Injeksjon av syngene murine melanomceller til å bestemme sin metastatisk potensial i lungene

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

En metastase er viktig dødsårsak blant pasienter med ondartede sykdommer. Prosessen med metastatisk spredning av kreftceller er dårlig forstått, men ser ut til å involvere flere trinn, inkludert invasjon av tilstøtende vev, intravasation inn i lymfekjertlene og blodkar, overlevelse og trans i sirkulasjonssystemet, bloduttredelse fra blodkar på stedet av metastaser, tilpasning til den nye mikromiljøet av det nye området, og kolonisering på det nye området ved spredning og dannelse av sekundære svulster. 1 Hver av disse biologiske hendelsene involverer transformasjon, formidling og overlevelse av metastatiske tumorceller. For eksempel, transformasjonen av den epiteliale fenotype av tumorcellen inn i et mesenchymale fenotype, kombinert med den vellykkede interaksjon med ekstracellulære matriks, sette dem i stand til å invadere tilstøtende vev og metastasere til andre deler av kroppen. 2,3 Videre er disse metastatisk cellermå overleve i det sirkulerende blodet og unngå immun overvåking fra verten. 4,5 Til slutt, når implantert i et fjernt område i kroppen, må svulstcellene tilpasse seg deres mikromiljø for å spre seg og danne sekundære svulster. 6,7 Derfor , selv om metastase er et vanlig fenomen blant kreftpasienter, metastatiske tumorceller har flere områder av sårbarhet som er mottagelig for terapeutisk intervensjon.

Gitt den immunogene natur melanom, og den nylige interesse for immunterapi, modeller for melanom er stadig mer nyttig. 8 I USA alene, er melanom årsaken til anslagsvis 9000 dødsfall per år. 9 Vanlige steder av melanom metastaser er bein, hjerne , lever og lunger. Flertallet av metastaser til fjerne områder forekommer gjennom blodet. Sirkulerende tumorceller i blodet må unngå immunbehandling, nå en kapillær seng av en distal organ oginvadere gjennom endotelceller i blodkaret for å kunne etablere seg. 4-7,10, 11

Å etterligne de vanlige og virulente fenomener av metastasering ble murine B16-BL6 cellelinje opprettet. En avdøde av foreldre C57BL / 6 melanomcellelinje B16-F0, er B16-BL6 sluttproduktet av 10 på hverandre følgende utvalg for lungemetastase fra intravenøs injeksjon (noe som resulterer i B16-F10), etterfulgt av 6 påfølgende valg av blæren membrangjennomtrengning. 12 Som sådan er det en pålitelig melanomcellelinje for etablering av metastaser i mus, spesielt når den injiseres intravenøst. 13

Etter injeksjon av en tilstrekkelig mengde av B16-BL6-celler i halevenen til en B57BL / 6 mus, etterfulgt av to eller flere uker for å tillate implantasjon og vekst av B16 / BL6-celler vil danne metastaser i lungene. Ved aktiv dødshjelp og inspeksjon av dissekere mikroskopi, antallenkelte foci stede kan kvantifiseres. Dette i sin tur kan brukes til å etablere en dose-effekt metastase, ettersom antallet av injiserte B16-BL6-celler korrelerer med antall foci som dannes på overflaten av lungene. Denne modellen er kjent som "eksperimentell metastase", der kjente-metastatisk celler innføres direkte inn i blodet, som muliggjør rask og forutsigbar spredning og etablering i lunger, lever, eller andre organ for etterforskning. Dette står i kontrast til "spontan metastase," hvor tumorcellene er implantert, ofte subkutant, og metastaser stammer fra organisk felle kreftceller. 14,15

Det er viktig å injisere en passende mengde av B16 / BL6-celler inn i halevenen hos musene. For mange, og lungene vil bli dekket med metastaser og nabobrennpunktene vil være umulig å skille fra hverandre. For få, og påvirkning av en terapeutisk middel vil være umerkelig skyldes iboende variasjon mellom injeksjoner. For å oppnå et optimalt antall foki i lungene av C57BL / 6-mus, er det nødvendig å korrelere antallet av injiserte celler med mengden av etablerte metastaser på overflaten av lungene mens man tar hensyn til den distinguishability av individuelle foci. Denne protokollen vil demonstrere en metastatisk murine melanoma modell for C57BL / 6 mus.

Protocol

Etikk Uttalelse: Bruk av mus i forskning er bare akseptabelt i tilfeller der det kan fremme menneskelig forståelse av grunnleggende biologi eller mot eventuell behandling av sykdom.

1. Bestilling

  1. Kjøps kvinnelig C57BL / 6 mus (alder 6 - 8 uker), fem mus per gruppe. Tillat flere dager for mus for å justere.

2. Utarbeidelse av B16-BL6 Cells

  1. Fjern cellekultur plater fra 37-graders inkubator og plasser i en steril hette. Plater bør være ca 70% konfluent med B16-BL6 murine melanomceller. En større samløpet kan endre cellene metastatisk potensial.
  2. Tilsett 1 ml av 0,05% Trypsin-EDTA per plate, la sitte i 1 min, og deretter aspirer trypsin-media oppløsning.
  3. Tilsett 1 ml trypsin per plate og returnerer platene til inkubatoren i 10 min.
  4. Etter å ha flyttet platene fra inkubatoren til sterile panseret, tilsett 4 ml serumfritt Rosewell Park Memorial Institute medium (RPMI) til hver plate.
  5. Samle cellene med en steril, motorisert pipette. Støt ut cellene mot undersiden av platen, med spissen presset ved en meget liten vinkel, for å bryte opp cellene. Gjenta flere ganger for å sikre adekvat separering av celleklumper, som ellers kan tilstoppe utkast nålen. Minnes og overføre til en 50 ml konisk tube.
  6. Bruke et hemocytometer for å bestemme den celletetthet. Å holde det totale antall B16-BL6-celler konstant, bestemme volumet av serumfritt RPMI nødvendig for å oppnå sluttkonsentrasjoner på 0, 0,065, 0,015, 0,25 og 0,5 millioner celler / ml.
  7. Like delmengde media i 50 ml tube til 15 ml koniske rør. Sentrifuger de koniske rør ved 2250 xg i 5 min. Dekanter media. Tilsett en passende volum av serumfritt RPMI og bekrefte den ønskede celletettheten via hemacytometer. Juster densities- ved å legge til ekstra RPMI eller spinning og resuspending på et mindre volum- deretter.
  8. Delmengde 500 mLav hver cellesuspensjon til merkede 1,8 ml rør på is.

3. Tail Vein Injection

  1. Ta en mus, holdt av halen, og styre den bakre først inn i musen rainer. Med overkroppen i hovedkammeret i rainer, med halen utenfor den, trekker mus mot slutten av rainer. Sett rainer-stempelet, fortsetter å presse inntil musen er sikker.
  2. Roter muse 90 grader, slik at en av den laterale halevenen vender oppover. Ved hjelp av en alkohol pute, kraft rense side av musens hale, særlig hvor halevenen er mest synlig.
    Merk: God belysning er avgjørende for effektiv nålevenen visualisering på B57BL / 6J mus. Varmelamper eller oppvarmet kirurgi pads, selv om det ikke er nødvendig, vil også hjelpe til ved å øke volumet av halevenen.
  3. I et sterilt kultur hette, samle 300 ul cellekulturmedier fra 2 millioner celler / ml tube. Snu nålen, blar i side og skyve stempelet, for å løse ut bobler fra sprøyten. Støte ut kultur-RPMI til å resultere i et endelig volum på 250 fil.
  4. Forleng musehale med ikke-dominant hånd. Holde halen med den proksimale enden av halen forhøyet med pekefingeren på den ikke-dominerende hånd, og den distale delen av halen deprimert med tommelen.
    Merk: I denne måten, blir halevenen holdes i en sidestilling, parallelt med rainer overflate, med en kongruent oppføring mulig i den mer distale del av halen.
  5. Sett nålen i halevenen, mot den distale ende, i en liten vinkel nedover til å begynne med og deretter justere nålen for å samsvare med vinkelen på halevenen ved ytterligere innføring (senke stempelet enden av sprøyten i forhold til nålen) .
  6. Sett nålen omtrent 1 cm inn i halevenen. Etter innsetting, begynner å presse stempelet, holder nålen stødig.
    Merk: Hvis nålen er i halevenen og enden av nålen er not hindret media skal flyte uhindret inn i venen. Effektiv injeksjon er preget av blod klaring fra venen. Hvis det er motstand, eller en boble begynner å danne på stedet i injeksjon, fjern nålen og prøve igjen på en mer proksimal plassering langs halevenen.
  7. Fjern kanylen fra venen og kast den. Hold gasbind mot innføringsstedet for å stoppe blødninger.
  8. Fjern stempelet fra rainer og plasserer musen i resipienten buret.
  9. Gjenta dette for alle andre konsentrasjoner.
    Merk:. Lung brennpunkter etablering tar ca 2-3 uker, med variasjon avhengig av cellelinjen og ønsket størrelse på foci 9 I mellomtiden, mus bør overvåkes for symptomer som kan garantere tidlig dødshjelp, som overdreven pesende.

4. Telle Lung Foci

  1. Avlive mus ved å plassere i en CO 2 kammer og utsette til 100% CO 2
  2. Spriker musen på Styrofoam. Ved hjelp av kirurgiske saks, skape et kirurgisk snitt langs brystbenet.
  3. Foreta ytterligere to innsnitt, både fra toppen av brystbenet innsnitt og forgrening mot skuld hos musen, utsette den brystkassen.
  4. Lag to kutt, hver langs den laterale sidene av sternum, for å fjerne brystkassen fra torso, utsette lungene og hjertet.
  5. Hold hjerte med kirurgisk pinsett, kutt spiserør og luftrør, frigjør hjertet og lungene fra musen. Sett under et dissekere mikroskopet, på 10X forstørrelse, for bedre visualisering.
  6. Dissekere hjerte fra lungene og fjern thymus, slik at bare de to lungene.
  7. Med lungene under en dissekere omfang, begynner å telle lunge brennpunkter. Hver foci skal vises som en sirkulær, brun obtrusion på overflaten av lungene.
    1. Tilkonsistens mellom mus, telle antall foci på overflaten av en lapp, og så invertere den lobe. Gjøre hver av de fire lobene individuelt gir enklere telling.
  8. Lagre og fikse lungene hvis du utfører IHC, ellers kast restene.

Representative Results

Ved visuell inspeksjon, er variasjonen i overflate foci tydelig. Å telle antall tumorer under et disseksjonsmikroskop bør gi et lineært forhold mellom antallet av injiserte tumorceller og antall resulterende og tellbar foci. Ved bruk av et optimalt antall av injiserbare celler, målet er en hvor lungene ikke blir fullstendig dekket, som de er på 500.000 celler / ml i figur 1A, og ikke altfor tynt dekket, da de er på 62.500 celler / ml og 125.000 celler / ml. Dette er også kvantifiserbare ved lineær korrelasjon (figur 1B).

Figur 1
Figur 1. Lung Foci Som følge av Tail Vein Støpt B16 / BL6 Cells. (A) Lunge brennpunkter kan visualiseres på overflaten av lungene fra C57BL / 6-mus som brune sirkulære masser (representative foci i henhold til pilene). Som hiligheten av den injiserte cellekultur (over hvert bilde) øker, øker også tilsvarende antall som resulterer lunge brennpunkter (under hvert bilde). Lungene fra mus med høyest tetthet av injiserte celler har størst visuell dekning av lunge brennpunkter. Skala stolper representerer 20 mm. (B) Bestemmelse av den tette foci i forhold til cellekulturen tetthet. Det er en tilnærmet lineær sammenheng over 125.000 celler / ml, som bestemmes av hemacytometer. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sirkulerende tumorceller fra en halevene injeksjon representerer metastaser som unndrar områder av primær vekst og migrere gjennom rutene som blodet eller lymfesystemet, av og til å etablere seg i de kapillære senger av fjerne steder. 14 Protokollen er beskrevet ovenfor tjener som en modell for videregående metastaser. Med et optimalt antall B16-BL6 celler injisert, kan forskere fastslå den relative effekten av en administreres narkotika eller immuncellepopulasjonen, post-nøytralisering, på kreftcelle metastasering.

Denne protokollen har begrensninger. De sirkulerende tumorceller har blitt valgt for sin evne til å metastasere, og er derfor ikke-immunogent, som har lavere nivåer av store histokompatibilitetskompleks klasse 1-molekyler. 12 Videre er den plutselige og klynge innføring av store antall metastaser i motsetning til den typiske situasjonen hos pasienter hvor lite antall metastatiske tumorcellerspre over en lengre tidsperiode fra primærtumor sted. I tillegg er innført intravenøst ​​tumorcellene fra vevskultur og ikke av en primær tumor opprinnelse. Derfor er disse cellene er i motsetning til de sekundære metastaser som følge av endringer i celle-adhesjon, migrasjon, immungjenkjennelse og mottaker organ etablering. 15,16

En alternativ protokoll vil være den subkutane injeksjon av B16 / BL6 for generering av primære tumorer og analyse av de resulterende "spontane" lungemetastaser. Disse "spontane" metastaser har vist seg å inneholde mer heterogenitet enn sine "eksperimentelle" kolleger, nærmere matche de av menneskelige pasienter. Protokollen er å begrense dens evne til å bestemme innvirkningen av en eksperimentell forbindelse med metastasering. Med en lateral halevene-injeksjon, kan antallet melanoma celler injisert inn i blodstrømmen approksimeres via hemocytometer. Med "spontane" metastaser, men det er større heterogenitet mellom svulster, legge til en ekstra variabel til antall resulterende lunge brennpunkter. 16

Som konklusjon, halevenen B16-BL6 murin melanom-modellen representerer en enkel modell for å bestemme innflytelsen av en behandling eller immunterapi på metastasering. Ved intravenøs injeksjon av sirkulerende svulstceller, kan forskere replikere i en viss grad, pasienter post-metastasering. Vurderer de destruktive effektene av metastatiske tumorceller i cancerpasienter, er denne modellen et kraftig verktøy for å forstå flertrinnsfremgangsmåte for metastasering.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Støttet delvis av en National Cancer Institute stipend 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  2. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  3. Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
  4. Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
  5. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
  6. Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
  7. Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
  8. Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363, (13), 711-723 (2002).
  9. Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
  10. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
  11. Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1, (3), 263-264 (2007).
  12. Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56, (4), 875-879 (1996).
  13. Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
  14. Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5, (2), 87-114 (1986).
  15. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.2 (2001).
  16. Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18, (4), 669-681 (2001).
  17. Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97, (3), 587-600 (1979).
  18. Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20, (1), (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics