혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

Immunology and Infection

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Summary

신속한 혈액 처리 방법은 인간에 사용되는 더 높은 펩티드 농도를 얻을뿐만 아니라 올바른 분자 형태의 평가를 허용 할 수있다. 따라서,이 방법은 펩타이드 연구에 귀중한 도구가 될 것입니다.

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Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

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Abstract

음식 섭취 조절 분야에서의 연구는 중요성을 얻고있다. 이것은 종종 음식 섭취를 조절하는 펩타이드의 측정을 포함한다. 펩티드의 농도의 정확한 결정을 위해, 그 피 처리 동안에 안정해야한다. 그러나,이 신속 내인성 펩티다아제에 의해 분해되는 여러 펩티드의 경우에는 아니다. 최근에, 우리는 R educed 온도하는 cidification를 사용하는 혈액 처리 방법을 개발, P 나는 외생 컨트롤과 쥐의 사용을위한 D의 ilution (RAPID)를 sotopic, 억제를 rotease. 여기서 우리는 인간의 사용을위한이 기술을 확립 및 복구, 분자 형태와 음식 섭취 조절 호르몬의 순환 농도를 조사 하였다. 신속한 방법은 크게 125 I 표지 된 소마토스타틴 -28 (+ 39 %), 글루카곤 유사 펩티드 -1 (+ 35 %)을위한 복구 아실 그렐린 글루카곤 (+ 32 %), 인슐린 kisspeptin (+ 29 % 향상 ) nesfatin-1 (+ 28 %), 렙틴(+ 21 %) 및 표준 처리 (얼음 EDTA 혈액, P <0.001)에 비해 펩티드 YY 3-36 (+ 19 %). 표준 후 처리 아실 그렐린의 62 % 가능성 desacyl 그렐린을 나타내는 피크 이전에 얻어진 분해 동안 고성능 액체 크로마토 그래피는 RAPID 처리 후의 예상 위치 내인성 아실 그렐린의 용출 하였다. 표준 처리 하였다 (p = 0.03) 다음 1시 23분에 비해 3 : 신속한 처리 후 정상 체중 환자의 혈액에서 아 / desacyl 그렐린의 비는 1. 또한 내인성 kisspeptin 레벨 표준 처리에 비해 RAPID 후에 높았다 (+ 99 %, p = 0.02). 신속한 혈액 처리 방법은 인간에서 사용될 수있는 더 높은 펩티드 농도를 산출하고 정확한 분자 형태의 평가를 허용한다.

Introduction

1,2- 비만의 세계적인 보급 증가에 비추어, 음식 섭취 조절 분야에서의 연구는 중요성을 얻고있다. 지금까지 단 하나의 펩티드 둘레 생성하는 것으로 알려져 중앙 지난 수십 년 내에 음식 섭취, 즉 그렐린 (3)을 자극하는 역할을하는 반면, 펩티드의 다양한 : 음식물 섭취를 줄이는 것이 확인되었다. 렙틴, 펩티드 YY (PYY)과 같은 글루카곤 유사 펩티드 -1 (GLP-1) 및 인슐린 (4), 따라서, 기아 포만 펩티드 레벨의 조절 메커니즘을 조사하는 연구들은 평가되고 동시에, 상정 검토 펩타이드 안정적인 플라즈마 형성시 높은 수율로 회수된다. 예에 대한 이전 바와 같이 단, 자주 이는 급속한 내인성 고장이 아니다. 그렐린 5 desacyl하는 아에서 분해되는 그렐린. 따라서, 우리는 최근 혈액 처리 용 빠른 방법을 설명R educed 온도하는 cidification를 사용하는 쥐에서 노래, P 나는 외생 컨트롤 및 D의 ilution 6 sotopic, 억제를 rotease. 이 방법 (11) (12)의 테스트 펩타이드 (얼음 EDTA 혈액) 표준 혈액 처리에 비해 정확한 순환하는 분자 형태를 결정하기위한 허용 6 회복을 향상시켰다. 이 방법은 부 신피질 자극 호르몬 방출 인자 (13)뿐만 아니라 그렐린 순환을 검출하기위한 몇 가지 후속 연구 7-12에 사용되어왔다. 따라서,이 방법은 설치류에서 펩타이드 연구에 유용 입증되었습니다. 설치류 연구는 다른 종 항상 병진 아니므 그러나,이 방법도 사람의 혈액에서 사용하기 위해 설정되어야한다.

본 연구의 목적은 광범위 14 U 자주 추천 표준 혈액 처리 얼음 EDTA 혈액에 비하여 인간의 혈액 처리를위한 신속한 방법을 시험했다임상과 연구 환경에서 나오지. 최근 다음 처리 (식품 섭취에 대한 효과를 표 1에 나타낸다) 규제 공급에 중요한 역할을 제안 확립 펩타이드뿐만 아니라 새로운 후보 비롯한 음식 섭취의 조절에 관여하는 125 I 표지 된 펩타이드의 선택 회수 시험 두 가지 방법으로. 호르몬은 또한 다른 길이 및 충전 (표 2)의 펩티드를 표현하기 위해 선택되었다. 또한, 그렐린을 위해 우리는 표준 및 RAPID 방법에 따라 분자 형태 (들)을 조사 하였다. 마지막으로, 내생 그렐린 (아실 desacyl 그렐린)뿐만 아니라 kisspeptin 레벨 최근 RAPID 또는 표준 처리 다음 15,16 음식 섭취의 조절에 중요한 역할을 제안 펩타이드를 평가 하였다. 또,도 possib을 연구 (10.2-67.6 kg 범위 / m 2) 체질량 지수의 광범위한 환자의 집단에서 이러한 펩티드 수준을 조사만성 변경 체중 관련 르 차이.

1 번 테이블

표 2

진단, 평가 및 계획 :
연구 참여자
모든 연구 참가자는 새로 샤리 테 - Universitätsmedizin 베를린에서 정신 신체 의학 부문 (포함 병원에 입원 이틀 이내) 환자를 입원하고 동의서를 작성했다. 성별의 영향 만 여성 환자가 포함되었다을 방지합니다. 42 과목의 총이 연구에 참여하고 세 그룹으로 나누었다 : 정상 체중 (BMI 18.5-25 kg / m 2, N = 12), 신경성 식욕 부진 (BMI <17.5 kg / m 2, N = 15)과 비만 (BMI> 30kg / m 2, N = 15). 식욕 부진과 비만 환자였다질병-10의 국제 분류에 따라 진단 각각 체중 증가 (신경성 식욕 부진) 또는 체중 감소 (비만), 병원에 입원. 모든 정상 체중 환자 인해 관련 신체 장애없이 신체형 증상에 독점적으로 병원에 입원했다. 위장 신체형 증상이나 위장 수술의 병력이있는 환자는 제외 하였다. 제외 기준은 시대 <십팔년, 현재 임신​​과 치료 정신 질환에 포함. 채혈은 각각 증가하거나, 체중을 감소시키기 위해식이 요법 치료를 받기 전에 입원 후 2 일 또는 3 일에 수행 하였다. 인체 파라미터는 같은 날에 평가 하였다.

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Protocol

이 프로토콜은 (/ 10분의 114 프로토콜 번호 EA1) 인간 연구에 대한 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 혈액 처리

  1. 표준 절차 또는 신속한 방법에 따라 팔뚝 정맥 및 프로세스에서 하룻밤 빠른 애프터 07:00 오전 8시 사이의 정맥 혈액을 수집합니다. 혈액 철수하기 전에 운동을 연기하지 않도록 주제를 지시한다.
  2. 표준 처리를 위해, 4 ℃에서 10 분 동안 3,000 XG에 10 분 이내에 냉장 EDTA 함유 튜브에 혈액을 원심 분리기를 수집합니다. 상층 액을 수집하고 방사 면역 측정법에 의해 추가 처리까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
  3. RAPID 처리 즉시 혈액 희석 빙냉 완충액 1:10 (PH 3.6), 0.1 M 암모늄 아세테이트, 0.5 M NaCl을 함유하는 효소 억제제 (혈액 인출 후 1 분 이내) (diprotin의 A, E-64-D, antipain , 류 펩틴, chymostatin 1 μg의 / ㎖). 그런 다음, 4 ° C에서 10 분 동안 3,000 XG에 10 분 이내에 원심 분리하고 상층 액 우리를 수집쥐 6 이전에 설명 된대로 폴리 프로필렌 튜브에 피펫을 보내고.
    1. 100 % 아세토 니트릴 (속도 10 ml / 분)로 충전 크로마토 카트리지 (360 ㎎, 55-105 μm의)는 1 ml의 일정한 속도로 상층 액 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA, 속도 10 ml / 분) 및 부하 평형화 / 주사기 펌프를 사용하여 분.
    2. 그 후, 3 ㎖ 0.1 % TFA와 함께 카트리지 (속도 10 ml / 분)을 씻어 내고 천천히 0.1 % TFA (2 ㎖ / 분)를 함유하는 2 ml의 70 % 아세토 니트릴로 용출시킨다.
    3. 방사 면역 측정법에 의한 추가 처리까지 -80 ° C에서 진공 원심 분리 및 저장소를 사용하여 건조 용출 샘플.
      참고 : 폴리 프로필렌 (RAPID 처리) 및 보로 실리케이트 (방사 면역 측정법) 특성을 결합 상당히 낮은 표면을 나타낸다 따라서 26 전에 공부 펩티드 대부분의 펩타이드 손실을 최소화 튜브의 모든 단계를 실시한다.

2. 측정

참고 :이 섹션의 단계는 실험실에서 수행되어야한다방사성 물질과 작품에 대한 인증을 획득하였습니다. 내가주의해야한다 (125)와 함께 작업을위한 표준주의 사항.

  1. 방사성 표지 된 펩티드의 복구
    1. 125 I-방사성 표지 인간의 펩티드를 얻습니다 (예. 아 - 그렐린, GLP-1, 글루카곤, 인슐린, kisspeptin, 렙틴, nesfatin-1, PYY 3-36 및 소마토스타틴-28).
    2. 다음 갓 0.1 %의 아세트산을 희석 실험까지 분말 형태의 펩티드 유지하고 (~ 10 mL의 CPM).
    3. 표준 혈액 처리, 튜브, 3,000~6,000 CPM을 함유하는 방사성 50 μL와 튜브로 이송 혈액 1 ㎖를 함유하는 냉장 EDTA 혈액 내로 직접 인출 한 후 (직접 계산 실험이 시작되기 전).
    4. RAPID 처리, 9 ㎖의 완충액을 RAPID을 함유하는 튜브에 혈액을 EDTA를 포함하는 전송 된 1 ml의 혈액 (조성물 1.3 참조), 500 μL의 방사성 표지는 30,000-60,000 CPM을 함유. radiolabe의 인해 1시 10분 희석 사용에 10 배 높은 볼륨신속한 처리를 위해 리터.
    5. 이후, 처리 된 샘플은 단계 1.3.2 1.2에 기재.
    6. 복구 실험을 위해, 진공 원심 분리하지 건조 샘플을 -80 ℃에서 저장하지 않습니다. 대신, 바로 후 감마 계수기를 사용하여 방사능 표지 된 펩타이드의 회수를 평가한다.
    7. RAPID의 샘플을 사용 방사성 표지의 양의 비교를 얻기 위해 전체 부피의 1/10을 분석하면서, 표준 시료 전체 상등액을 측정한다. 측정을 위해, 감마 카운터로 피팅 튜브로 상청액을 이전 분당 카운트를 평가
    8. 100 % 표준으로, 처리를받지 않은 125 I-방사성 표지 된 펩티드의 50 μl를 두 개의 샘플을 사용합니다. 2.1.7에 설명 된 다른 샘플을 동시에 측정한다.
    9. 각 펩타이드에 대한 실험을 5 ~ 6 번을 수행합니다.
  2. 방사성 표지 된 그렐린의 고성능 액체 크로마토 그래피
    1. C에서 피를 철수튜브 (실험 시작 전에 직접 계산) 15,000-20,000 CPM을 함유하는 200 ㎕의 방사성 표지 된 그렐린 아실을 포함하는 튜브로 전송 1㎖를 함유 hilled EDTA.
    2. RAPID 처리에 9 ml의 RAPID에게 버퍼를 포함하는 튜브에 1 ㎖의 전달은 혈액 (조성물 1.3 참조), 200 ㎕의 방사성 표지 된 아실 그렐린은 15,000-20,000 CPM을 함유.
    3. 이후, 처리 된 샘플은 단계 1.3.2 1.2에 기재.
    4. 역상 HPLC에 의해 추가 분석을 위해, 직접 물에 17 % 아세토 니트릴 평형 안정적인 채권 C18 컬럼 (× 50 mm 2.1 mm, 1.8 μm의) (모두 0.1 % TFA로 보충)에 샘플을로드합니다.
    5. 5 분의 평형 후, (1 ㎖ / 분의 유량) 40 분에서 샘플을 용리 17~40% 아세토 니트릴의 구배를 사용한다.
    6. 1 ml의 매 순간의 분수를 수집하고 감마 카운터를 사용하여 방사능을 분석 할 수 있습니다.
    7. 별도의 실험에서, 부하 200 ㎕의 방사성 표지 아실 그렐린은 15,000-20,000을 포함CPM 직접 열 위에 및 단계 2.2.6에 2.2.4에 설명 된대로 HPLC를 수행합니다.
  3. 방사 면역 측정법
    1. 방사 면역 들어 냉동 상청액 (기본 처리)를 해동하고, 실온에서 건조하여 분말 (RAPID 방법) 진공.
    2. 직전 방사 면역 측정법, 플라즈마 (500 μL)의 원래 볼륨에 따라 두 번 증류수 H 2 O에 건조 RAPID 샘플을 다시 일시 중지합니다.
    3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 방사선 면역 측정법을 사용 12,27 전에 설명 된 바와 같이 kisspeptin 총 (desacyl 및 아실 그렐린 모두 포함)뿐만 아니라 아 그렐린을 평가합니다. 안정적인 펠릿 형성을 허용 붕규산 튜브를 사용합니다.
      1. 첫 날에, 24 시간 동안 제조자에 의해 제공된 희석의 분석 완충액과 차 항체 (예. 항 그렐린)로 샘플을 배양한다.
      2. 하루에 두에서, VO 125 ​​I 트레이서 (예를 들어 125 I-그렐린)를 추가rtex 24 시간 동안 배양한다.
      3. 하루 세에서 침전 시약, 소용돌이를 추가하고 제조업체에서 권장 품어. 그런 다음, 원심 분리기 튜브 4 ℃에서 20 분 동안 3,000 XG에. 상층 액을 제거하고 감마 카운터를 사용하여 펠렛의 방사능을 계산
    4. 총 마이너스 아실 그렐린의 차이로 desacyl 그렐린를 계산합니다. 각 샘플 desacyl 그렐린에 의해 아실 나누어 아실 / desacyl 그렐린 비율을 평가한다.
    5. 모든 샘플을 처리 - 가능한 경우 - 하나의 배치에 간 분석 변동을 방지 할 수 있습니다. 본 실험에서의 내부 분석 변동성은 kisspeptin에 대한 <8 %, <총 7 %와 아 그렐린에 대한 <9 %였다.

3. 통계 분석

  1. 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 데이터의 분배를 결정한다. 평균의 평균 ± 표준 오차 (SEM) 등의 데이터를 표현한다.
  2. 둘 사이의 차이를 평가t-test를하여 그룹. 홀름 - Sidak 방법 다음에 모든 쌍의 현명한 다중 비교 절차 (Tukey에 사후 테스트) 또는 양방향 ANOVA에 의해 여러 그룹 사이의 차이를 평가합니다.
  3. 중요한 <0.05 쪽을 고려하고 통계 프로그램을 사용하여 분석을 수행합니다.

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Representative Results

RAPID 피 처리 표준 혈액 처리에 비해 인간의 혈액 125 I-방사성 표지 된 펩티드의 수율을 증가시킨다.
표준 혈액 처리 (얼음 EDTA 혈액) 한 후, 방사성 표지 된 펩티드의 회복 (- K 48-68%, 그림 1A에 이르기까지) 9/9 펩타이드에 ~ 60 %였다. RAPID 처리 즉 소마토스타틴-28에서, 모든 125 I 표지 된 펩티드에 (+ 39 %,도 1a)을 수율 향상, 글루카곤 유사 펩티드 -1 (+ 35 %,도 1b), 아실 그렐린 (N- 옥타 노일 그렐린, + 32 %,도 1C), 글루카곤 (+ 32 %,도 1D), 인슐린 (+ 29 %,도 1E) kisspeptin (+ 29 %,도 1F)을 nesfatin-1 (+ 28 %,도 1G), 표준 처리 (P에 비해 렙틴 (+ 21 %, 그림 1H)과 펩티드 YY 3-36 (+ 19 %, 그림 1K) <0.001). 이 9 펩타이드에서, RAPID 방법 후 회복 (- K 71~98%, 그림 1A에 이르기까지) ~ 90 %였다.

그림 1
그림 1 :. 표준 또는 RAPID 혈액 처리 방사성 표지 된 펩티드 다음과 같은 인간의 혈액에서 125 I-표지 펩티드의 복구 표준 절차 (얼음 EDTA 혈액) 또는 RAPID 방법 (감소 온도, 산성화, 단백질 분해 효소에 따라 인간의 혈액에 첨가하고, 처리 된 억제, 동위 원소 외인성 제어 및 희석). 상층 액을 수집하고, 방사능에 대해 계수 하였다. 각 열은 5 ~ 6 실험의 SEM ± 평균을 나타냅니다. *** p <0.001 표준 처리. 여기를 클릭하세요 것은 경쟁하기이 그림의 WA 더 큰 버전.

예상되는 위치에서 신속한 처리, 그렐린 용출에 따라.
표준 절차 후 이전 피크 그렐린 (도 2)에 대응 desacyl 대부분 관찰하면서 인간의 혈액의 신속한 처리 한 후, 125 I 표지 된 그렐린은, 예상 위치에서 용출시켰다. 이것은 펩티드의 62 %의 열화를 나타내.

그림 2
그림 2 :. (125) I-표시 아실 그렐린의 용출 프로파일 인간의 혈액에서 표준 또는 신속한 혈액 처리 방사성 표지 된 펩티드 다음은 표준 절차 또는 신속한 방법에 따라 인간의 혈액에 추가 처리되었습니다. 그 후, 상등액을 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼 상에 로딩 하였다. 용출액 COL이었다매 분마다 택된 방사능에 대한 계산. 표준 후 초기 용출 큰 비율을 처리하는 동안 처리 RAPID 후에 예상 시점에서 용출 된 펩타이드의 가장 가능성 desacyl 그렐린 나타내는. 약어 :. CPM, 분당 카운트 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

RAPID 혈액 처리 표준 처리에 비해 아실 / Desacyl 그렐린 비율과 증가 된 내생 Kisspeptin 혈액 수준의 결과를 향상시킵니다.
혈액은 표준 또는 신속한 절차에 따라 식욕 부진, 정상 체중과 비만 환자에서 인출 및 처리되었습니다. 내인성 그렐린 (총 아실 그렐린)는 방사 면역 측정법에 의해 평가 하였다. 인체와 동반 질환은 / 연구 그룹의 약물은 표 3 4에 나타낸다. 신속한 처리 후 정상 체중의 환자 혈액 아실 / desacyl 그렐린 비는 1 : 3 표준 혈액 처리 (p = 0.03;도 3A) 다음 1시 23분 비교. (: 3 1시 13분; p = 0.04;도 3A 1이다.) (3 1:19 p <0.001 1) 비만 조건 유사한 결과 거식증으로 관찰 하였다. 차이는 표준 또는 신속한 처리 (그림 3A)의 세 가지 다른 그룹 사이에서 관찰되지 않았다. 체중 / 대사 조건 아무런 영향이 없었다하면서 양방향 ANOVA는 상기 처리 방법의 FL 영향력의 유의 한 (F 1,64 = 15.3, p <0.001)를 나타내 (F 2.64 = 0.5, p = 0.62).

표 3

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차이 (비만 조건 중요성에 도달하지 않았지만 순환 내인성 kisspeptin 수준은 상당히 높은 거식증 표준 처리부 (+ 60 %, p = 0.02) 및 정상 체중 피사체 (+ 99 %, p = 0.02)에 비해 RAPID 따랐을 23 %, p = 0.39;도 3b). 유의 한 차이는 세 가지 BMI 그룹간에 관찰되지 않았다 (p> 0.05도 3B). 체중 / 대사 조건이 영향을 미치지 아니하면서 양방향 ANOVA는 (F 2,74 = 0.5, p = 0.60)의 처리 방법의 FL 영향력의 유의 한 (F 1,74 = 10.8, p = 0.002)을 나타냈다.

그림 3 그림 3 : 아실 / Desacyl 그렐린 비율을 순환하고 다음과 같은 다른 대사 조건에 따라 Kisspeptin 수준을 순환 RAPID 또는 표준 혈액 처리 혈액이 표준 절차 또는 신속한 방법에 따라 하룻밤 빠른 후에 식욕 부진, 정상 체중 또는 비만 환자로부터 회수 및 처리되었습니다.. 상등액을 수집하고, 아실뿐만 아니라 총 그렐린 수준 또는 kisspeptin 레벨 (B)은 방사 면역 측정법에 의해 평가 하였다. Desacyl 그렐린 총 그렐린에서 아실 감산 하였다. 비율은 desacyl 그렐린 (A)에 의해 아실 나누어 계산 하였다. 그룹 크기는 컬럼의 하단에 표시된다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다. * P <0.05, ** p <대 0.01 *** p <0.001. 표준 처리. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

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Discussion

우리는 혈액 처리 용 RAPID 방법 래트 6 표준 혈액 처리에 비해 11/12 펩티드 회복을 개선하는 것이 이전에보고 하였다. 본 연구에서 우리는이 방법은 또한 인간의 사용에 적합 것으로 나타났습니다. 신속한 처리에 따라, 시험 구 (125) 9 I-표시 펩티드에 대한 복구는 표준 혈액 처리 (얼음 EDTA 혈액)에 비해 향상되었다. 관찰 된 향상은, 특히 펩티드의 수율이 낮은 경우 만 마스크 할 수 미묘한 차이가 예상되는 상황에서, 관련 가능성 19~39%에서였다.

우리는 또한 보여 주었다 RAPID 혈액 처리 그렐린 표준 혈액 처리 후 2/3 그렐린을 desacyl에 성능이 저하 된 반면, 정확한 분자 형태 (아실 그렐린)를 나타내는 HPLC 후 올바​​른 용출 위치에서 검출 된 후. 아실 그룹 D, 그렐린 수용체 (28)의 결합을 위해 필수적이기 때문에전자 실화 크게 펩타이드의 생물학적 기능을 변경할 것으로 예상된다. 그러나, 또한 desacyl 그렐린은 점점 생물학적 활성 펩타이드 (29)으로 인식하고 있습니다. 흥미롭게도, desacyl 그렐린은 음식 섭취 30 대장 운동 31 이전과 같이 그렐린의 효과를 상쇄하기 위해 제안되었다. 이는 더 정확한 분자 형태를 조사의 중요성을 강조한다.

정상 체중을 대상으로 kisspeptin의 내인성 수준을 연구 할 때, 우리는 표준 혈액 처리에 비해 RAPID에 따라 크게 증가 수준 (+ 99 %)을 보였다. 그러나, 개선 전반적인 증가 kisspeptin 레벨에 기인 할 수있다 비만의 조건 하에서 관찰되지 않았다 (VS 비만에서 + 50 %. 정상 체중). 사실에 기인 할 수 있으며, 유의 한 차이가 관찰되지 않았다 방법 중 하나로 처리 혈액 BMI 그룹 (신경성 식욕 부진, 정상 체중과 비만) 사이에만 금식 수준 WER 그전자는 평가했다. 차이는 분명 식후, 향후 연구에서 조사해야 가설 수 있습니다.

Kisspeptin은 또는 프로테아제 억제제 (33)를 첨가함으로써 (표준 처리 함 본 연구) 얼음 (32) 상에만 EDTA 튜브를 사용하는 연구에서 이전에 측정되었다. 본 연구에 기초하여 상기 냉각 관의 펩티드 분해를 방지하기에 충분하지 않다. 혼자 산성화 또는 단일 단백질 분해 효소 억제제 kisspeptin을 유지하기에 충분 여부 미래 연구에서 조사되어야한다.

마찬가지로, RAPID 처리도 크게 증가 아실 / desacyl 그렐린 비율로 나타낸 바와 같이 내인성 아실 그렐린의 수율을 증가시킨다 (1 : 3) 표준 혈액 처리 (1시 23분) 비교. 전 (표준 처리 후 1시 19분에 비해) 신속한 처리 5 : 우리는 1 아실 / desacyl 그렐린 비율을보고 곳이 발견은 설치류 연구와 좋은 일치를 보여줍니다.이전에보고 된 1시 55분 (34, 35)에 1:15 아실 / desacyl 그렐린 비율의 넓은 범위 때문에 desacyl 그렐린의 탈 실화에 의존하는 높은 비율에 따라서 대부분이었다. kisspeptin에 대해 상술 한 바와 같이, 아실 / desacyl 그렐린 비율에는 변화가 만성적으로 변경 체중 (VS. 비만. 정상 체중 거식증)의 상이한 조건 하에서 관찰되지 않았다. 또한이 때문에 아실 / desacyl 그렐린의 단식 수준을 평가하고, 식후의 조절이 중요하다는 사실 일 수있다. 한편 이는 또한 만성 변경 체중 불구 아실 desacyl 그렐린의 비율이 기저 상태에서 변경되지 않으며, 이들 조건 하에서 관찰 적응 변화에 중요한 역할을하지 않을 수 있음을 나타낸다. 그러나, RAPID 방법을 표준화 식사 프로토콜을 사용하고 적용하는 미래 연구는 더이 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.

빠른 날THOD는 다음 요소를 사용하여 화학 반응은 주로 온도 36 빙냉 용액을 사용하여 온도의 감소에 의존하기 때문에, 펩티드의 분해 속도가 느려. 다음으로,도 산도 (산성화)의 감소는 열화 (37)의 속도를 감소시킨다. 또한, pH의 감소가 다른 표면에 펩티드의 흡착을 감소시키고, 따라서 또한 펩티드 손실의 위험을 감소시킨다. (. 예를 들어, 카 텝신 B / H) 여기서 사용 된 프로테아제 억제제는 다양한 내인성 펩 티다 제의 스펙트럼을 커버하기 위해 선택되었다 티올 프로테아제에 대한 저해제로서 디펩 티딜 펩 티다 제 IV, E-64 (D)의 억제제로서 diprotin A를,로 antipain 키모 트립신, 파파인 및 카 텝신 B / G에 대한 억제제로서 트립신, 플라스 민, 파파인과 카 텝신 및 chymostatin에 대한 억제제 류 펩틴 트립신, 파파인 및 카 텝신 A / B에 대한 억제제. 또한, 동위 원소 펩티드 방법에 의해 회수의 향상을 평가하기 위해 유용하다. 마지막으로, 속도 오 등F 효소 - 기질 복합체 형성 효소 (펩 티다 제)의 농도에 의존하며, 기판 (펩티드 호르몬) 혈장 38 희석 형성 속도를 감소시키고 따라서 열화 (10 배 희석 미카엘에 따른 속도를 백배 감소 -Menten 반응 속도).

빠른 방법의 장점에도 불구하고, 방법의 몇 가지 한계도 인정해야한다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 시간이다. 혈액 샘플은 즉시 임상에 어려울 수있다 혈액 철수 후 RAPID 버퍼에 희석해야한다. 또한,이 방법은 더 많은 시간 소모적이며, 훈련의 높은 수준을 요구하고 또한 표준 혈액 처리보다 비싸다. 이 임상 루틴 구현하기 어려울 수 있지만, 단지 미묘한 차이가 예상되는 경우, 특히, 연구 목적을 위해 도움이 될 것이며, 따라서, 펩티드의 높은 수율이 바람직하다.

빠른 방법을 설명하고 모든 구성 요소를 권장하지만 본 논문에서 (R educed 온도하는 cidification, P 내가 외생 컨트롤 및 D의 ilution을 sotopic, 억제를 rotease), 미래의 연구는이 기술의 수정을 사용할 수 있습니다. 동위 원소 외인성 컨트롤의 사용은 필수 따라서 펩타이드 신속한 처리를 사용하여 복구에서 가장 큰 개선을 표시하는 평가하기 위해 파일럿 연구에 한정되지 않을 수 있습니다. 다른 펩티드가 평가 될 때 더욱이, 또한 프로테아제 억제제 칵테일의 조성은 변경 될 수있다. 새로운 펩티드 측정 그러나,이 시험되어야한다.

요약하면, 피 처리 RAPID 방법은 인간의 혈액 사용 크게 표준 혈액 처리에 비해 시험 9/9 펩타이드의 회수를 향상시킬 수있다. 복구의 온화한 개선 극히 일부 펩티드 때문에 필요성을 관찰방법의 새로운 펩티드 분석 때 테스트 될 수있다. 아실 그렐린 위해 도시 또한 상당히 표준 혈액 처리에 비해 이러한 kisspeptin 같은 내인성 펩티드의 순환 수준의 수율이 증가함에 따라 또한 RAPID 방법은 올바른 형태의 분자의 검출을 허용한다. 따라서,이 방법은 예를 들어, 펩타이드 수준을 순환 평가 인간 연구에 유용한 도구가 될 것이다. 배고픔과 포만감의 조절에 관여하는.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

이 작품은 교육 및 연구 03IPT614A (CG)에 대한 독일 연구 재단 STE 1765 / 3-1 (AS)와 독일 정부에 의해 지원되었다. 우리는 조직과 인체 측정의 실행에 대한 도움말은 라인 하르트 Lommel와 페트라 BUSSE 우수한 기술 지원뿐만 아니라 카린 요한슨과 크리스티나 Hentzschel 감사합니다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

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