Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para

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Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

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Abstract

A Drosophila melanogaster larval fenótipo caminho de comprimento é uma medida estabelecida usada para estudar as contribuições genéticas e ambientais para a variação comportamental. O ensaio de caminho de comprimento das larvas foi desenvolvido para medir as diferenças individuais em comportamento de forragem que foram depois ligados ao gene A alimentar. Larval caminho de comprimento é uma característica facilmente marcado que facilita a coleta de grandes tamanhos de amostra, a um custo mínimo, para telas genéticos. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada do actual protocolo para o ensaio caminho de comprimento larval utilizado pela primeira vez por Sokolowski. Os detalhes do protocolo como lidar com os animais de teste de forma reprodutível, realizar o ensaio comportamental e analisar os dados. Um exemplo de como o ensaio pode ser utilizado para medir a plasticidade comportamental em resposta às alterações do ambiente, através da manipulação de alimentação ambiente antes de realizar o ensaio, também é fornecido. Finalmente, o design de teste adequado, bem como fatores ambientais que podem modificarlarval caminho de comprimento, tais como a qualidade dos alimentos, idade de desenvolvimento e os efeitos dia são discutidas.

Introduction

Desde a descoberta do gene branco no laboratório de Thomas Hunt Morgan em 1910, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), tem sido utilizada como um modelo para o estudo dos fundamentos moleculares e fisiológicos de diversos processos biológicos. A popularidade de D. melanogaster em grande parte decorre da considerável quantidade e variedade de ferramentas genéticas. pequeno tamanho da Drosophila, relativa facilidade de manuseio e de geração curto tempo torná-lo um modelo ideal para estudos de genética. Igualmente importante é a capacidade de Drosophila para demonstrar muitos dos fenótipos expressas pelos organismos mais complexos, incluindo mamíferos. Isto inclui os fenótipos complexos, tais como o comportamento que se na interface entre o organismo e o seu ambiente. Como tais estudos, comportamentais sobre a mosca da fruta, têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de como os genes eo ambiente mediar comportamento1.

Um dos primeiros estudos de D. comportamento larval melanogaster investigou as diferenças individuais nas estratégias de forrageamento larvais através da medição do trajeto de comprimentos de larvas 2, enquanto a alimentação. Caminho de comprimento foi definido como a distância total percorrida por uma única larva em leveduras, dentro de um período de cinco minutos. Ambas as estirpes laboratoriais e moscas de uma população natural em Toronto variou em seus comportamentos de forrageamento e havia um componente genético para as diferenças individuais no caminho de comprimento. Duas formas de forrageamento larvas foram descritas a partir das distribuições caminho de comprimento quantitativos e eles foram chamados rover e sitter. Rovers exibem caminho mais longo de comprimentos ao atravessar uma área maior, enquanto em um substrato de alimentos do que sitters. Usando este ensaio caminho de comprimento, de Belle et al. 3 mapeou o (a) gene forrageamento subjacente a estas diferenças comportamentais individuais para um local discreto em chromosome- 2 (24A3-24C5). O D. melanogaster para o gene foi depois clonado 4 e revelou ser uma proteína quinase dependente de cGMP 5, um modulador de fisiologia e comportamento em Drosophila e outros organismos 6.

Aqui destacamos o protocolo atual para o ensaio de caminho de comprimento larval originalmente desenvolvido na Sokolowski 2. Embora alguns aspectos do ensaio mudaram ao longo dos anos, o conceito por trás do projeto não tem. Nós também fornecemos dados para ilustrar o potencial do ensaio para avaliar contribuições genéticas e ambientais para as diferenças individuais no comportamento de forrageamento de larvas de Drosophila. O ensaio caminho de comprimento larval é simples, eficiente, e ainda assim robusto. Uma única pessoa pode testar-se a 500 larvas com facilidade em quatro horas e os resultados podem ser obtidos com um elevado grau de reprodutibilidade. Desenvolvida originalmente para localizar, ele pode ser utilizado em rastreios genéticos, mapeamento locus da característica quantitativa, e em estudosde gene-a-ambiente (GxE) interações. Além disso, sua simplicidade e reprodutibilidade torná-lo um grande recurso para o ensino de graduação.

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Protocol

1. Prepare placas de uvas e garrafas Dadas para a coleção de larvas

  1. Para fazer garrafas segurando, cortar buracos em um lado do 6 oz garrafas de cultura mosca, grandes o suficiente para caber um plug frasco da mosca para a alimentação de ar (Fig. 1D).
  2. Para fazer placas de uva, preparar 250 ml de meio de sumo de uva (1,8% de agar, 45% de sumo de uva, 2,5% de ácido acético, 2,5% de etanol) à ebulição, o agar, sumo de uva e a maior parte da água, arrefecer a 70 ° C ( agitar durante o resfriamento), em seguida, adicionar ácido acético e etanol e completar o volume com água.
  3. Utilize uma seringa (sem agulha) para encher 35 x 10 mm de Petri tampas prato até que a superfície do meio de sumo de uva faz uma cúpula acima do lábio da tampa (Fig. 1A).
  4. placas de uva armazenar em um recipiente hermético úmido e a 4 ºC até à sua utilização (até um máximo de 2 semanas).

2. Preparação de placas Food

  1. Prepare receita mosca padrão alimentos.
    Nota: a TEst efeitos da qualidade da criação de alimentos no caminho de comprimento foi utilizado alimentar com baixo teor de nutrientes mosca: 10% de sacarose, 1,3% de ágar, 0,8% de tartarato de sódio e potássio, fosfato monopotássico 0,1%, cloreto de sódio 0,05%, 0,05% de cloreto de cálcio, cloreto de magnésio a 0,05%, 0,05% de sulfato férrico, 5% de levedura e 0,5% de ácido propiónico em água; e altos níveis de nutrientes alimentos mosca: 1,5% de sacarose, 1,4% de ágar, 3% de glucose, 1,5% de farinha de milho, 1% de germe de trigo, 1% de farinha de soja, 3% de melaço, 3,5% de levedura, 0,5% de ácido propiónico, 0,2% Tegosept e 1 % de etanol em água. Para ambos os alimentos autoclave a solução e arrefecer a 50 ° C antes de adicionar o ácido propiônico, Tegosept e etanol.
  2. Despeje 40 ml de alimentos mosca em 100 x 15mm placas de Petri.
  3. placas de alimentos armazenar em um recipiente hermético úmido e a 4 ºC até à sua utilização (até um máximo de 2 semanas).

3. Prepare placas de teste

  1. Prepare 58 x 25 cm, 6 mm de espessura placas de acrílico preto com 10, 1 mm poços circulares de profundidade, 10 cm de diâmetro e dispostos de 2 x 5 design (Fig. 1C) para testar em larvas.
    Nota: até 30 larvas podem ser testados em um momento se três ou mais das placas de Plexiglas acima estão disponíveis. Alternativamente, as larvas podem ser testadas em placas de Petri, de 10 cm de diâmetro. Esta opção é muito mais laboriosa e permite menor número de larvas a serem testados.
  2. Obter um preto 39 x 8 cm, 6 milímetros de espessura Plexiglas espalhador para espalhar a pasta de leveduras sobre as placas de teste de Plexiglas.
  3. Prepare 100 x 15 mm tampas placa de Petri para a gravação de larvas de caminho-comprimentos, separando tampas de fundos com antecedência.

4. Criação de populações parentais

  1. Mantenha condições de criação constante durante todo o ensaio (por exemplo, 25 ºC, 60% de umidade e luz 00:12: ciclo escuro em alimentos mosca standard).
  2. Levante população parental em condições mesmas de criação.
  3. Colete 100 - 150 do sexo feminino e 50 - 75 do sexo masculino e idade-los por 5 ± 1 dias para fecundidade ideal.
  4. permitir females e machos para acasalar durante a noite em uma garrafa de cultura mosca 6 oz com alimentos mosca padrão.
  5. Transferência de moscas em uma garrafa de exploração e garantir uma placa de uva (uma pequena quantidade de pasta de levedura fresca na placa de uva irá promover a postura de ovos; A Fig. 1B) sobre a parte superior com fita adesiva (Fig. 1E).
  6. Deixar garrafas em pé de cabeça para baixo (Fig. 1F), com a placa de uva na parte inferior para permitir que os adultos para colocar ovos na placa de uva.
  7. Rejeitar a primeira placa de uva depois de 24 horas e colocar uma nova placa de uva na garrafa exploração. Esta será a placa de uva a partir do qual as larvas são recolhidas no dia seguinte.
    Nota: placas de uvas terão de ser apuradas de larvas de 22 horas depois de ser criada, configurar as placas de modo que possam ser apuradas início dia seguinte (. Por exemplo, configurar placa às 12 horas e clara às 10 horas do dia seguinte). É aconselhável descartar a primeira placa de uva para evitar todos os ovos que as fêmeas poderiam ter sido retido na fonte e thaT pode ser avançada em desenvolvimento.

5. Recolher L1 (primeiro estádio) Larvas de placas de uva

  1. Remover placas de uva de garrafas de 22 horas depois de terem sido criados e coloque em um 60 x 15 mm placa de Petri.
  2. Colocar uma nova placa de uva com pasta de fermento fresco no frasco exploração.
  3. Limpar e descartar todas as larvas a partir da placa de uva sem sementes, utilizando uma sonda de dissecação.
  4. Incubar apagada placas de uva durante 4 horas em condições normais.
  5. Após 4 horas, escolher 100 L1 larvas por tensão das placas de uva e coloque em pratos de comida.
    1. Coloque as larvas no alimento com cuidado (sem perfurar a comida e enterrando as larvas) e evitar aglomeração, distribuindo as larvas ao longo da placa de alimentos.
  6. Incubar as placas de comida até animais de teste são aproximadamente 10 horas antes do início do errante.
    Nota: A 25 ºC, 10 horas antes de passear geralmente corresponde a 72-96 horas após a eclosão. o EXACt quantidade de tempo de incubação deve ser determinado antes do início do experimento através da recolha de um conjunto inicial de larvas para cada estirpe e gravar o número de horas até o início da vagando (larvas vagando irá se mover para fora do alimento para os lados e tampa do alimento pratos).
    Nota: Se for necessário, os mesmos pais podem ser usadas para recolher larvas durante 3 - 4 dias de testes, repetindo os passos 4,7-5,5. Alterar a ordem em que as estirpes são criados e testados através dias para evitar um efeito de ordem de teste no caminho de comprimento. Teste a mesma estirpe "controle" / cepas cada dia de testes para controlar os efeitos dia.
  7. Se muitas estirpes são testadas, escalonar os definidos acima e recolha vezes das larvas para permitir o teste de cada estirpe no ponto de tempo apropriado mais tarde.

6. Teste de passagem de comprimento larval

  1. Dissolva o fermento de padeiro seca-activo em água numa proporção de 1: 2 proporção (em peso por volume). A pasta de levedura terminou deve ser mais fino do que pancake massa, de uma maneira que ao levantar uma colher para fora da pasta, goteja e deixa para trás fitas sobre a superfície da pasta que rapidamente derreter.
    Nota: A consistência da pasta de levedura é importante e deve ser constante ao longo da experiência. A exata de levedura: proporção de água pode ter que ser ajustado, dependendo da marca e lote de levedura.
  2. Suavemente escolher larvas da primeira estirpe a ser testado a partir da placa de alimentos usando um pincel.
  3. Recolhe larvas numa placa de Petri e lavar cuidadosamente com água para remover todos os alimentos.
    1. lavar rapidamente larvas com 1 - 2 ml de água e delicadamente dab larvas seco com um laboratório wipe para evitar a transferência de toda a água ao colocar as larvas na placa de teste. Para evitar o estresse, manter larvas úmido, mas não submerso em água.
  4. Organizar três placas de teste lado a lado e definir a 5 min temporizador para cada placa de teste.
  5. Aplicar pasta de levedura para o topo das placas de teste usando o espalhador e, se espalhar um leigo finaer de pasta de levedura em cada placa de ensaio de modo que todos os poços tem uma camada uniforme de levedura.
  6. Suavemente colocar uma larva no centro de cada poço, a partir do temporizador 5 min após a colocação do primeiro larvas em cada placa. Nota: Três pratos pode ser feito ao mesmo tempo, obtendo-se um tamanho de amostra de 30 dias / estirpe / teste, até um total de 500 larvas.
  7. Colocar uma tampa de placa de Petri por cima de cada poço.
  8. Quando o tempo se esgota, sem necessidade de remover as larvas a partir da placa, inicie traçando o caminho de comprimentos deixados para trás na levedura usando um marcador permanente. Rastrear caminho de comprimentos na mesma ordem que as larvas foram colocadas sobre as placas de teste.
    1. Executar o rastreio com a mesma velocidade como larvas foram colocadas nas placas. Para consistência na análise de dados posteriormente, use o mesmo marcador para todos os caminho de comprimentos. marcador permanente é recomendado.
  9. Repita os passos 6.2 a 6.8.1 para cada estirpe a ser testado. Escolha cada cepa do alimento imediatamente antes do teste para evitar os efeitos de fome no paTH-comprimento.

7. Food Privação

  1. Se as larvas estão a ser privados de alimentos antes do teste, recolher larvas, tal como descrito nas etapas 6.2 e 6.3, mas a quantidade desejada de tempo de privação alimentar anterior (por exemplo., Se larvas devem ser privados de alimentos durante 4 horas, recolher larvas de 4 h antes de tempo de ensaio).
  2. Divide larvas lavado em dois grupos e colocar o grupo privados de alimentos em uma placa de Petri de 60 x 15 mm com 5 ml de agar a 1% e o grupo de controlo numa placa de Petri com 5 ml de comida padrão.
  3. Coloque um peso em cima da tampa invertida das placas de Petri (caso contrário, as larvas são capazes de arrastar para fora na busca de alimento).
  4. Incubar durante o período de privação de alimento previamente estabelecido e prosseguir com ensaios, tal como descrito nas etapas 6.2 a 6.9.
  5. Se muitas estirpes estão a ser testados, escalonar a privação de alimento começam vezes para permitir o teste de cada estirpe no ponto de tempo apropriado.

Análise 8. Dados

Nota: Esta secção descreve um método para a análise dos dados utilizando o ImageJ 7 ou 8 Fiji para processamento de caminho de comprimentos, apesar de outro software pode ser utilizado.

  1. Use uma mesa de luz para transferir todas as caminho de comprimentos rastreados desde o tampas prato de Petri com papel branco (tampas podem ser lavados com etanol e reutilizados para outras gravações caminho de comprimento).
  2. Seguir a uma linha de referência direita 50 mm em uma das folhas de papel.
  3. Digitalizar o trajeto de comprimentos com uma resolução de 300 dpi e salvar como arquivos de imagem bitmap ou tiff.
  4. Abra o arquivo de imagem, selecione a guia "Processo"> "Binary"> "Fazer binário". Em seguida, na guia "Processos", selecione "Binary"> "esqueletizar". Isso produz uma linha de largura de um pixel, independentemente da espessura do traço.
  5. Certifique-se de cada caminho de comprimento aparece como uma única linha contínua, sem cruzamentos.
  6. Separar quaisquer cruzamentos usando o "li Heterone ferramenta "e colorindo a linha branca (a continuidade do caminho pode ser verificado com o" (rastreamento Wand Tool "), todo o caminho deve ser destacado amarelo (Fig. 2).
  7. Selecione a opção "Analisar" guia> medições Definir e selecione "Perímetro" e "etiqueta Display".
  8. Selecione a aba "Analyse"> "Definir escala" e selecione "Remover escala".
  9. Na imagem, selecione a linha de referência única, selecione a guia "Analyse"> "partículas Analisar" e selecione "Mostrar: Contornos", "Mostrar resultados" e "table Limpar resultados". Nota: A saída irá mostrar o número de pixels correspondente à linha de escala de 50 mm.
  10. Selecione "Analyse" tab> "escala de Ajuste" e preencha o número de pixels em "Distância em pixels" e a distância correspondente (50 mm) em "distância conhecida".
  11. Por fim, selecione todos os desenhos caminho de comprimento de um genótipo de umtempo ta, selecione a guia "Analyse"> "partículas Analisar" e selecione "Mostrar: contornos", "Mostrar resultados" e "table Limpar resultados".
    1. Remova as eventuais etiquetas escritas ou marcações estranhas óbvias (que será reconhecido como caminho-comprimentos) dentro da área selecionada, selecionando a área e enchendo-a de branco.
  12. inspecionar visualmente o arquivo de saída "Esboços" para garantir os perímetros foram correctamente apurado. A saída irá mostrar um caminho de comprimento em mm para cada desenho caminho de comprimento na selecção. Isso pode ser facilmente exportados para uma planilha e analisados ​​com qualquer software estatístico.

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Representative Results

As diferenças de caminho de comprimento da sonda e acompanhante para as estirpes e o efeito de privação de alimento no caminho de comprimento são ilustrados na Fig. . 3 Os dados recolhidos ao longo de três dias consecutivos de testes mostraram um efeito significativo tensão (F (1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16; A Fig. 3A), com rovers viajar mais longe do que sitters. Além disso para o efeito de deformação, houve também um efeito significativo de tratamento de alimentos (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16; A Fig. 3A), com larvas que foram privados de alimentos durante quatro horas antes do teste tendo significativamente mais baixos de caminho-comprimentos do que larvas alimentadas. Além disso, a ANOVA mostrou uma pressão significativa pela interação tratamento (F (1,423) = 9,78, p = 2 x 10 -3), significado rovers e sitters respondeu a privação de alimentos em diferentes graus.

"Fo: manter-together.within-page =" 1 "> Embora os dados acima também mostrou um efeito significativo do dia do teste (F (2,420) = 7,22, p = 8 x 10 -4; Fig 3B - 3C.) Há houve pressão significativa pela interação dia (F (2,846) = 2,32, p = 0,10), o que significa que os dias afetados rovers e assistentes semelhante. no entanto houve um dia significativo pela interação tratamento (F (2,420) = 8,07, p = 4,00 x 10 -4), mostrando que o efeito do tratamento variou entre os dias. a qualidade do alimento criação também teve um efeito significativo no trajeto de comprimentos (fig. 4). trajeto de comprimentos totais foram mais quando larvas de ambas as estirpes foram criadas em nossa alta alimentos de nutrientes em comparação com alimentos de baixa de nutrientes (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16) diferenças. Rover-sitter no entanto foram ainda mantida, apesar da qualidade dos alimentos durante a larvicultura (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Efeitos dos dias que foram significativa (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) foram incluídos no modelo estatístico. Além disso, houve uma significativa pressão por dia interacção (F (1,704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), bem como um alimento significativo por interacção dia (F (1,704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).

Finalmente, é importante notar que as diferenças Rover-Sitter relativos foram significativas entre os efeitos dia, de qualidade alimentar e de privação alimentar, mas que as medições de caminho de comprimento absolutos diferiram entre os dias e tratamentos. Estes resultados não só sublinham a robustez do ensaio caminho de comprimento larval, mas também a importância do controle de condições de criação, correndo todas as estirpes / tratamento dos juros em cada dia de testes, e factoring em efeitos de um dia para as análises.

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Figura 1. Preparação de frascos de Detenção e placas de teste. (A) placas de uvas para a postura de ovos deve ser preenchido acima da borda para formar uma cúpula suave da mídia. A adição de uma pequena quantidade de pasta de levedura fresca (B) promove a postura de ovos. Placa de teste (C) Plexiglas com gumes em poços e espalhador. (D) Fly frasco de cultura com furo cortado dentro para suprimento de ar. Depois de transferir a população dos pais para a garrafa de cultura, placas de uva deve ser montado sobre a abertura com fita adesiva (E) e as garrafas devem ser posicionados com a placa de uva no fundo (F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

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Figura 2. Análise de Imagem de traça o caminho de comprimento complicado. Caminho de comprimentos onde as larvas foram cruzados sobre o seu próprio caminho deve ser separado manualmente no cruzamento para gerar uma única linha contínua. (A) mostra um exemplo de três caminho de comprimentos digitalizados, com uma seta vermelha apontando no ponto de intersecção da parte superior caminho de comprimento. (B) mostra o mesmo caminho de comprimento editada em ImageJ para separar o cruzamento. (C) Mostra o ImageJ perímetro de saída do caminho de comprimento cruzando, com apreciação errada do perímetro do caminho 1 devido ao cruzamento. (D) Mostra o ImageJ perímetro de saída do arquivo editado com o cruzamento clivada e avaliação correta do perímetro do caminho de comprimento 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3. Fed e privados de alimentos Rover e Sitter larval Caminho de comprimentos caminho de comprimento larval (milímetros ± SEM) para rovers e assistentes, demonstrando:. (A) em pool de caminho-comprimentos para larvas privados de alimentos alimentados e 4 h mais de três períodos consecutivos dias de testes, 105 <N <120; (B) do Fed larvais de caminho-comprimentos de dia 38 <n <40 por dia; e alimentação (C) 4 h privados larvais de caminho de comprimentos por dia, 38 <n <40, por dia. Todas as larvas e os pais foram criados em alimentos de baixa de nutrientes, a 25 ºC, 60% de umidade e uma 0:12 L: Ciclo D. Diferenças entre grupos de teste e / ou tratamentos foram avaliados por análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para múltiplas comparações post-hoc pairwise. Para (A) um factor de bloqueio de dias foi adicionado ao modelo. Letras representam agrupamentos estatísticos; significa com a mesma letra não são itselfgnificantly diferente (p <0,05). Fed e FD representam condições privadas de alimentos Fed e 4 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Qualidade Alimentar e trajeto de comprimentos larval. A média de larvas caminho de comprimento (milímetros ± SEM) para rovers e assistentes, demonstrando caminho de comprimentos de larvas cultivadas em alta e baixa alimentar de nutrientes. Os dados reunidos durante três dias consecutivos de testes com um factor de bloqueio do dia adicionada ao modelo estatístico, 75 <n <90. Todas as larvas e os pais foram criados em baixa ou alta alimentos nutriente a 25 ºC, 60% de umidade e uma 0:12 L: ciclo D. Diferenças entre grupos de teste e / ou tratamentos foram avaliados por análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para post-hoc pairwise multiple comparação. Letras representam agrupamentos estatísticos; significa com a mesma letra não são significativamente diferentes (p <0,05). Suporte de alta e baixa para alta de nutrientes e baixa qualidade nutricional dos alimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O ensaio caminho de comprimento descrito aqui oferece uma medida robusta e simples de comportamento de forrageamento de larvas de Drosophila. O protocolo segue a metodologia geral descrita no Sokolowski 2, mas desde que foi melhorada no que diz respeito à eficiência e controles experimentais. Para o melhor de nosso conhecimento, este método é o único método disponível para medir a caminho de comprimento larval. A versão original do protocolo 2, 3, 15, 16 larvas testadas em placas de Petri com uma fina camada de pasta de levedura aplicada com uma escova, e depois um vidro espalhando haste caminho de comprimento. Versões mais recentes do protocolo de 10, 17, transferida para as placas usando Plexiglas descritos aqui. O uso de Petri pratos e vidros de espalhador apresentou a vantagem de uma camada muito fina de levedura, que rendeu caminho muito longo comprimentos e exacerbou as diferenças entre os rover e sitter fenótipos. A utilização de placas de acrílico resultou em comprimentos totais de caminho mais curto, mas rover-sitter diferenças foram mantidas e igualmente reprodutível. Embora a utilização de placas de acrílico é muito menos laborioso, os caminho mais longo de comprimentos obtidos com o método de placa de Petri permitido para uma melhor separação da sonda e Sitter fenótipos, facilitando o mapeamento genético da diferença Rover-seca para o para o gene 3. A utilização de placas de ensaio de Plexiglas, em vez de placas de Petri, e análises computacionais de vestígios caminho de comprimento são as principais modificações introduzidas no protocolo uma vez que o método foi desenvolvido em primeiro lugar, e tem aumentado bastante o número de larvas que podem ser testadas por uma única pessoa , bem como a velocidade de análise de dados. Também melhoraram o nosso conhecimento de vários factores experimentais e ambientais que que pode afectar o resultado do ensaio, algumas das quais são descritas abaixo.

Em primeiro lugar, este ensaio mede as diferenças individuais no comportamento caminho de comprimento sobre um substrato de forrageamento (uma pasta de levedura-água). d significativaIFERENÇAS neste ensaio pode resultar de defeitos de locomoção das larvas geral. Isto pode ser controlado pelo ensaio simultaneamente para o comportamento de locomoção das larvas em placas de ágar não nutritivos. Se as diferenças de tensão são mantidas em placas de ágar, é seguro assumir que as diferenças encontradas em um substrato de levedura em água não são forrageamento comportamento específico. Foi previamente mostrado que, enquanto a sonda para o alelo confere significativamente mais longos comprimentos de caminho-de levedura, sondas e assistentes não diferem na ausência de alimentos, uma vez que exibem similarmente caminho longo de comprimentos em agar 9. Além disso, porque as larvas aumentam geralmente a sua locomoção na ausência de alimentos, encontrando pouco ou nenhum movimento em placas de agar é provavelmente devidos a defeitos na locomoção. Desde defeitos movimento independente alimentares pode agir como uma variável de confusão na investigação de comportamento de forrageamento, controle de agar pode reduzir os falsos positivos em telas genéticos 10. É também importante notar que, se Larvae foram danificados antes do teste, eles não podem se mover. larvas imóvel, morto ou danificado pode ser distinguido de larvas saudáveis, observando o movimento do gancho boca. larvas Immobile sem quaisquer movimentos gancho boca deve ser descartada.

Em segundo lugar, como acontece com outros comportamentos, o caminho de comprimento larval pode ser afetada por fatores ambientais que precisam ser considerados e controlados para quando a realização deste ensaio. Os fatores ambientais conhecidos por afetar a caminho de comprimento incluem a temperatura criação, umidade, qualidade dos alimentos, densidade de criação, espessura de pasta de levedura, as diferenças aleatórias entre os dias, eo tratamento das larvas. Desenvolvimento larval e idade no momento do teste também afetam caminho de comprimento 11. Como mostrado na Fig. 4, levantando larvas nos alimentos de qualidade inferior diminui caminho de comprimento. A utilização de uma das receitas de comida de mosca descritas neste protocolo ou outra receita mortos levedura que é equivalente quanto ao seu conteúdo nutricional é recomendado. É também suggested para evitar ambientes de alta ou baixa densidade de criação, sempre semeando placas de alimentos, com 100 larvas e espaçamento-los uniformemente sobre a comida. Criação de larvas em altas densidades limita a disponibilidade de alimentos e retarda o desenvolvimento das larvas, o que pode resultar em diferenças de desenvolvimento entre larvas no momento do teste 12. Condições de baixa densidade de criação também pode afetar desenvolvimento desde Drosophila larvas podem formar grupos de forrageamento sociais para quebrar a comida e aumentar forrageamento sucesso 13. Quando as larvas com mutações que afetam o tamanho das larvas são ensaiadas, pode ser necessário para ter em conta estes efeitos, calculando caminho de comprimento em função do comprimento do corpo larval ou de perímetro. Em todos os casos, é importante para garantir que as larvas não tiver transferido em fase errante quando eles estão a ser testados. Se as larvas se deslocar para cima sobre a tampa placa de Petri, durante o teste, é provável que eles são errante e a experiência deve ser descartado e repetido com la mais jovemrvae.

Outro fator que merece destaque é a consistência da pasta de levedura utilizada em testes de caminho de comprimento, uma vez que afeta a velocidade de rastreamento de larvas. Larvas testado em uma pasta grossa levedura terá mais curtos de caminho-comprimentos do que larvas testado em uma pasta de levedura mais aquoso. Além disso, as diferenças entre estocásticos dias de teste também impactam pontuações caminho de comprimento absolutos. É imperativo para embaralhar a ordem em que estirpes / genótipos são testados em poucos dias e para bloqueá-los entre os dias. Finalmente, o cuidado deve ser tomado para não salientar as larvas antes do teste de caminho de comprimento. Dois factores de stress que são comumente introduzidas através da manipulação são fome e afogamento. Como mostrado na Fig. 3, fome larvas antes do ensaio diminui caminho de comprimento, e, apesar de inanição pode ser introduzida como uma manipulação ambiental, a sua ocorrência inadvertida deve ser evitada. Salientando larvas devem ser evitados por trabalhar suavemente, mas rapidamente, limitando assim a quantidade de tempo SPent coleta, limpeza e transferência de larvas. Desde larvas exposição fototaxia negativo 14, luz intensa também pode atuar como um estressor e o ensaio deve ser feito sob mesmo, iluminação difusa. Apesar dos vários factores ambientais que podem alterar caminho de comprimento, é importante notar que embora um número caminho de comprimento absolutos são susceptíveis a condições ambientais, as diferenças relativas entre as estirpes são mantidas quando todos os indivíduos são tratados da mesma forma.

A precisão, eficiência e robustez na quantificação estão no centro de estudos que visam compreender os fatores genéticos e ambientais que mediam comportamento. O ensaio de caminho de comprimento das larvas de Drosophila oferece todas estas vantagens, além de ser de baixo custo, de alto rendimento, e fácil de realizar. Como tal, este ensaio pode ser amplamente utilizado para telas genéticos para identificar as vias moleculares e genéticas associadas com respostas comportamentais. Além disso, o ensaio pode ser umpplied a testes de toxicidade ou telas farmacológicos, ou adaptados para o ensino em sala de aula.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

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References

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