hanno dimostrato di migliorare notevolmente la produttività e la stabilità degli enzimi nutriti 14. Questi fattori, che sono spesso critici per consentire la produzione su larga scala di prodotti commercialmente validi, possono essere ottimizzati ulteriormente da microbi biocatalitici co-immobilizzare 15. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema biocatalitico cellula intera semplice e riutilizzabile che consente sia la rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per la produzione di L-xilulosio 16. In questo studio, questo sistema è stato utilizzato come esempio per illustrare le procedure sperimentali di applicazione di queste due strategie per una migliore resa produttiva biotrasformazione e biocatalizzatore riutilizzabilità.

L-xilulosio appartiene ad una classiss di molecole biologicamente utili denominato zuccheri rare. Zuccheri rare sono monosaccaridi unici o derivati ​​di zucchero che si verificano molto raramente in natura, ma giocano un ruolo cruciale come elementi di riconoscimento di molecole bioattive 17,18. Hanno una varietà di applicazioni che vanno da dolcificanti, alimenti funzionali a potenziali terapie 19. L-xilulosio può essere utilizzato come potenziale inibitore di più alfa-glucosidasi, e può anche essere utilizzato come indicatore di epatite o cirrosi epatica 17,20. Conversione Alta efficienza di xilitolo a L-xylulose nei sistemi di cellule intere stato segnalato in precedenza in Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallido Y25 24,25 ed Escherichia coli 26. In E. coli, tuttavia, è stato raggiunto solo usando (<67 mM) basse concentrazioni di xilitolo 26 a causa di potenziali effetti inibitori di una concentrazione iniziale xilitolo superiori all'100 mm su attività xilitolo-4-deidrogenasi 21,26. L'equilibrio termodinamico tra xylulose e xilitolo ha dimostrato di favorire fortemente la formazione di xilitolo 25,27. Inoltre, la resa xylulose è limitata dalla quantità di cofattori costosi che devono essere fornite in assenza di un sistema di rigenerazione cofattore situ. Insieme, questi fattori limitano la possibilità di scalare in sistemi sostenibili per la biosintesi L-xylulose.

Per superare queste limitazioni e migliorare la resa biotrasformazione L-xylulose, la strategia di rigenerazione del cofattore è stato impiegato dapprima attraverso la definizione di un sistema di biocatalitico cellula intera accoppiato. Specificamente, L-Arabinitol 4-deidrogenasi (EC 1.1.1.12) da Hypocrea jecorina (HjLAD), un enzima del catabolismo L-arabinosio di funghi, è stato selezionato per catalizzare la conversione di L-arabinitol in L-xilulosio 28,29 . Come molti enzimi biosintetici, un importante limitation di HjLAD è che richiede una quantità stechiometrica del costoso nicotinamide adenina dinucleotide cofattore (NAD +, la forma ossidata di NADH) per eseguire questa conversione. NADH ossidasi trovato in Streptococcus pyogenes (SpNox) ha dimostrato di visualizzare l'attività di alta cofattore-rigenerazione 30,31. Approfittando di questo attributo di SpNox, E. coli che esprimono HjLAD per la produzione di L-xilulosio stati accoppiati con E. coli che esprimono SpNox per la rigenerazione di NAD + per aumentare la produzione di L-xilulosio rappresentato dalla reazione accoppiata mostrato nella Figura 1A. In condizioni ottimali e con una concentrazione iniziale di 150 mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, rendendo questo sistema molto più efficiente di quelli riportati in letteratura.

La strategia di immobilizzazione a cellule intere è stato impiegato vicino per migliorare ulteriormente la riusabilità del biocatalyt accoppiatosistema IC. Metodi comunemente usati per l'immobilizzazione a cellula intera includono adsorbimento / covalente collegamento a matrici solide, cross-linking / intrappolamento e l'incapsulamento nelle reti polimeriche 32. Tra questi approcci, il metodo più adatto per l'immobilizzazione di cellule è incapsulamento in perle di alginato di calcio. Le loro proprietà di gelificazione mite, matrice acquosa inerte e ad alta porosità aiutare a preservare le proprietà fisiologiche e le funzionalità dei prodotti biologici incapsulati 33. Pertanto, il sistema biocatalizzatore accoppiato contenente sia E. coli che ospitano HjLAD o SpNox è stato immobilizzato in perline di alginato di calcio per consentire a più cicli di produzione L-xilulosio (Figura 2) .Il sistema biocatalizzatore immobilizzato dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa di conversione del primo ciclo dopo 7 cicli di successivo riutilizzo, mentre il sistema cella libera quasi completamente perso la sua attività catalitica.

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Protocol

1. Whole-cell biocatalizzatori Preparazione

NOTA: Il ricombinante E. coli che ospitano pET28a- SpNox 31 o pET28a- HjLAD 28 sono di seguito indicati come E. coli SpNox ed E. coli HjLAD rispettivamente.

  1. Inoculare una singola colonia di E. coli HjLAD in 3 ml di Luria-Bertani (LB) medium supplementato con kanamicina (50 ug / ml) e incubare in un incubatore shaker O / N a 37 ° C, 250 rpm.
  2. Diluire la coltura da 1: 100 a 200 ml di fresca LB contenenti 50 ug / ml kanamicina e incubare a 37 ° C, 250 rpm fino alla OD 600 raggiunge ~ 0,6.
  3. Indurre l'espressione della proteina HjLAD aggiungendo 0,1 mM isopropil β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) al mezzo di coltura e incubare a 16 ° C, 180 rpm per 16 ore.
    1. In alternativa, eseguire l'induzione a 25 ° C, 200 rpm per 6 ore se la biosintesi L-xilulosio (Fase 2 sotto) è eseguito lo stesso giorno.
  4. Raccogliere il E. indotto coli HjLAD cellule per centrifugazione a 3.200 xg per 20 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e procedere al passaggio 2 per elaborare il pellet.
  5. In parallelo, eseguire i passaggi 1,1-1,4 per E. coli SpNox.

2. Biosintesi di L-xylulose accoppiando E. coli HjLAD ed E. coli SpNox per Cofactor Rigenerazione

  1. Risospendere il pellet di cellule di E. coli HjLAD ed E. coli SpNox separatamente in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ad una densità cellulare di 5,0 g di peso secco cellulare (gDCW) / L.
    Nota: Una correlazione tra gDCW e la densità ottica misurata a 600 nm (OD 600) può essere stabilito per facilitare l'esperimento. La formula utilizzata inquesto protocollo è 1 gDCW / L = 0,722 * OD 600-,0965, che può variare tra i diversi spettrometri.
  2. Mescolare 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 microlitri di 5.0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 ml di 20 mM NAD +, e 150 ml di 2 M L-arabinitol in un 14 ml di tubo a fondo rotondo e portare il volume di reazione a 2 ml con l'aggiunta di 550 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) .
    Nota: Il rapporto tra la quantità biocatalizzatori due cellula intera può essere ottimizzato per migliorare la biosintesi del prodotto. Per il sistema descritto, un rapporto di E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 è risultato essere ottimale per L-xylulose biosintesi (Figura 1B).
  3. Incubare la miscela di reazione a 30 ° C, 200 rpm per 8 ore.
  4. Raccogliere il surnatante dopo centrifugazione a 4 ° C, 3.200 xg per 10 min aND procede per quantificare la produzione di L-xylulose come descritto al punto 3 di seguito.

3. colorimetrico test per la quantificazione L-xylulose

  1. Aspirare 100 pl del supernatante reazione raccolto dal punto 2.4 in una provetta da 1,5 ml.
  2. Aggiungere 50 ml di 1,5% cisteina, 900 ml di acido solforico al 70%, e 50 ml di 0,1% carbazolo disciolto in etanolo e mescolare delicatamente invertendo la provetta 3 volte.
  3. Incubare la miscela di reazione a 37 ° C, 200 rpm per 20 min.
  4. Misurare l'assorbanza ottica della miscela di reazione a 560 nm (A 560) utilizzando uno spettrofotometro.
    1. Diluire la miscela di reazione se la lettura A 560 è superiore a 1.

4. L'immobilizzazione di catalizzatori ricombinanti cellula intera in perline alginato di calcio

  1. Sciogliere 4 g di sodio alginato in 100 ml di acqua distillata. Preparare la soluzione di alginato con l'aggiunta di sodium alginato di acqua per evitare la formazione di grumi. Scaldare la miscela, se necessario.
  2. Aggiungere 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD e 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli SpNox in 1,2 ml 4% alginato preparata nella fase 4.1 e mescolare le cellule e alginato delicatamente pipettando per evitare la formazione di bolle.
  3. Aspirare la sospensione alginato / cellulare in una siringa con ago e aggiungere il composto goccia a goccia in un cloruro di calcio 0,3 M soluzione (CaCl 2) in un becher da 100 ml con agitazione continua.
    Nota: Il volume di 2 soluzione CaCl utilizzato per la formazione del branello alginato dovrebbe essere sufficiente per le goccioline alginato per essere completamente sommerse. Inoltre, la distanza tra l'ago della siringa e la superficie della soluzione di cloruro di calcio deve essere mantenuta entro un range ottimale per garantire la formazione di perline uniformemente sferiche. L'intervallo ottimale distanza può essere determinata esperimentoally e dipende dal diametro interno dell'ago. Come una stima, una distanza di ~ 15 ± 5 cm è risultata ottimale per 0,6 cm (diametro interno) della siringa.
  4. Lasciare le perline nella soluzione CaCl 2 per 2 - 3 ore a temperatura ambiente senza mescolare per permettere la formazione di reticolazione e gel perline.
  5. Decantare la soluzione CaCl 2 senza disturbare le perline versando con attenzione la soluzione CaCl 2 in un tubo conico da 50 ml, e trasferire le restanti sfere in 2 soluzione CaCl in un altro tubo da 50 ml.
  6. Lavare le perline con 10 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) Buffer tre volte per rimuovere le cellule eccessivi CaCl 2 e UN-incapsulato.
    NOTA: In qualsiasi fase, non centrifugare le perle come così facendo li rottura. Per separare le perline dalla soluzione, evitando la formazione di riposare indisturbati per 3-5 min. Le perle si depositano sul fondo e il tampone di lavaggio possono essere decantatoin un altro contenitore.
    1. Non gettare il tampone di lavaggio utilizzato. PISCINA La buffer utilizzato Tris-HCl lavaggio (30 ml) con la soluzione utilizzata CaCl 2 raccolte dal punto 4.5.
  7. Agglomerare le non-immobilizzato E. coli per centrifugazione della soluzione di CaCl 2 e Tris-HCl pool raccolti dal passaggio 4,6 a 3.200 xg per 20 min. Per determinare l'efficienza di immobilizzazione, calcolare la densità delle cellule non-incapsulati pellet in gDCW / L come descritto al punto 2.1.
  8. Trasferire le perline lavati dal punto 4.6 in un tubo. Seguire passaggi 2.2 - 3.4 per valutare la biosintesi L-xilulosio utilizzando tutte le perline lavati in luogo di pellet cellulari.

5. Stabilità Assay di immobilizzato biocatalizzatori per la produzione di L-xylulose

  1. Raccogliere le perline dal punto 4.8 e lavare due volte con 10 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer senza centrifugazione (come descritto nel punto 4.6).
  2. utilizzare tuttedelle perline lavate per eseguire la reazione come descritto ai punti 2.2 - 3.4.
  3. Ripetere i punti 5.1 - 5.2 per il numero di cicli produttivi e misurare la quantità di L-xilulosio prodotta nel supernatante di reazione in ogni ciclo.

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Representative Results

Per attivare la rigenerazione del cofattore, sintesi L-xilulosio è stata effettuata in un sistema biocatalitico cellula intera accoppiato contenente E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox. Dopo l'ottimizzazione dei vari parametri, la riutilizzabilità di questo sistema è stato migliorato immobilizzando in perline di alginato di calcio (Figura 2).

Produzione L-xylulose con cofattore Rigenerazione accoppiando E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox.
Per migliorare la bioconversione di L-arabinitol in L-xilulosio, la E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox sono stati accoppiati per consentirerigenerazione cofattore. Per spiegare le differenze nell'espressione delle proteine ​​e la disponibilità cofattore in E. coli SpNox ed E. coli HjLAD cellule, uno studio di confronto della resa L-xilulosio a vari E. coli SpNox -a-- E. rapporti coli HjLAD è stata eseguita. Come mostrato nella Figura 1B, la resa aumentata come E. coli SpNox -a-- E. coli HjLAD rapporto è aumentato da 0,13: 1 a 1: 1. Le rese ottenute per rapporti 1: 1 e 1,33: 1 erano equivalenti e massima per questo sistema accoppiato. Tutti gli altri esperimenti sono stati eseguiti con la E. coli SpNox -a-- E. Rapporto coli HjLAD di 1: 1. Partendo con una concentrazione iniziale di 150 mM L-arabinitol, l'uso di E. coli HjLAD biocatalizzatore da sola ha prodotto 118 mm L-xylulose dopo 8 ore (punto di saturazioneper la concentrazione di L-xilulosio), con un rendimento del 79% (Figura 1C). In confronto, l'uso del E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox in un rapporto 1: 1 ha fornito 144 mM L-xilulosio, migliorando il rendimento a 96%.

Ottimizzazione della cellula intera Biocatalizzatore immobilizzazione
Immobilizzazione di biocatalizzatori in perline di alginato di calcio offre molti vantaggi, come migliorata viabilità, a causa dell'ambiente gel mite che protegge le cellule dagli stress fisici in un bioreattore. Le proprietà di queste perle di alginato è in gran parte determinato dalla formulazione e l'elaborazione dei parametri 34. Per ottimizzare la resa di produzione di L-xilulosio da una forma immobilizzata del biocatalizzatore whole-cell accoppiato sopra descritto, due parametri principali, vale a dire la concentrazione alginato di sodio e concentrazione CaCl 2, sono stati valutati. Questi sonoi principali parametri che determinano l'integrità e la rigidità delle perline di alginato di calcio, che a loro volta influenzano l'efficienza biocatalizzatore immobilizzazione e diffusione molecolare.

Come mostrato in figura 3A, l'efficienza biocatalizzatore immobilizzazione dimostrato una tendenza crescente all'aumentare della concentrazione alginato di sodio nell'intervallo 1 - 3% (w / v). Quando la concentrazione di alginato di sodio utilizzato nella matrice di immobilizzazione era inferiore all'1%, le perle risultanti erano fragili e facilmente rotto a causa di scarsa stabilità meccanica, rilasciando maggior parte delle cellule nella soluzione circostante CaCl 2 (dati non mostrati). Aumentando la concentrazione di alginato di sodio superiore al 2%, le perle risultanti induriti eccessivamente causando problemi a diffusione molecolare 35 (Figura 4). Variando la concentrazione CaCl 2 ha prodotto un andamento simile nel immobilizat biocatalizzatoreefficienza di ioni. Per una concentrazione fissa di alginato di sodio (2% w / v) e nella gamma tra 0,1 - 0,4 M di CaCl 2, inferiori CaCl 2 concentrazioni ad una diminuzione della rigidità delle perline e una maggiore perdita di cellule nella soluzione circostante. Ciò è dovuto alla limitata disponibilità di ioni Ca 2+ per la reticolazione dei blocchi guluronate sulle catene polimeriche alginato 36 (Figura 3B). Tuttavia, aumentando la concentrazione CaCl 2 da 0,3 M a 0,4 M migliorato l'efficienza biocatalizzatore immobilizzazione solo marginalmente. Grazie all'elevata efficienza di immobilizzazione (> 90%), CaCl 2 0,4 M concentrazioni superiori non sono stati valutati. Quando sono stati usati CaCl 2 concentrazioni inferiori a 0,1 M, la goccia alginato di sodio, contenente la biocatalizzatore è staccata nella soluzione di CaCl 2 e sono formati senza perle sferiche (dati non mostrati).

Per massimizzare labiocatalizzatore efficienza immobilizzazione senza rallentare significativamente la diffusione molecolare nelle perle di alginato di calcio, l'alginato di sodio e concentrazione CaCl 2 sono state ottimizzate successivo per migliorare la produzione di L-xilulosio. Utilizzando lo stesso intervallo di concentrazione da per efficienza di immobilizzazione (1 - 3% w / v alginato di sodio e 0,1 - 0,4 M di CaCl 2), una concentrazione ottimale alginato di sodio del 2% è stato osservato per ottenere la resa massima di produzione di L-xilulosio (Figura 4A ). Al di là di questa concentrazione ottimale, il rendimento ha mostrato una tendenza alla diminuzione. Questo è stato previsto, a causa dei problemi di diffusione associati alla eccessiva rigidità delle perline alginato di calcio. Analogamente, l'ottimale concentrazione CaCl 2 è risultata essere 0,3 M (Figura 4B). In combinazione con i dati mostrati nella figura 3, la concentrazione di sodio alginato ottimale (2%) e CaCl 2 concentrazione (0,3 M), che ha permesso la formazione di perline conla rigidità e la permeabilità adatto è stato istituito, consentendo di perdita delle cellule minima e massima L-xylulose resa di produzione.

Va notato che, un altro fattore che influenza l'efficienza catalitica complessiva del biocatalizzatore immobilizzato è il peso della coltura cellulare incapsulato. I catalitici efficienza aumenta con l'aumentare inoculo delle cellule fino ad un peso inoculo ottimale, oltre il quale mostra una tendenza alla diminuzione 37. Una possibile spiegazione di questa diminuzione è sovraffollamento cellulare, che ostacola la diffusione molecolare durante le perline alginato di calcio e diminuisce l'efficienza catalitica del sistema. Utilizzando la condizione di immobilizzazione ottimizzato sopra, la produzione massima L-xilulosio è stata ottenuta con un carico di 3,75 cellulare (gDCW) / L 16 (dati non mostrati).

Riutilizzabilità dei biocatalizzatori cellule intere immobilizzato e gratuiti perL-xylulose produzione.
Utilizzando la condizione ottimale stabilito di 1: 1 E. coli SpNox E. Rapporto coli HjLAD, 2% (w / v) alginato di sodio, e 0,3 M CaCl 2, immobilizzato accoppiato uscita biocatalizzatore cellula intera un massimo rendimento L-xilulosio del 64%, rispetto ad un rendimento molto più elevato di 96% per la libera accoppiato sistema cellula intera (ciclo 1 di figura 5). Si noti che la resa di immobilizzato E. cella coli HjLAD sola era solo del 32,5% (dati non mostrati), inferiore a quello del sistema accoppiato immobilizzato nonché il sistema biocatalizzatore singola connessione (79%, Figura 1C). Tale riduzione è stata prevista come immobilizzazione è noto per diminuire l'attività di biocatalizzatori, forse a causa di limitazioni substrato di diffusione, ma è stato compensato dal vantaggio di una migliore riutilizzabilità di un biocatalizzatore su immobilizzazione. Questo effetto sulla stabilità del biocatalizzatore èdimostrato dalla tendenza decrescente nella resa L-xilulosio osservato sui sottoponendo i sistemi liberi e immobilizzati ripetutamente per un processo di reazione batch, mostrato in Figura 5. La resa del sistema libero mostrato un declino molto più di quella del sistema di immobilizzato, indicando una più rapida perdita di attività enzimatica nel sistema libero. Come risultato, entrambi i sistemi hanno una resa L-xilulosio comparabile ciclo produttivo 2. Al termine di 7 cicli di successive riutilizzo, i biocatalizzatori incapsulati mantenuto la loro stabilità e trattenuto il 65% della resa iniziale mentre whole-cell libera sistema di trattenuta inferiore al 10% della sua capacità di produrre L-xilulosio. Ciò dimostra che i biocatalizzatori immobilizzati possono essere riutilizzati efficace per la produzione di L-xilulosio e che il vantaggio di una migliore riutilizzabilità e stabilità causata da immobilizzazione supera di gran lunga la riduzione dell'attività del biocatalizzatore, conferendo un vantaggio significativo per il processo di produzione sopraun intero sistema-cella libera.

Figura 1
Figura 1. Accoppiato intero sistema-cell per la produzione di L-biocatalitica xylulose. (A) Schema che illustra la reazione di rigenerazione cofattore si verificano in un sistema cellula intera accoppiato comprendente E. coli che ospitano HjLAD o SpNox rispettivamente. (B) Variazione resa di L-xilulosio con diversa E. coli SpNox E. rapporti coli HjLAD. (C) resa L-xilulosio da un biocatalizzatore cellula intera composto esclusivamente da E. coli HjLAD rispetto a quella di un sistema whole-cell accoppiato composto E. coli HjLAD ed E. cellule coli SpNox suscettibili di rigenerazione cofattore. Le trame indicati rappresentano la media e staDeviazione ndard di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. immobilizzazione del Biocatalizzatori a cellule tramite incapsulamento in perline alginato. Schema che rappresenta la formazione di dimensioni uniformi Ca 2+ perline alginato per aggiunta goccia a goccia della sospensione di sodio alginato-cell ad una soluzione di cloruro di calcio. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. parametri che influenzano l'efficienza di immobilizzazione di il biocatalizzatore cellula intera in Beads alginato. efficienza Immobilizzazione in funzione di (A) alginato di sodio (% w / v) (B) CaCl 2 (M) concentrazione. Le trame indicati rappresentano la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Valutazione del Rendimento di L-xilulosio dal Accoppiato Biocatalizzatore cellula intera immobilizzata in funzione di (A) alginato di sodio (% w / v) (B) CaCl 2 (M) concentrazione. Le trame indicati rappresentano la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti.lank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Valutazione della Biocatalizzatore Reusability. La resa di produzione di L-xylulose per 7 cicli successivi di riutilizzo di immobilizzato e la connessione accoppiata biocatalizzatore cellula intera è mostrata in grigio chiaro e scuro, rispettivamente. Il grafico riportato rappresenta la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I recenti progressi tecnologici hanno permesso un aumento nella commercializzazione di bioterapie ricombinanti, con un conseguente aumento graduale nel loro valore di mercato nel settore della biotecnologia. Un tale progresso è l'avvento dell'ingegneria metabolica nei microrganismi ricombinanti, che ha mostrato una grande promessa nella creazione di sistemi industriali scalabili 38. Come con la maggior parte dei processi, il successo della commercializzazione di biomolecole ricombinanti prodotte da microrganismi geneticamente dipende fortemente la resa di produzione del sistema 39. Ciò ha portato al rapido sviluppo della genetica "forza bruta" 39, dove evoluzione diretta di enzimi biocatalitiche è stato implementato al fine di migliorare l'attività biocatalizzatore 3. Tuttavia, per alcune vie metaboliche, quali percorsi redox, semplice miglioramento biocatalizzatore non è sufficiente a influenzare economicità della produzione per effetto significativo OTHrequisiti di reazione essenziali er, come cofattori costosi. Scale-up di un tale sistema, anche con biocatalizzatori migliorate, servirà solo ad aumentare i costi di produzione. Così, i metodi strategici supplementari sono necessari per la commercializzazione di bioreactions coinvolgono rapporti stechiometrici di cofattori. Inoltre, la riciclabilità di un biocatalizzatore è necessario per migliorare la fattibilità economica di un bioprocesso anche. Per superare l'effetto limitante del consumo cofattore rapida e scarsa riutilizzabilità dei biocatalizzatori cellule intere, abbiamo precedentemente sviluppato un immobilizzato, sistema biocatalitico whole-cell accoppiato per la rigenerazione del cofattore e stabile riutilizzo 16. Descritto nel presente studio sono le procedure sperimentali necessarie per coppia e co-immobilizzare due biocatalizzatori cellule intere per una migliore resa biotrasformazione e riutilizzabilità, insieme con i risultati rappresentativi.

Un fattore critico da considerare per accoppiare l'BioCat whole-cellalysts è il mantenimento di un controllo preciso delle condizioni stabilite per l'induzione di proteine ​​e formazione di prodotto biocatalitico di garantire la riproducibilità del sistema. Variazioni di parametri quali l'induzione OD 600, tempo di induzione, e la concentrazione IPTG dovrebbero essere evitati per minimizzare la variazione da lotto a lotto. Inoltre, ri-valutazione del rapporto cellula-cellula è richiesto per diversi biotrasformazioni. Si noti che il E. coli HjLAD: E. coli rapporto SpNox di 1: 1 riportata in questo studio è stato determinato ottimizzazione sperimentale piuttosto che il rapporto stechiometrico teorico. Per l'immobilizzazione dei biocatalizzatori cellule intere ricombinanti in perline alginato di calcio, ci sono diversi passaggi critici per garantire l'uniformità per quanto riguarda la rigidità e la distribuzione di cellule tallone. In primo luogo, la soluzione di alginato deve essere preparato aggiungendo lentamente alginato di sodio in acqua, e non viceversa per evitare grumi che coULD influenzare la concentrazione alginato locale e quindi l'entità della reticolazione. In secondo luogo, delicato pipettaggio deve essere impiegato durante la manipolazione della sospensione cellulare-alginato per evitare la formazione di bolle d'aria, che infliggono sollecitazione di taglio sulle cellule incapsulate, impedire efficace trasferimento di massa e può anche causare le perline di galleggiare. In caso di bolle d'aria vengono introdotti nella sospensione, permettono la sospensione cellulare-alginato riposare indisturbata per 20 - 30 minuti per consentire le bolle fuga. In terzo luogo, quando si effettuano le perline, la sospensione cellulare-alginato va aggiunto lentamente e con attenzione in modo goccia a goccia in un volume sufficiente di soluzione di cloruro di calcio per dimensione uniforme e morfologia. Perline sommerse incompleto in cloruro di calcio avranno una forma irregolare e scarsa rigidità che può contribuire alla perdita di cellule. Infine, per evitare variabilità nel volume di reazione da tampone di lavaggio residuo, le perline in Fase 4.8 possono essere leggermente cancellati con carta da filtro (no aria secca).

E. separata coli SpNox ed E. colture cellulari coli HjLAD, offrendo un migliore controllo nel mantenere un rapporto desiderato tra i due enzimi. Inoltre, le cellule che esprimono singole proteine ​​sono sottoposte a meno stress di quelle più proteine ​​co-espressione, che potrebbe portare ad una riduzione della misfolding e una maggiore espressione della proteina 40,41. Così, accoppiamento diretto a cellula intera presenta la capacità di mediare processi catalitici multi-enzima, senza compromettere in modo significativo la resa del prodotto. Strategie Tuttavia, affermati come attenta selezione dei promotori batterici con varia intensità 42,43 e miglioramenti nel ribosoma siti di legame 44 può essere employed per mitigare il controllo limitato sul rapporto tra enzimi bersaglio nei sistemi di co-coltura o co-espressione. Tra le molte tecniche di immobilizzazione, incapsulamento presenta molteplici vantaggi per immobilizzare biocatalizzatori cellule intere rispetto a metodi alternativi come reticolazione e l'adsorbimento, che sono più adatti per gli enzimi purificati. Incapsulamento delle cellule può essere eseguita in una varietà di biomateriali quali agar, chitosano, gomme, carragenina, gelatina e alginato 45 per migliorare la riutilizzabilità dei biocatalizzatori. Tuttavia, alginato di calcio incapsulamento ha dimostrato di essere il metodo più efficace rispetto all'efficienza immobilizzazione e biomolecole produzione 46,47.

Una limitazione importante di utilizzare biocatalizzatori tutto-cellule batteriche è la capacità minima di modificazione post-traslazionale di proteine ​​eterologhe in wild-type E. coli 48. Questo limita l'uso di successo di biocatalizzatori eucariotiche well'ambito di questo sistema. Un'alternativa per superare questa limitazione potrebbe essere l'uso di organismi come lievito che sono meglio dotati macchine post-traduzionale eucariotica. Un'altra limitazione del sistema descritto è correlato all'uso di immobilizzazione per migliorare riutilizzabilità. L'immobilizzazione è una strategia comune conveniente impiegato per contrastare la scarsa stabilità di biocatalizzatori e migliorare il loro tasso di turnover, semplificando il bioprocessi 49-51. I principali parametri che influiscono sulle prestazioni del catalizzatore incapsulati biocatalizzatori cellule intere comprendono concentrazione di sodio alginato, CaCl 2 la concentrazione, il caricamento delle cellule e la dimensione tallone. È importante riconoscere che questi parametri non sono indipendenti l'uno dall'altro. Come tale, un'analisi completa di tutti i fattori all'interno di un unico studio è molto tempo, quindi è necessario selezionare i parametri più importanti per l'ottimizzazione. Valutati e presentati qui sono gli effetti delladue parametri, alginato di sodio e di concentrazione CaCl 2. Sebbene non discusso in dettaglio qui, abbiamo precedentemente eseguito l'ottimizzazione del carico delle cellule, confrontando la dipendenza della resa sul peso delle cellule immobilizzate 16. I rapporti in letteratura indicano che la variazione del formato del branello potrebbe anche modulare la resa di produzione aumentando enzima incapsulamento, migliorando l'attività con superficie maggiore del sistema immobilizzato o cambiando la diffusione di substrati e prodotti a causa delle proprietà di trasporto alterati. A seconda delle reazioni biocatalitici in esame, la selezione dei fattori critici alternati può essere necessaria, che potrebbe portare alla generazione di un diverso insieme di condizioni ottimali. Uno studio dettagliato di determinazione delle condizioni ottimali per i parametri addizionali prevede la possibilità di ulteriore miglioramento delle prestazioni del sistema whole-cell accoppiato.

In sintesi, riportiamo all'attua sperimentalezione di un sistema biocatalitico cellula intera accoppiato immobilizzato in perline di alginato di calcio, illustrante la migliore produzione di L-xilulosio. Esprimendo diversi enzimi ricombinanti che facilitano altri cofattore dipendenti percorsi biocatalitici, alti rendimenti di molte molecole biologicamente rilevanti possono essere ottenute utilizzando il protocollo descritto qui. Inoltre, questo sistema può essere ampliato per ospitare più di due biocatalizzatori ricombinanti per un piatto multi-enzima biosintesi dei prodotti 52 e applicazioni diverse dalla produzione biocatalitico, come biosensori microbici per richiesta biochimica di ossigeno 53. Sfruttando la caratteristica sinergico di questo sistema, incapsulamento di simbiotico consorzi microbici può essere utilizzato per una miriade di applicazioni come bioremediation 54-56, bioprocessi a cellula intera per i biocarburanti 57, la promozione della crescita delle piante da terreno bioaugmentation 58 e bio- mineraria per il recupero di metalli 59

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Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti. Il documento si propone di segnalazione metodologia dettagliata per generare un sistema biocatalitico cellula intera accoppiato immobilizzato in perline alginato. Novità scientifiche sono stati riportati in uno studio precedente 16.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso il National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (NRF-2013R1A1A2012159 e NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk University e il Dipartimento di Ingegneria Chimica e mCubed Program presso l'Università del Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

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