Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att generera humana inducerade-pluripotenta stamceller från patientgenererade fibroblastliknande synoviocyter, med användning av en lentiviral system utan matarceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J. Vis. Exp. (116), e54072, doi:10.3791/54072 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mogna somatiska celler kan vändas till en pluripotenta stamceller liknande tillstånd med hjälp av en definierad uppsättning av omprogrammering faktorer. Ett flertal studier har genererat inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) från olika somatiska celltyper genom transduktion fyra Yamanaka transkriptionsfaktorer: Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc. Studien av iPSCs kvar på framkanten av biologisk och klinisk forskning. I synnerhet, kan patientspecifika iPSCs användas som ett banbrytande verktyg för studier av sjukdoms Patobiologi, eftersom iPSCs kan induceras från vävnaden för varje individ. Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammatorisk sjukdom, uppdelade efter förstörelsen av brosk och ben struktur i leden. Synovial hyperplasi är en av de viktigaste orsakerna eller symptom som leder till dessa resultat i RA. Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är den viktigaste komponenten celler i hyperplastisk synovium. FLSs i fogen obegränsat prolifererar, så småningom invaderar intilliggande cartilålder och ben. För närvarande kan hyper synovium avlägsnas endast genom ett kirurgiskt ingrepp. Den borttagna synovium används för RA forskning som ett material som reflekterar det inflammatoriska tillståndet i leden. Som en stor aktör i patogenesen av RA kan FLSs användas som ett material för att generera och undersöka iPSCs av RA-patienter. I denna studie har vi använt FLSs av en RA-patient att generera iPSCs. Med användning av en lentiviral systemet, upptäckte vi att FLSs kan generera RA patientspecifik iPSC. De iPSCs genereras från FLSs kan vidare användas som ett verktyg för att studera patofysiologin för RA i framtiden.

Introduction

Pluripotenta stamceller är nästa generations plattform i olika kliniska och biologiska områdena. De är ett lovande verktyg som kan användas i sjukdomsmodellering, drug screening, och regenerativ medicinsk behandling. Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) användes främst för att studera och förstå pluripotenta celler. Men isoleras genom förstörelsen av den mänskliga blastocysten är hESCs i samband med flera etiska betänkligheter. År 2007, Dr Shinya Yamanaka och hans team omvänd cell programmeringsprocessen och utvecklat stamceller från mänskliga vuxna somatiska celler 1,2. Därför, till skillnad från hESCs, inducerade-pluripotenta stamceller (iPSCs) kan genereras från mogna somatiska celler, som man undviker de etiska hinder.

Vanligtvis är iPSCs genereras av leverans av fyra exogena gener: Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc. Dessa Yamanaka faktorer ursprungligen levereras med hjälp av lentivirala och retrovirala system. De första iPSCs härleddes från mus somatisk calnar 3. Efteråt var den teknik som tillämpas på humana dermala fibroblaster 1,2. Senare studier framgångsrikt genererade iPSCs från olika källor, såsom urin 4, blod 5,6, keratinocyter 7, och flera andra celltyper. Det finns dock några somatiska celler som inte har använts i omprogrammering och screening av omprogrammering kapacitet olika celltyper från specifika vävnader i sjukdomstillstånd, krävs fortfarande.

Reumatoid artrit (RA) är en sjukdom som kan drabba alla skarvar och leda till autoimmuna tillstånd i andra organ. RA drabbar omkring 1% av de vuxna i den utvecklade världen. Det är en ganska vanlig sjukdom och dess förekomst ökar varje år 8. Emellertid är RA svåra att identifiera i de tidiga stadierna och oncebone förstörelse inträffar finns det ingen behandling som kan återställa skadan. Dessutom skiljer sig läkemedlets effektivitet från patient till patient, och det är svårt att förutsäga sjukvårdareine som krävs. Därför behövs utveckling av ett läkemedelsscreeningsmetod, och ett cellmaterial som kan reflektera villkoren i RA krävs.

Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är en aktiv cellulär deltagare i patogenesen av RA 9,10. FLSs finns i synovial intima foder mellan ledkapseln och hålrum, som också kallas synovium. Genom att stödja den gemensamma strukturen och ge näring till omgivande brosk, FLSs brukar spela en avgörande roll i ledfunktion och underhåll. Emellertid FLSs i RA har en invasiv fenotyp. RA FLSs har en cancer-liknande fenotyp, så småningom förstöra det omgivande benet av oändlig spridning 10. Med denna unika egenskap kan FLSs användas som ett lovande material som kan återspegla patobiologi av RA. Ändå är dessa celler sällan produceras och cellfenotyper ändra när cellerna går igenom flera passager i in vitro

Teoretiskt kan RA patientgenererade iPSCs (RA-iPSCs) bli ett idealiskt verktyg för läkemedelsscreening och ytterligare forskning. Genererade iPSCs har självförnyelse förmåga och kan bibehållas och expanderas in vitro. Med pluripotens, kan dessa celler differentieras till mogna kondrocytceller och osteocyte linjer, som kan bidra cellmaterial för specifik forskning i RA och andra benrelaterade sjukdomar 11.

I denna studie visar vi hur man isolera och expandera FLSs från en bortopererad synovium, och hur man skapar RA-iPSCs från FLSs använder lentivirus innehåller Yamanaka faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik: Den här studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board av det katolska universitetet i Korea (KC12TISI0861).

1. Synoviocyte Isolering och Expansion

  1. Synoviocyte Isolering
    1. Sterilisera två par av kirurgiska saxar och en pincett.
    2. Överföra den synoviala vävnaden till en 100 mm skål och tvätta med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% penicillin / streptomycin.
    3. Skär av gulaktiga fettvävnad och skelettrester. Överföra det trimmade vävnad till en brunn i en 6-brunnsplatta och tillsätt 5 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 20% fetalt bovint serum (FBS).
    4. Hacka vävnader med saxen tills bitarna är tillräckligt små för att tränga in i en engångspipett.
    5. Överföra vävnaden innehållande media till en 50 ml koniskt rör. Skörda det återstående materialet genom att tillsätta 5 ml DMEM med 20% FBS till 6-brunnar och sedan överföra till röret. </ Li>
    6. Tina kollagenas på is. Lägg kollagenas till en slutkoncentration av 0,01% och försegla röret med parafilm. Inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C med skakning under 4 timmar.
    7. Efter inkubation, fylla röret med DMEM med 20% FBS, tills den totala volymen är 50 ml och centrifugera vid 300 xg, RT under 10 min.
    8. Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten och tillsätt 40 ml av media för att suspendera pelleten.
    9. Upprepa steg 1.1.10-1.1.11.
    10. Återsuspendera pelleten i 25 ml DMEM med 20% FBS och vänta på de stora klumpar av vävnad för att sjunka till botten.
    11. Överför supernatanten till en 100 mm skål och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 14 dygn.
  2. Synoviocyte underhåll och utbyggnad
    1. Kassera media från plattan och tvätta cellerna med 5 ml PBS.
    2. Tillsätt 1 ml PBS / 1 mM EDTA och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 2 min.
    3. Knacka skålen försiktigt och överfr cellerna till en 15 ml koniska rör. Centrifugera cellerna vid 250 xg, rumstemperatur under 2 min.
    4. Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten och suspendera pelleten i 30 ml DMEM med 20% FBS.
    5. Överföra celler till 3 x 100 mm skålar, utan att lämna någon synlig överblivet material.
    6. Byt ut media med färskt medium var 3 d. Dela upp cellerna vid 80% konfluens med användning av en ml PBS / 1 mM EDTA. Behåll tills passage tre före användning. Dela varje maträtt av celler i 3 rätter i varje split.
      OBS: Efter att ha nått passagen 3, kan celler som inte kommer att användas omedelbart frysas.

2. Omprogrammering FLSs Använda Lentiviruses-kodande Yamanaka Faktorer

  1. Överföring (D0)
    1. Seed 3 × 10 4 celler per brunn i en 6-brunnars platta i tillväxtmedium (500 ml DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin). Inkubera cellerna O / N vid 37 ° C i 5% CO2.
    2. Följande dag, ta bort en flaska av lentivirus innehållande 4 Yamanaka faktorer: Oct4, Klf4, Sox2 och c-Myc från frysen och tina vid 4 ° C. Obs: Lentivirus producerades av det förfarande som beskrivs i vår tidigare studie 11.
    3. Medan upptining viruset ändrar media till FLS tillväxtmedier (20% FBS plus antibiotika i DMEM) innehållande 10 mikrogram / ml hexadimetrinbromid och 50 mikrogram / ml askorbinsyra.
    4. Efter byte av media, tillsätt 30 pl lentivirus till cellerna och blanda försiktigt. För att förbättra infektion, centrifugera plattan vid 680 xg, 35 ° C under 30 min.
    5. Efter centrifugering, inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2.
  2. Underhåll Tills omprogrammering Synlig
    1. För tre dagar, byt media dagligen med FLS odlingsmedium innehållande 0,1 mM natriumbutyrat och 50 mikrogram / ml askorbinsyra.
    2. Nästa dag, ersätta media med en blandning av FLS tillväxtmedier ochiPSC media (1: 1-förhållande) innehållande 0,1 mM natriumbutyrat och 50 | ig / ml askorbinsyra.
      Notera: Komponenterna i iPSC media ges i listan material / utrustning.
  3. Dela upp celler för kolonibildning
    1. Förbered en vitronektin-belagda 6-brunnar.
      1. Tillsätt 60 l vitronektin till 6 ml PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +. Sätt 2 ml blandning i varje brunnar och inkubera i RT under minst en timme. Obs: Arbets koncentrationen av vitronektin är 5 mikrogram / ml.
    2. På D5, tvätta cellerna med PBS.
    3. Tillsätt 1 ml PBS / 1 mM EDTA för att lösgöra cellerna och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 min.
    4. Skörda cellerna och centrifugera vid 250 xg, rumstemperatur under 2 min.
    5. Split cellerna vid 3 olika förhållanden (1: 3, 1: 6 och 1: 9) för att uppnå olika confluencies. Lägg 900 ul av media till cellpelleten och återsuspendera. Tillsätt 300, 150, och 100 pl av cellblandningen per brunn i en 6-brunnars platta för att uppnå ett förhållande av 1: 3, 1: 6 och 1: 9, respektive.
    6. Byt ut media dagligen med IPSC media tills kolonier visas. Kolonier kommer att visas efter ca D18. Obs: I detta skede IPSC kolonier samexistera med den icke-omprogrammeras FLSs.
  4. koloniplockning
    1. Bered en 48-brunnars vitronektin-belagda plattan genom att tillsätta 500 | il vitronektin till brunnarna, och inkubera vid RT under minst 1 timme.
    2. Placera mikroskopet på en ren bänk och ta bort 6-brunnar från inkubatorn.
    3. Avlägsna vitronektin lösningen från 48-brunnar och tillsätt 500 | il IPSC medium kompletterat med 10 mM Rho-associerat, coiled-coil innehållande proteinkinas (ROCK) hämmare.
    4. Med hjälp av en 10p pipettspets, skär runt kolonin. Överför plockade koloni till en brunn på 48-brunnar.
    5. Efter plockning flera kolonier, inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2.
    6. Behåll cellerna tills kolonierna är stora enough för överföring. Observera: Vi spillts vanligtvis cellerna när kolonin kommer ut ur den synliga området av mikroskopet, när den betraktas i 100 gångers förstoring.

3. Immunofluorescens färgning

  1. cell~~POS=TRUNC
    1. Placera en steril 18 mm täckglas i en 12-brunnar.
    2. Tillsätt 1 ml PBS svalna och skölj täckglaset.
    3. Ersätt med 1 ml av en 10 mikrogram / ml vitronektin lösning.
    4. Inkubera plattan vid rumstemperatur under åtminstone en timme.
    5. Kassera vitronektin lösning och platt iPSCs i vitronektin-belagda 12-brunnars platta och kultur under 7 dagar vid 37 ° C, 5% CO2, ändra media dagligen.
  2. cellfärgning
    1. Kassera odlingsmedia och tvätta cellerna med PBS en gång.
    2. Fixera cellerna i 0,4% paraformaldehyd (PFA) under 30 min vid RT.
    3. Permeabilisera cellerna med 0,1% Triton X-100 under 5 minuter vid RT.
    4. Ta permeabilizationlösning och block med PBS innehållande 2% bovint serumalbumin (BSA) under 30 min vid RT.
    5. Späd antikropparna i PBS innehållande 2% BSA i enlighet med tabell 1. Inkubera cellerna med de primära antikropparna under 2 timmar vid RT.
    6. Lägga till den sekundära antikroppen (spädd 1: 200) och inkubera cellerna under 1 h vid RT, undvika ljus.
    7. Behandla cellerna med ett pl / ml DAPI under 10 min.
    8. Placera täckglaset ovanpå objektglas med antifade reagens och inkubera vid rumstemperatur under 24 timmar, undvika ljus.
    9. Verifiera uttryck med ett fluorescensmikroskop.

4. Realtidspolymeraskedjereaktion (RT-PCR)

  1. Extrahera mRNA från cellpelleten med användning av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-extraktion metod 11.
  2. Amplify cDNA från två mikrogram av den totala mRNA med hjälp av omvänd transkription 11.
  3. Blanda de komponenter som krävs för PCR med 2 pl cDNA templattan 11.
  4. Utför RT-PCR och verifiera resultaten från gelelektrofores 11.

5. Alkaline Phosphatase (AP) Färgning

  1. Odlings iPSCs för 5-7 dagar vid 37 ° C, 5% CO2 före färgning.
  2. Aspirera media och fixera cellerna med 4% PFA under 1 minut.
  3. Kasta fixativ och spola cellerna med 1X sköljbuffert.
  4. Förbered reagens för AP färgning. Blanda reagenserna i följande förhållande: Fast Red Violet: Naftol AS-BI-fosfat lösning: vatten = 2: 1: 1.
  5. Inkubera cellerna med färgningslösningen vid RT under 15 min, för att undvika ljus.
  6. Kassera färglösningen och skölj cellerna med sköljbuffert.
  7. Täck cellerna med PBS för att förhindra uttorkning och verifiera uttryck med hjälp av en ljus-fält mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna studie beskriver vi ett protokoll för att generera iPSCs från FLSs med hjälp av en Lentiviral systemet. Figur 1A visar en enkel schema över FLS isolering protokollet. Efter kirurgiskt avlägsnande av synovium, var vävnaden hackas i små bitar med hjälp kirurgisk sax. Kollagenas tillsattes för att isolera cellerna från klumpar av vävnad. Celler inkuberades under 14 dagar före ytterligare bearbetning. Figur 1B visar morfologin hos den isolerade FLSs. Cellerna upprätthölls i 3 passager före användning. FLSs delar en liknande karaktäristik med allmänna fibroblaster. Vår isolerade FLSs uttryckte fibrotiska markörer, Vimentin och fibronektin. Det isolerade RA FLSs visade också låg expression av makrofag-liknande synoviocyte markör, CD68 (Figur 1C).

FLSs skördades och transducerades med lentivirus innehållande 4 YamaNaka faktorer för omprogrammering. Efter att dela cellerna vid olika förhållanden (D7), små kolonier började dyka upp. Synliga kolonier, som visas i figur 2A, dök upp på D8-11. Kolonier kan plockas från denna punkt. Figur 2B visar en bild av en plockades och amplifierades koloni.

iPSCs expanderades till passage 5-10 och används sedan i olika analyser. Diverse ekonomiska och sociala råd kännetecknas av en hög nivå av AP. Cellerna färgades för AP att bekräfta odifferentierade tillstånd. RA-iPSCs uttryckte AP (figur 2C), vilket indikerar att de är odifferentierade. Pluripotenta markör uttryck undersöktes (figur 2D, E). Uttrycket av pluripotenta markörer som Oct3 / 4, Sox2, NANOG, Lin28, DPPB5 och TDGF1 bekräftades med hjälp av RT-PCR (figur 2D). Uttrycket av Oct3 / 4, Sox2 bekräftades också genom immunofluorescens enANALYS med ytterligare markörer som SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 och Klf4. TRA-1-60, som för närvarande tros vara den viktigaste iPSC markör, var mycket uttrycks i våra genererade iPSCs.

För ytterligare analys, utförde vi karyotypering och teratom analysen. RA-iPSCs visade en normal kromosommönster 44 + XY (figur 3A). 12 veckor-post injektion av RA-iPSCs i SCID-möss hade teratom bildas och visas olika vävnader, såsom körtel, fettvävnad och blodkärl (Figur 3B). Den GRODDBLAD differentiering bekräftades också genom immunofluorescens färgning. Ektoderm härstamningsceller positivt färgades för Otx2. Mesodermala celler uttryckte brachyury och endoderm bekräftades genom positiv färgning av SOX17.

figur 2
Figur 1: Protocol för FLS Isolering från en RA-patient. (A) En enkel skiss av den metod som används för synoviocyte isolering. (B) morfologi av isolerade FLSs. (C) Fluorescensmikroskopi bild av FLSs färgades med fibrotisk markörer vimentin, fibronektin och en makrofagliknande synoviocyte markör, CD68. Alla Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Framställning av iPSCs från FLSs Isolerad från en RA-patient (A) Bright-fältet bilden av en iPSC koloni innan plocka.. (B) Bild på en koloni efter plockning. (C) Colony färgades för AP. (D) PCR-analys of pluripotenta markörer. (E) Fluorescensmikroskopi bild av iPSCs. De genererade iPSCs uttryckte alla pluripotenta markörer. Alla Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Karyotype Analys och Teratom analys (A) Högupplösta G-banded bilder visar normala karyograms av iPSCs.. Bilden föreställer en 46XY normal diploid manlig kromosominnehåll. (B) Resultaten av teratom analyser och immunofluorescens färgning. Alla Skalstrecken = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Innan upptäckten av iPSCs, forskare används främst ekonomiska och sociala råd att studera stamcellsbiologi och andra cellinjer genom differentiering. Emellertid ESCs härstammar från den inre massan av en blastocyst, vilken är en tidig embryo. För att isolera ekonomiska och sociala råd, är förstörelsen av blastocysten oundviklig, höja etiska frågor som är omöjliga att övervinna. Även om ekonomiska och sociala råden har stemness egenskaper och pluripotens, de kan inte komma från personer och är ibland inte ett idealiskt verktyg för personlig analys och sjukdomar screening.

År 2007, Takahashi et al. genererade iPSCs från humana fibroblaster 2. Teoretiskt, till skillnad från ekonomiska och sociala råd, iPSCs kan genereras från alla vuxna somatiska celler. Med denna fördel, är iPSCs tros vara det perfekta verktyget för automatisk celltransplantation. Även med begreppet epigenetiska minne är iPSCs tros vara den idealiska cellmaterial för simulering av patogena förhållanden, det vill säga. Sjukdom modellering. Det har gjorts många studier gjorda med hjälp av olika typer av celler såsom blodkroppar, urinceller och mer. Ändå finns det många celltyper, såsom FLSs, i vilka omprogrammering inte har utförts.

Ledsjukdomar är viktiga immunsjukdomar som kan orsaka permanent invaliditet. RA orsakas av kronisk inflammation i lederna, så småningom resultimg i ben- och broskskador. Det är svårt att bota eller vända den skada som särskilt eftersom brosk inte kan regenerera in vivo. Därför regenerativ medicin med hjälp av iPSCs är en ny viktigt verktyg för att bota RA. Benet och broskförlust är också resulterat i pannusbildning. Pannus är en hornliknande struktur som kan ses i den histologiska bilden av leden. Den pannus görs av FLSs som föröka obegränsat som cancerceller. Därför är det tänkt att den FLSs kan reflektera de patologiska kännetecknen för sjukdomen. I denna studie använde vi patienten FLSs att generera iPSCs.

FLSs är den huvudsakliga celltyp som bidrar till patogenesen av RA. Som en cell som oftast utsätts för den inflammatoriska miljön inne i synovial gemensamt, trodde vår grupp som den kan användas som ett material som reflekterar patientens sjukdomstillståndet. Därför, med hjälp den tidigaste omprogrammering metoden, försökte vi att generera RA specifika iPSCs från FLSs, med hjälp av leverans av 4 Yamanaka Faktorer - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-Myc - genom lentivirus. FLSs isolerades från den borttagna synovium. Trimningen av synovium var kritisk när isolera FLSs. Ben och fettrester kan göra det svårare att få rena FLSs. Dessutom är oundvikligt för FLS isolering användning av kollagenas. Det är viktigt att använda celler mellan passagerna 3-8. När FLSs når passagen 3, är den Yamanaka faktor innehållande lentivirus genereras enligt det förfarande som anges i vårt tidigare arbete 11. Använda producerade lentivirusFramgångsrikt genererade vi RA FLS-härledda iPSCs (RA-iPSCs). Rena IPSC kloner genererades av kolonin plockmetoden. RA-iPSCs uttryckte alla pluripotenta transkription markörer och hade en normal karyotyp. Vidare är de RA-iPSCs kunde differentiera till alla tre germinallager enligt teratom analysen. Vi har också bekräftat att de RA-iPSCs visade mer mineralisering när differentieras till osteogena härstamningar in vitro (data visas ej) 11.

Det finns emellertid vissa begränsningar för denna metod. Lentivirus kräver genomisk integration för omprogrammering. Klf-4 och c-Myc är onkogener och dessa två Yamanaka faktorer kan underlätta tumörtillväxt in vivo. Därför kan det inte vara idealiskt för att använda dessa faktorer för att generera material för kliniska tillämpningar. Dessutom FLSs och hudfibroblaster är inte svårt att få i kliniker. Som nämnts i olika rapporter, hudfibroblaster (dvs Dermal fibroblaster) kan endast uppnås genom stansbiopsier. FLSs kan endast isoleras genom ett invasivt kirurgiskt ingrepp och denna operation utförs på patienter med svår hyperplasi som har genomgått knäledsoperationer. Därför finns det ingen anledning att använda FLSs när omprogrammering en icke-RA iPSC. Dessutom, är det svårt och tidskrävande processen med vilken fibroblaster är förberedda för omprogrammering. FLSs har samma brister som hudfibroblaster. Därför är cellkällor som är enklare att hantera och få krävs.

Av detta skäl har forskare börjat söka efter en alternativ cellkälla. Ett för närvarande använt material är blodceller. Det är lätt att dra blod och isoleringsprocessen är relativt enkel och snabb. Dessutom finns det en övergång från användning av lentivirus till verktyg som inte kräver genomet integration, såsom Sendai virussystem, små molekyler och episomala plasmider.

Även FLSs inte kan användas somett material för olika individer, är det fortfarande en stor material när du skapar RA-iPSCs för forskningsändamål. I framtiden ser vi att generera en RA-patient FLS-härledda iPSC bank. RA-patienter individuellt visar olika reaktioner på läkemedel som används för behandling. Med flera rader RA iPSCs, hoppas vi att generera en drog screening cellbank för RA-patienter. Genom att screena alla droger på varje cellinje, kan vi kunna förutsäga vilka läkemedel kommer att arbeta som enskild patient.

Sammanfattningsvis, detta protokoll beskriver tillämpningen av iPSC teknik reumatologi. Med detta protokoll kan iPSCs genereras från RA-patient-derived FLSs, och de genererade iPSCs har de egenskaper som krävs. Dessa iPSCs kan användas i klinisk forskning, läkemedelsscreening, sjukdom modellering, och regenerativ medicin för fortsatta undersökningar av biologi RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 mlL Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Life Technologies 11995-073
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Collagenase Sigma Aldrich C6885-100MG
Parafilm Sigma Aldrich 54956
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM Life Technologies 11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Polybrene Chemicon TR-1003-G
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
DPBS Life Technologies 14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene Chemicon TR-1003
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA) Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10x TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7, (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5, (4), 434-441 (2009).
  6. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113, (22), 5476-5479 (2009).
  7. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  8. Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376, (9746), 1094-1108 (2010).
  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233, (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233, (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16, (1), R41 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics