A Monte Whole
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

Published 3/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é uma técnica que permite a resolução espacial das moléculas de ácidos nucleicos (ARNs mensageiros) muitas vezes dentro de uma preparação de tecido 'todo de montagem ", ou fase de desenvolvimento (tais como um embrião ou larva) de interesse. WMISH é extremamente poderoso, pois pode contribuir significativamente para a caracterização funcional de genomas metazoários complexos, um desafio que está se tornando mais um gargalo com o dilúvio de dados de sequências de próxima geração. Apesar da simplicidade conceptual da técnica muito tempo é muitas vezes necessária para optimizar os vários parâmetros inerentes às experiências WMISH para novos sistemas de modelo; diferenças subtis nas propriedades celulares e bioquímicas entre tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento significa que um único método WMISH pode não ser apropriada para todas as situações. Temos desenvolvido um conjunto de métodos WMISH para o modelo de gastrópode Lymnaea stagnalis reemergentes que geram consistente esinais WMISH claras para uma variedade de genes, e em todos os estágios de desenvolvimento. Estes métodos incluem a atribuição de larvas de idade cronológica desconhecido para uma janela ontogênica, a remoção eficaz dos embriões e larvas das suas cápsulas de ovos, a aplicação de um tratamento de proteinase-K apropriado para cada janela ontogênica, e hibridação, de pós-hibridação e imunodetecção passos. Estes métodos proporcionam uma base a partir da qual o sinal resultante para um dado transcrito de ARN pode ser adicionalmente refinado com ajustes específicos de sonda (sonda principalmente a concentração e a temperatura de hibridação).

Introduction

Os moluscos são um grupo de animais que mantêm o interesse de uma ampla diversidade de disciplinas científicas. Apesar da sua diversidade morfológica 1, riqueza de espécies (perdendo apenas para os artrópodes em termos de número de espécies 2) e relevância para uma ampla gama de comerciais 3, médicos e científicos 4 questões 5-8, há relativamente poucas espécies de moluscos que podem reivindicar a ser ambos os modelos científicos bem equipados e fácil de manter em um ambiente de laboratório. Um molusco que é muito usado por disciplinas como a neurobiologia 9, ecotoxicologia 10 e, mais recentemente, a biologia evolutiva 11,12, é Lymnaea stagnalis, principalmente devido à sua ampla distribuição e extrema facilidade de manutenção. Apesar de sua popularidade como um organismo "modelo" e sua longa história de uso por biólogos do desenvolvimento 13-19, o alcance e poder de ferramentas moleculares disponíveis para a L. stagnalis comunidade científica encontra-se muito atrás da de modelos mais tradicionais de origem animal (Drosophila, rato, ouriço do mar, nemátodos).

O nosso desejo de desenvolver Lymnaea como um modelo molecular surge do interesse nos mecanismos moleculares que orientam a formação de shell. Isso nos motivou a refinar um conjunto de técnicas que permitam a visualização eficiente, consistente e sensível da expressão de genes durante o desenvolvimento de Lymnaea. Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é amplamente utilizado para uma variedade de organismos-modelo e tem sido usado por mais de 40 anos 20. Nas suas diferentes formas, ISH pode ser empregue para localizar espacialmente loci específicos nos cromossomas, ARNr, ARNm e micro-ARN.

Um dos desafios que precisávamos para resolver antes da refinação um método WMISH para L. stagnalis foi a questão do cuidado e de forma eficiente extração embriões e larvas de diferentes estágios de tele cápsulas de ovos em que são depositadas. Esta extracção, ou 'desencapsulamento', tem de ser conseguida de forma eficiente, a fim de recolher o material adequado para uma determinada experiência in situ, enquanto, ao mesmo tempo mantendo a integridade morfológica e celular. Enquanto outros organismos modelo também submetidos a um desenvolvimento encapsulado, em nossas mãos nenhum dos métodos descritos para as espécies poderia ser empregada com sucesso em L. stagnalis.

Os objetivos gerais deste método são, portanto: para extrair L. stagnalis embriões e larvas de suas cápsulas em uma forma de alto rendimento, para aplicar tratamentos pré-hibridação que optimizam o sinal WMISH, para preparar embriões e larvas com WMISHsignals satisfatórios para a imagem latente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: Os passos seguintes descrevem o nosso método para a realização de uma experiência in situ em estágios embrionários e larval de L. stagnalis. Quando uma etapa envolve o uso de um produto químico perigoso o facto é indicado pela palavra "CUIDADO" e todos os procedimentos de segurança adequados devem ser adoptadas. Links para folhas de MSDS representativos para os produtos químicos perigosos são fornecidos no Documento Suplementar 1. Receitas para todos os reagentes são fornecidos no Documento Suplementar 2.

1. Montagem de Decapsulation Apparatus

  1. Para fazer isso, ligar uma seringa descartável ml 20 a tubagem de silicone (com um diâmetro interior de 1 mm e um diâmetro externo de 3 mm) usando um corte de ponta P1,000 para um comprimento adequado, como mostrado na Figura 2A.
  2. Tape uma lâmina de microscópio padrão a uma grande placa de Petri invertida. Tape o tubo de silicone imediatamente adjacente à lâmina de microscópio, como mostrado na figura60; 2C e 2D.
  3. Descansar uma agulha de vidro puxado sobre a lâmina do microscópio e suavemente inseri-lo no tubo de silicone até que a ponta da agulha fica saliente cerca de 20% do caminho através do diâmetro interior do tubo (ver figura 2C e 2D). Uma vez que a agulha se encontra na posição de fita-o para baixo para a placa de Petri.
  4. Permitir que a extremidade livre do tubo de silicone para descansar na outra placa de Petri que irá recolher o material desencapsulado.

2. Amostra Recolha, Fixação e Decapsulation

NOTA: Todos os passos são realizados à TA, a menos que indicado de outra maneira.

  1. Recolher cuidadosamente cordas de ovos de as paredes de um aquário. Para fazer isso, use um pedaço de plástico flexível como uma espátula para raspar a cadeia de ovo fora do substrato, e usar um coador de chá de plástico para pescar a cadeia de ovo flutuando para fora da água. Fase e ordenar o material sob um microscópio usando o guia proporcionado na Figura1.
  2. Coloque a cadeia de ovo em uma toalha de papel e fazer uma incisão longitudinal ao longo da massa de ovos usando a pinça pluma. Rolar as cápsulas de ovos para fora da cadeia de ovo e remover o máximo do material gelatinoso possível de cada cápsula, empurrando-os em torno da toalha de papel usando a pinça pluma.
  3. Usando a pinça pluma, transferir as cápsulas de ovos em uma placa de Petri contendo 5 ml de água da torneira. Continuar a recolher cápsulas de ovos gelatinoso-de dos estágios de desenvolvimento desejados para este prato. Recolher cápsulas suficientes de todos os estágios de desenvolvimento para o experimento WMISH planejado seguida, avance para a próxima etapa.
  4. Ao trabalhar com larvas mais desenvolvidas (5 dias após a primeira clivagem (CPFD) e mais velhos) anestesiar-los antes da fixação.
    NOTA: Isso vai evitar que os músculos se contraiam o que torna a interpretação dos em padrões de coloração in situ muito difíceis.
    1. Relaxe larvas (enquanto eles ainda estão em seu capsules) em uma solução a 2% w / v de MgCl2 • 6H 2 O durante 30 min antes da fixação.
    2. Avaliar o grau de relaxamento após 30 min, submergindo várias larvas enquanto ainda em suas cápsulas de ovos na solução fixadora e monitorar a sua resposta sob um microscópio. Incompletamente larvas relaxado será recolhido em seus escudos, enquanto as larvas totalmente relaxado não vai responder. Uma vez que estas larvas foram relaxadas avançar para a próxima etapa.
  5. Transferir as cápsulas de ovo usando uma pipeta de orifício largo para um tubo de plástico selável que fornece 10 vezes o volume das cápsulas de ovo (por exemplo., 1 ml de cápsulas liquidados exigiria um tubo 10+ ml).
  6. Aspirar o máximo de líquido possível do tubo e substitua com um volume de solução de fixação que é 10 vezes o volume das cápsulas de ovos liquidados. Gire gentilmente as cápsulas de ovos em fixador à TA, durante o tempo apropriado para cada estágio de desenvolvimento (veja a Figura 1).
  7. Discontinrotação ue e permitir que as cápsulas para afundar e aspire a solução fixadora em um recipiente adequado de lixo.
  8. Lavam-se as cápsulas de ovos, substituindo a solução fixadora com tampão fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBTw) e rodando à TA durante 5 min. Aspirar o PBTw e repetir duas vezes.
  9. Remover os embriões e larvas das suas cápsulas utilizando o aparelho (ver secção 1 para detalhes) mostrado na Figura 2. Desenhar as cápsulas para a seringa de 20 ml, conectar o tubo e depois dissipar as cápsulas através da tubagem e passado a agulha de vidro para fora o prato coleção.
    NOTA: Normalmente, a maioria (> 90%) de todas as cápsulas devem precisar apenas uma passagem através do dispositivo. Em muitos casos, a membrana de cápsula é danificado mas embriões e larvas permanecem no interior da cápsula rompida. Reprocessar este material, simplesmente puxando-o para dentro da seringa e dissipando-lo novamente.
  10. Coletar os embriões descapsulados e larvas em um tubo de 1,5 ml usando um microfoneropipette (a P20 para o 0 - 3 dias larvas de idade, e uma P200 para larvas mais velhas com a extremidade da ponta cortada).
    NOTA: Uma pausa (até vários meses) no protocolo podem ser feitas nesta fase. Se isso for necessário, o material decapsuled deve ser recolhido num tubo de 1,5 ml para armazenamento (continuar para o próximo passo). Caso contrário, continue imediatamente o Protocolo nº 3.
  11. Permitir que os embriões e larvas de afundar para o fundo do tubo e aspirar o sobrenadante. Substitua com 33% de etanol (EtOH) em PBTw e deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 66% de EtOH em PBTw e 100% EtOH. Lavar as larvas duas vezes em 100% de EtOH à TA. Armazenar o material a -20 ° C em EtOH a 100%.
  12. Quando estiver pronto para continuar, re-hidratar as amostras por remoção do EtOH 100% e substituindo com 66% de EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 33% EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Finalmente lava-se com 3 x 5 min lavagens de PBTw para garantir que todo o EtOH é removido.

3. Proteinase-K, TEA e Pós-fixation

NOTA: Encontramos executando as seguintes etapas em pequenos cestos com um piso de malha o método mais eficiente e suave para a troca rápida de soluções críticas de tempo. Embora possa ser feito em casa, usamos cestas (tamanho médio) que são compatíveis com a manipulação de líquidos robô Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tais cestos podem ser rapidamente e facilmente movido entre as cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 12 (TCD), a fim de soluções de troca, ou a solução pode ser aspirado do poço utilizando uma pipeta. Alternativamente, todas as trocas de solução pode ser realizada sem estes cestos simplesmente por aspiração do sobrenadante a partir das larvas. Neste caso, um movimento rotativo suave irá concentrar-se todos os embriões e larvas para o centro do prato, permitindo-se o sobrenadante para ser removida a partir da borda do poço. O seguinte assume que o usuário está empregando cestas para as trocas de solução.

  1. Usando uma pipeta, Transferência de embriões e larvas para um cesto de sentado num TCD 12 poços com 2 ml de PBTw.
    NOTA:. O número de embriões e / ou larvas que podem ser adicionados depende do estágio de desenvolvimento a ser investigado, no entanto, uma regra geral é manter pelo menos 25% do espaço livre de embriões / larvas (ou seja, não sobrecarregar o cesto).
  2. Prepara-se uma adjacente bem com 2 ml de solução de proteinase-K apropriado (ver Figura 1), e mais 2 poços com 2 ml de 0,2% de glicina cada. Mover cada cesto para o poço contendo a concentração apropriada de proteinase-K e começar imediatamente a distribuição.
  3. Após 10 min mover cada cesto dentro de um poço que continha 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Em seguida, mover cada cesto para o segundo poço com 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Lavar a Glycine com 3x 5 mínimo de trocas de 3 ml PBTw.
  4. Remover a solução PBTw e tratar as amostras uma vez com recentemente preparada Trietanolamina (TEA) Solution por 5 min CUIDADO! Não agite. Substituir com 3 ml de solução de chã recentemente preparado, durante 5 min. Não agite. Aspirar a maioria da solução de chá a partir das amostras. Adicione o Triethanolamine preparada na hora com uma solução de anidrido acético (TEAAA) e incubar por 5 min. CUIDADO! Não agite.
  5. OPCIONAL - Enquanto o passo acima é a incubação, preparar um outro novo lote de solução de TEAAA e repita o passo acima.
    NOTA: Este segundo tratamento com TEAAA é opcional, mas pode ajudar a eliminar completamente todo o fundo com sondas propensas a gerar fundo.
  6. Remover a solução TEAAA, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Não agite. Remover o PBTw e aplicar 3 ml de formaldeído a 3,7% em PBTw. Agite suavemente, ocasionalmente, durante uma incubação de 30 minutos.
  7. Remover o fixador, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Transferir o material para um tubo de 1,5 ml. REColoque PBTw o tampão de hibridação com e incubar durante 5 min à TA - CUIDADO.
  8. Colocar os tubos em um bloco quente, à TA, e ajustar a temperatura para a temperatura de hibridização desejado.
    NOTA: A temperatura de hibridização é sonda específica e terá de ser empiricamente optimizadas, no entanto, achamos 55 ° C até ser uma boa temperatura para inicialmente ensaio. Permitir que o bloco de vir até à temperatura de hibridação, e permitir que as amostras de pré-hibridação durante aproximadamente 15 minutos (isto é, o tempo necessário para preparar as ribossondas, já não é necessária). Prepare os volumes adequados (geralmente 100? L) de ribossondas diluído. Nós concentrações de sonda tipicamente de teste de 100 e 500 ng / ml como uma primeira série. Nós preparamos riboprobes de acordo com a 12.
  9. Remover o tampão de hibridação a partir das amostras e adicionar a sonda em tampão de hibridização para as amostras. Sobreposição com 100 ul (ou um volume adequado de modo a formar uma fase acima da-manhã de hibridaçãor), do óleo mineral.
    NOTA: O óleo mineral impede extensa condensação que formarão durante o passo de hibridização longa. Extensa condensação irá alterar de forma significativa tanto a composição química da solução de hibridação e a concentração da sonda.
  10. Desnaturar a sonda e o alvo de ARN por aquecimento das amostras a 75 ° C durante 10 min, em seguida, reduzir o calor para a temperatura de hibridização desejado. Permitir a hibridação prosseguir durante um mínimo de 12 hr (S / N) ou mais longos (24 - 48 h).
  11. Durante a hibridação remover um único tubo do bloco de calor, girá-lo rapidamente entre o polegar eo indicador para suspender as larvas sem perturbar a fase de óleo, e substituí-lo no bloco de calor. Repita este uma vez a cada 6-12 horas ou assim.

4. Hot Lava e imunodetecção

NOTA: Enquanto nós usamos um robô de manipulação de líquido para as etapas seguintes, estes também podem ser facilmente feito manualmente. Neste caso, embriões e larvas should ser mantido nos tubos de 1,5 ml foram hibridizadas em. Todas as trocas de solução subsequentes são aspirado e adicionado com uma pipeta P1,000. Quando realizada manualmente cada um dos passos que se seguem devem empregar 1 ml de cada solução.

  1. os volumes adequados de calor (3 ml cada uma para cada amostra) do 4x, 2x e 1x soluções de lavagem à temperatura de hibridação.
  2. Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 4x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 2x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em 1X tampão de lavagem durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação.
  3. Lavar uma vez com todas as amostras de tampão 1x Cloreto de sódio Citrato de sódio + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% de Tween) à temperatura de hibridação. Deixar as amostras de arrefecer até à TA.
  4. Lave todas as amostras duas vezes em 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Substitua esta solução SSC 1x com tampão de ácido maleico (MAB) e deixe descansar por 10 min Repita o MAB wcinza. Substituir o MAB com solução de bloqueio e incubar durante 1,5 h.
  5. Trocar a solução de bloqueio para solução de anticorpos (1: 10000 de anticorpo numa solução de bloqueio) e incubar durante 12 horas (O / N) à temperatura ambiente com agitação suave.

5. Desenvolvimento de cores e de montagem

  1. Aspirar a solução de anticorpos e lavagem 15 vezes com PBTw durante 10 min cada. Substituir PBTw com 1x tampão de fosfatase alcalina (AP) e incubar durante 10 min.
  2. Enquanto o passo de incubação acima receitas, preparar a solução de coloração AP (ver Documento Suplementar 2) - CUIDADO. Transferir o material em um TCD poço e substitui a solução de AP 1x com solução de coloração de AP. Note-se a tempo de forma que o período de tempo a cor da reacção tem lugar durante pode ser gravada. Monitorar o desenvolvimento do padrão de coloração até que o sinal à relação de fundo é óptima.
  3. Para parar o desenvolvimento da cor, remova a solução de coloração 1x AP (descarte na estavas apropriadae container), e aplicar 2 ml de PBTw e observe o tempo agora. Lavar mais duas vezes com PBTw durante 5 minutos cada. Usar um destes enxaguamentos para transferir o material para um tubo de 1,5 ml.
  4. Remover o PBTw e aplicar 1 ml de 3,7% de formaldeído em PBTw e agita-se ou rodar em menos de 30 min à temperatura ambiente (isto pode também ser feito S / N).
  5. Lavar o fixador com 3 lavagens de PBT (descartar o fixador de resíduos em um recipiente adequado de lixo). Lavam-se as amostras 3 vezes a 50 ° C em água desionizada.
    NOTA: Estas lavagens eliminar a precipitação de sais que podem tornar-se visível durante a limpeza e as etapas de visualização.
  6. Decidir se as amostras devem ser montados em benzoato de benzilo: Álcool benzílico (BB: BA, também conhecido como clara de Murray) ou glicerol.
    NOTA: Nós preferimos o mais poderoso agente de compensação BB: BA como L. stagnalis embriões são um tanto opaca. As amostras a serem montados no BB: BA primeiro precisa ser desidratado através de uma série de etanol. As amostras a ser montada em 60%O glicerol pode ser montado imediatamente.
  7. Transferir as amostras para dentro da solução de montagem (BB: BA ou 60% de glicerol) utilizando uma pipeta.
    NOTA: Ao montar no BB: BA isso deve ser feito em um copo bem (BB: BA vai derreter o plástico policarbonato).
  8. Permitir que as amostras para limpar para 5 - 10 min, e depois montá-los sobre uma lâmina utilizando um número apropriado de lamelas empilhados como espaçadores (1 lamela para as amostras <1 CPFD, 2 Lamelas para amostras> 1 CPFD).
    NOTA: Whole montagens agora pode ser fotografada usando um microscópio composto com DIC óptica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os padrões de coloração WMISH representante mostrados na Figura 3 foram geradas utilizando a técnica acima descrita, e refletem uma variedade de padrões de expressão espacial para genes envolvidos em uma variedade de processos moleculares que variam de formação de concha (novo gene 1, 2, 3 e 4), à sinalização célula-célula (DPP) para regulação da transcrição (Brachyury) através de uma série de estágios de desenvolvimento. Embora não tenham quantificado os níveis destes genes espera-se que eles também faria expressão variar significativamente, indicando que o método pode ser aplicado de encontro a uma ampla variedade de produtos de genes expressos em todas as fases de desenvolvimento em vários níveis. Apenas um dos genes aqui apresentados (DPP), foi anteriormente descrito em L. stagnalis 21,22. Os resultados que apresentamos aqui são em grande parte de acordo com os relatórios anteriores, mas com significativamente maior reso espacial lução. O padrão de expressão espacial de Brachyury foi descrito no olmo 23 e 24 de lapa e em ambos os casos também foi detectado em células do manto como encontramos para L. stagnalis (Figura 3F). Nós isolado genes Novel 1-4 (de um ecrã proteômica projetado para identificar produtos de genes diretamente envolvidos na formação da casca, e assim por seus padrões de expressão espaciais associadas com a glândula shell (Figura 3A e B) ou o campo shell (Figura 3C e D) são totalmente congruentes com as funções de formação de casca. Estes resultados indicam que a técnica de transferência de alta temos desenvolvido para a remoção de embriões e larvas da cápsula de ovo, e os subsequentes tratamentos de permeabilização específico de fase, gerar amostras inteiras de montagem que vai produção de alta qualidade de coloração in situ padrões para uma vasta variedade de genes para todas as fases do desenvolvimento embrionário e larval.

ove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> figura 1
Figura 1. Um Resumida ontogenia de Lymnaea stagnalis e fixação correspondente e proteinase-K tratamentos. Imagens representativas de embriões e larvas de os primeiros 7 dias de desenvolvimento ilustram um aumento significativo no tamanho (linha 1) e da complexidade morfológica (linhas 2 e 3) . Estas mudanças de desenvolvimento se traduzem em grandes diferenças no tempo de fixação apropriado e as concentrações de proteinase-K, que geram sinais WMISH óptimas. Para WMISH todas as etapas devem ser fixados em 3,7% de formaldeído em PBS à temperatura ambiente com agitação suave dentro de suas cápsulas de ovos. Todas as fases devem ser, em seguida, tratado com a concentração apropriada de proteinase-K durante 10 minutos. Note que observamos significativa variação inter-lote na atividade de proteinase-K do nosso fornecedor. Esta variação deve ser explicada por performing um ciclo de calibração '' WMISH experiências em que a actividade da nova proteinase-K é determinada empiricamente. As concentrações Proteinase-K indicados na figura deve, portanto, ser tratado como um guia inicial, no entanto, as concentrações relativas entre os estágios de desenvolvimento (por exemplo, 2 dias embriões velhos exigem uma concentração proteinase-K 3 vezes mais elevados do que o dia 1 embriões) são definidas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os aparelhos utilizados para Decapsule L. stagnalis embriões. (A) Uma visão geral do aparelho que pode eficientemente remover L. embriões stagnalis e larvas de suas cápsulas. (B) A ampliada vistaa área de box amarelo em (A). Uma agulha afiada vidro é colocada sobre a lâmina do microscópio e inserido no tubo de silicone (diâmetro interno de 1 mm, 3 mm de diâmetro exterior) de tal modo que a ponta se projecta aproximadamente 20% do caminho para dentro da cavidade do tubo. A agulha de vidro é então também gravadas na lâmina de microscópio e a placa de Petri. (C) A opinião de um «plano» esquemática da seção em caixa amarela em cápsulas de ovos A. contendo embriões fixos e larvas são primeiramente recolhidos utilizando a seringa de 20 ml. A seringa é, então, ligado ao tubo de silicone e as cápsulas expelido através do tubo e após a agulha. Membranas cápsula de ovo são rasgadas pela agulha eo material embrionário e larval libertada pode ser recolhida a partir do prato de coleção usando uma micropipeta. (D) Uma visão esquemática "seção transversal" da seção em caixa amarela no A. A lâmina de microscópio garante que o agulha entra no tubo de silicone na altura correta. (F) A visão representativa de larvas que fizeram uma única passagem através do aparelho. Mais de 90% do material foi removido de forma eficaz e suavemente de suas cápsulas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Imagens representativas dos padrões de expressão WMISH contra uma variedade de genes de uma série de L. . Fases stagnalis Developmental produzidas pelo método aqui descrito Todos os estágios de desenvolvimento foram processados ​​tal como descrito no método acima, tendo sido montada e fotografada em APA: BA (Murray claro). idades aproximadas são indicados no ap direito de cada painel e a orientação é indicado no canto inferior direito. ortologia Gene (quando conhecido) é indicado no canto inferior esquerdo de cada painel. Abreviaturas: glândula shell (sg); campo de shell (sf); manto (mt); pé (pé); Decapentaplégico (DPP); CPFD (dias após a primeira clivagem). Todas as barras de escala são 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O método descrito aqui permite a visualização eficiente de transcrições de RNA com presumivelmente diferentes níveis de expressão dentro de todos os estágios de desenvolvimento de Lymnaea stagnalis. Para remover embriões e larvas de suas cápsulas que trialed uma variedade de produtos químicos, choque osmótico e tratamentos físicos relatados para outra encapsulated- desenvolvimento de organismos-modelo. No entanto, nas nossas mãos o método aqui descrito, é a única técnica de alto rendimento que remove a membrana capsular difícil sem danificar os embriões e larvas. Após o desencapsulamento, o material pode ser armazenado, ou tratado com um regime específico fase de proteinase-K e, em seguida, hibridados com uma ribossonda. esforços de otimização empíricos adicionais (tipicamente focados em concentração de sonda e temperatura de hibridização) pode ser necessária para cada sonda / alvo. Estes parâmetros (além do regime de fixação e tratamentos de proteinase-K) são normalmente os parâmetros mais influentesde qualquer experiência in situ (assumindo que a qualidade do material fixo e a sonda de ARN são de um nível elevado).

A importância de um tratamento adequado Proteinase-K para o resultado final de uma experiência in situ é fundamental para L. stagnalis. Isto reflecte-se na grande variedade de concentrações de proteinase-K requeridas pelo estágios de desenvolvimento distintos (variando de 0 ug / ml a 500 ug / ml). Por isso, é importante ser capaz de atribuir uma determinada cadeia de ovo para uma janela ontogenético. Para este fim, a orientação que nós fornecemos na Figura 1 permite a realização de material de desenvolvimento de idades desconhecidas (a versão para impressão deste valor está disponível no Documento Suplementar 3 que os usuários podem achar útil ter ao microscópio quando estadiamento do material) . Nota-se que para outras espécies de gastrópodes tratamentos proteinase-K para WMISH pode ser mantido constante para uma ampla gama de desenpmental fases 8,25,26, ou podem ser inteiramente omitidas 27. Isto está em contraste com a situação em L. stagnalis. Além disso, enquanto que outros grupos de pesquisa têm relatado anteriormente os padrões de expressão de vários genes WMISH em L. stagnalis larvas (ver 22,28,29) o método que nós descrevemos aqui produz padrões de significativamente maior resolução espacial. Finalmente, observou-se significativa variação inter-grupo na actividade da proteinase-K do nosso fornecedor. Esta variação tem que ser contabilizadas através da realização de um ciclo de calibração '' WMISH experiências em que a actividade da nova proteinase-K é determinada empiricamente. Todas as experiências subsequentes com alíquotas de proteinase-K de cada lote pode, então, ser realizado livremente.

Nós previamente descrito um método WMISH alternativa para L. embriões stagnalis e larvas em outro lugar 12. Esse método detalhado da utilização do mucolytagente IC N-acetil-L-cisteína (NAC), um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) e um tratamento de pré-hibridação com sulfato de dodecil de sódio (SDS). Encontramos esses tratamentos melhorados os padrões de coloração de alguns genes para alguns estágios de desenvolvimento. A estratégia de fixação que, recentemente desenvolvido e descrever aqui (fixação larvas dentro de suas cápsulas) simplifica e agiliza as etapas necessárias para preparar o material para uma experiência in situ, e aparentemente nega a necessidade de determinar empiricamente ótimas tratamentos pré-hibridação adicionais com NAC, DTT ou SDS. Refinamentos futuras para a técnica aqui relatada poderia incluir a visualização de microRNAs (após alterações aos protocolos WMISH padrão previamente relatados 30), rotulagem dobro ou o triplo do mRNA alvo 31 e visualização fluorescente de sinais WMISH 32. Sem dúvida o maior limitação da técnica é o comprimento total de tempo que leva para ir de colectinag do material, para uma imagem digital que representa um padrão de expressão do gene determinado. Devido à natureza dos acontecimentos bioquímicos e biofísicos que devem ter lugar durante um tal processo é uma característica inerente mais em protocolos de hibridação in situ.

Lymnaea ocupa uma posição dentro do Metazoa que é extremamente sub-representados em termos de organismos modelo. Como Spiralian representante, Lymnaea pode trazer insights sobre a evolução das características morfológicas distintas, tais como formação de concha 12 e do corpo lateralidade 33-35 e é também uma valiosa neuroethology 36 e neurofisiologia modelo de 9,37. Poderosas técnicas, tais como a capacidade de visualizar de forma eficiente os padrões de expressão de genes in situ aumenta a funcionalidade de Lymnaea como um organismo modelo, e alarga a gama de perguntas que podem ser utilizados para tratar. Numa altura em que a geração de grande dat sequênciaasets (transcriptomes completos e até mesmo genomas) é relativamente de rotina, tais métodos tornam-se mais relevantes para os investigadores que pretendam interpretar o fluxo de dados de sequência de tais modelos. Enquanto Lymnaea é um gastrópode relativamente derivado 38, e possui o que seria considerado um grande genoma em comparação com outros organismos-modelo (1,22 Gb 39), tem muitas características práticas e interessantes que o tornam um sistema modelo atraente. Os métodos que descrevemos aqui expandir a caixa de ferramentas disponíveis para Lymnaea e pode ser útil para outras espécies que passam por desenvolvimento encapsulados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para DJJ por meio de projeto DFG # JA2108 / 2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Featherweight forceps Ehlert & Partner #4181119
Silicon tubing Glasgerätebau OCHS GmbH 760070
Glass capillaries Hilgenberg 1403547
12 well tissue culture dishes Carl Roth CE55.1
37% Formaldehyde Carl Roth P733.1 CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
Ethylenediamine tetraacetic acid Carl Roth CN06.3 CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation
Magnesium Chloride Carl Roth 2189.1
Tween-20 Carl Roth 9127.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium Chloride Carl Roth 3957.1
Ficoll type 400 Carl Roth CN90.1
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) Carl Roth 4607.1 CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Nuclease freeBovine Serum Albumin Carl Roth 8895.1
Salmon sperm Carl Roth 5434.2
Heparin Carl Roth 7692.1 CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH
Proteinase-K Carl Roth 7528.1
Glycine Carl Roth 3790.2
Deionised formamide Carl Roth P040.1 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Standard formamide Carl Roth 6749.3 CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.
Triethanolamine Carl Roth 6300.1 CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.
Acetic anhydride Carl Roth 4483.1 CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT
Maleic acid Carl Roth K304.2 CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.
Benzyl alcohol Sigma 10,800-6 CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.
Glycerol Carl Roth 3783.1
Blocking powder Roche 11096176001
Anti DIG Fab fragments AP conjugated Roche 11093274910
Tris-HCl Carl Roth 9090.3
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide  Carl Roth 4421.3 CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate Carl Roth A155.3 CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. 
N-acetyl cysteine Carl Roth 4126.1
Dithiothreitol Carl Roth 6908.1 CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Tergitol Sigma NP40S CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.
Sodium dodecyl sulphate Carl Roth CN30.3 CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.
Potassium Chloride Carl Roth 6781.1
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) Carl Roth 4984.1
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.1
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) Carl Roth 3580.1 CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.
Mineral oil  Carl Roth HP50.2
InSituPro-Vsi  Intavis www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218, (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53, (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343, (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50, (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58, (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15, (1), 19 (2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1, (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121, (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183, (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26, (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35, (1), 29 (1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63, (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221, (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311, (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129, (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7, (1), 160 (2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218, (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4, (1), 15 (2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49, (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11, (1), 43 (2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5, (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462, (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14, (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6, (4), e18745 (2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9, (4), e92941 (2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480, (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35, (Database issue), D332-D338 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats