Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этом протоколе, мы приводим процедуры создания Миотоническая дистрофия 1 миобластов моделей, в том числе оптимизированного обслуживания С2С12 клеток, генной трансфекции / трансдукции и миоцитов дифференциации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Миотоническая дистрофия 1 (DM1) является распространенной формой мышечной дистрофии. Хотя некоторые модели на животных были установлены для DM1, миобластов модели клеток по-прежнему важны, поскольку они обеспечивают эффективную клеточную альтернативу для изучения клеточных и молекулярных событий. Хотя клетки миобластов С2С12 широко используется для изучения миогенез, устойчивость к трансфекции генов или вирусной трансдукции, затрудняет исследование в клетках С2С12. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, который включает в себя ежедневное техническое обслуживание, Трансфекция и трансдукции процедуры для введения генов в С2С12 миобластов и индукции дифференцировки кардиомиоцитов. Итак, эти процедуры позволяют наилучшие эффективности трансфекции / трансдукции, а также последовательные результаты дифференциации. Протокол, описанный в создании моделей DM1 миобластов клеток пойдет на пользу изучение миотоническая дистрофии, а также других мышечных заболеваний.

Introduction

Миотоническая дистрофия (DM) является аутосомно - доминантным заболеванием , которое затрагивает несколько систем, наиболее особенно сердечной и скелетных мышц 1. Есть два подтипа этого заболевания, DM1 и DM2. DM1 является более распространенным и имеет более тяжелое проявление чем СД2 2. Генетическая мутация , лежащая в основе DM1 является расширением CUG триплетных повторов , расположенных в нетранслируемой области 3 '(УТР) ДМ гена протеинкиназы (ДМПК) 3. Число ЗГП повтора в непораженных особей колеблется от 5 до 37. В отличие от этого , она возрастает до более чем 50, а иногда и до тысяч у больных DM1 4. В результате РНК-связывающие белки, такие как muscleblind типа 1 (MBNL1), CUGBP и Elav типа семейство 1 (Celf1), являются misregulated. Из - за секвестрации на расширенном CUG повторами, MBNL1 теряет способность регулировать альтернативного сплайсинга 5. Celf1, с другой стороны, до регулируемой 6,7. Сверхэкспрессия Celf1 связано с потерей мышечнойи слабость, которые не отнесены к потере функции MBNL1. Животные модели, имитирующие DM1-связанных изменений, в том числе ДМПК 3'-UTR расширения СГГ, потеря MBNL1 и избыточная экспрессия Celf1, были установлены. Тем не менее, моделирование DM1 в миобластов предлагает эффективную альтернативу, особенно для рассечения DM1 связанных клеточных и молекулярных событий.

C2C12 миобластов линия клеток впервые был выделен из поврежденной мышцы С3Н мыши и широко используются для изучения миогенной дифференцировки 8,9. C2C12 клетки быстро размножаются в эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) -содержащий средства массовой информации и легко подвергаются дифференцировке, когда ФБС истощается. Тем не менее, с помощью этой миобластов дифференциации модель представляет две задачи: C2C12 клетки часто устойчивы к трансфекции генов / вирусной трансдукции; и небольшие изменения в обработке клеток и дифференцировки процедуры может привести к заметным изменениям в образовании myotube.

Наша лаборатория обычно использует С2С12 миобластов как асELL модель и разработала протоколы , которые эффективно обеспечивают гены от плазмиды трансфекции, ретровирусной трансдукции и лентивирусов трансдукции в клеточной линии С2С12 10. В видео мы покажем, оптимизированные процедуры для трансфекции / трансдукции С2С12 клеток и поддержание согласованности дифференциации в создании моделей DM1 миобластов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. C2C12 Культура клеток

  1. Поддержание С2С12 миобластов мыши в 100 мм пластины в ростовой среде (среда Игла в модификации Игла (DMEM),), дополненной 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Разрешить C2C12 пассированные клетки становятся примерно 50 - 60% сплошности.
  2. Выбросите среду для роста и промыть клетки С2С12 с 3 мл при комнатной температуре фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Удалите PBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА для открепления клеток. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
  3. Нейтрализовать трипсина путем добавления питательной среды 3 мл. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Добавить 1 мл подвешенной клетки к новым 100 мм пластины и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.

2. C2C12 Cell Трансфекция / трансдукции и выбор

  1. C2C12 плазмиду трансфекция
    1. 24 ч до трансфекции рКонец 7,0 х 10 5 C2C12 клеток в одну лунку шесть-луночного планшета для каждой трансфекции.
      Примечание: Это приводит к 50 - 60% монослоя ко времени трансфекции.
    2. Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
    3. Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (GFP-CUG5 или GFP-CUG200) в 200 мкл предварительно нагретом среде без сыворотки и вихревыми кратко. Добавить реагента для трансфекции 6 мкл в среду и сразу же перемешать в течение 30 сек с помощью вихря. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
    4. Замените носитель клеток С2С12 до 2,5 мл сыворотки среды роста. Добавьте Смесь для трансфекции в клетки после инкубации. Возвращение пластины в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор.
    5. Держите клеток в трансфекции смеси / ростовой среде без сыворотки в течение 4 часов или до ночи. Изменение СМИ обратно в СМИ роста на следующий день или когда цитотоксичность очевидна.
      Примечание: Цитотоксичность оценивали с помощью микроскопического обследования СЕLLS. Обратите внимание на изменения в морфологии клеток и открепления клеток. Пока нет явной цитотоксичность, инкубация в течение ночи в бессывороточной ростовой среде усиливает трансфекцию.
    6. Выберите ячейки, через 48 часов после трансфекции путем добавления 1,2 - 1,6 мг / мл G418 для ~ 10 дней, пока культура управления (трансфицируют без плазмид) не не имеет живых клеток. Изменение среды каждые два дня с культуральной среде с добавлением G418.
    7. Поддерживать клетки , устойчивые к G418 в ростовой среде и 5% СО 2 при 37 ° С в течение последующих экспериментов.
  2. препарат ретровируса и C2C12 ретровирусной трансдукции
    1. Готовят НЕК 293 культуральной среды путем дополнения DMEM высокий уровень глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
      1. Примерно через 24 часа до трансфекции, плиты 4.0 х 10 6 экотропным упаковочных клеток НЕК 293 , основанных на 100 мм пластины (80% слияния в трансфекцией) Containing среда для культивирования клеток.
    2. Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
    3. Смешайте 15 мкг плазмидной ДНК (pMSCV-Puro или pMSCV-Celf1Flag-Puro) в 1 мл ростовой среды без сыворотки. Vortex кратко. Добавьте 30 мкл реагента для трансфекции, полученного на стадии 2.2.2 в ДНК / сыворотки среде роста трубки, и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Добавл ют по капле смесь для трансфекции в упаковывающих клетках НЕК 293 экотропным основе. Аккуратно водоворот пластин и вернуть их обратно в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, изменения носителя 10 мл подогретого свежей средой роста.
    5. Урожай супернатант (содержащий ретровирус) через 48 часов после трансфекции с помощью пипетки и перенести надосадочную жидкость в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новых теплых СМИ к пластине и вернуть его в инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
      Примечание: Средства массовой информации осторожно добавляют к тон стороне колодца так, чтобы не нарушить клеточный монослой.
    6. Заготавливают вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатанта из 2.2.5. Центрифуга при 500 х г, 4 ° С в течение 7 минут, чтобы удалить остатки клеток.
    7. Передача супернатант в новую 50 мл центрифужную пробирку. С помощью ретровируса для трансдукции клеток С2С12 в этой точке переходит к шагу 2.2.9 или аликвоты и хранить супернатант при -20 ° С для последующего использования.
    8. Разморозить ретровируса из 2.2.7 при комнатной температуре, если замороженной используется здесь.
      Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.
    9. Пластина клеток С2С12 в тот же день трансдукции, направленных на 30 - 40% слияния.
      1. Выбросьте среду для роста и мыть клетки С2С12 с 3 мл PBS при комнатной температуре. Удалите PBS, добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА, и инкубируйте в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
      2. Нейтрализовать трипсина путем добавления 3 мл Медиана ростаНМУ. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Граф клеток с использованием гемоцитометра и добавить 8,0 × 10 5 C2C12 клеток до 60 мм планшет.
    10. Добавить 0,5 мл ретровирус заражает один 60 мм пластины клеток в 3 мл питательной среды. Возвращение пластины в инкубатор.
    11. Заменить 3 мл свежей среды, дополненной выбора антибиотика (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 48 ч после заражения. Заменить 3 мл среды с антибиотиком каждый день в течение ~ 5 дней до untransduced культуры управления C2C12 не вымирает.
  3. Лентивирус подготовка и C2C12 лентивирусов трансдукции
    Примечание: Выполните все процедуры, связанные с Лентивирус в уровень биологической безопасности 2 кабинета и следовать биологические инструкции по технике безопасности. Жидкие отходы, содержащие вирус, должны быть продезинфицированы перед утилизацией.
    1. Пластина 4.0 х 10 6 клеток 293T в 100 мм пластины (~ 80% сплошности в день трансфекции) с НЕК 293 культуральной среды клеток (DMEM высокий уровень глюкозы, дополненной 10% плоднойбычий сывороточный, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) 24 ч до трансфекции.
    2. Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры. Смешайте лентивирусов упаковки векторов (4 мкг pMD2.G и 6 мкг psPAX2) вместе с 8 мкг лентивирусов переноса вектора (Celf1 shRNA или платные каналы управления shRNA) в 1 мл не содержащей сыворотки среды для культивирования клеток. Vortex кратко.
    3. Добавьте 36 мкл подогретого реагента для трансфекции в ДНК / DMEM трубки и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Удалите 293Т из инкубатора и добавить смесь для трансфекции к пластине. Аккуратно вихревой пластины и вернуть его обратно в 5% CO 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, замените трансфекция смесь с 10 мл свежей культуральной средой.
    5. Собирают супернатант, содержащий лентивирусов 48 ч после трансфекции и передачи ее в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новые теплые СМИ к пластине и вернуть егов инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
    6. Соберите вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатантом из 2.3.5. Центрифуга кратко при 500g, 4 ° С в течение 7 мин.
    7. Передача супернатант в свежую 50 мл центрифужную пробирку. При использовании свежего вируса, переходите к шагу 2.3.9. Для использования в будущем, хранить содержащую вирус надосадочную жидкость при температуре от -20 & deg; С в виде аликвот по 10 мл.
    8. Оттепель вирус из 2.3.7 при комнатной температуре перед использованием, если используется замороженный запас.
      Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.
    9. C2C12-CUG200 клетки пластины (полученные в разделе 2.1), как описано в 2.2.9 в тот же день трансдукции.
      Примечание: Цель на 30 - 40% слияния.
    10. Добавьте 0,5 мл вируса, чтобы заразить 60 мм пластины С2С12-CUG200 и вернуть пластины в инкубатор.
    11. Заменить культуральной среды свежей средой, дополненной антибиотика селекции (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 72 ч после трансдукции.Refresh медиакультуры ежедневно с антибиотиком выбора для ~ 5 дней, пока все untransduced культура управления C2C12-CUG200 не гаснет.
    12. С помощью Вестерн-блот для проверки Celf1 нокдаун в GFP-CUG200 трансфицированных клеток.

3. C2C12 дифференцировка клеток

  1. Пластина 2 х 10 6 клеток в одну лунку 6-луночного планшета в 2,5 мл среды для выращивания 24 ч до начала дифференцировки.
    Примечание: Плотность покрытия может быть отрегулирована таким образом, что полное слияние достигается через 24 ч.
    1. Промыть вырожденные клетки с PBS и добавляют 2,5 мл с низким сывороточным дифференциации среды (модифицированной среде Игла, дополненной 2% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина Дульбекко, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1 мкМ инсулина) , Замените среду каждые два дня.
      Примечание: Держите запаса инсулина замороженные и добавить его в средствах массовой информации при каждой смены среды.
  2. Во время С2С12 дифференциации, собирать образцы для цюаньственном ОТ-ПЦР (см раздел 4) в следующих временных точках: Day0, 1, 2, 4 и 6. Процесс культура для иммунологического окрашивания на 6-й день - 8 (см раздел 5).

Выделение РНК и 4. Количественный ОТ-ПЦР

  1. Используйте протокол производителя для выделения РНК. После выделения ресуспендируют РНК гранул в 30 мкл РНКазы без воды и пипеткой вверх и вниз несколько раз.
    Примечание: Образцы могут перейти к количественной ОТ-ПЦР или могут храниться при температуре -80 ° C.
  2. Использование комплекта RT КПЦР для количественного RT-PCR 10 и следовать инструкциям производителя. Готовят реакционную смесь в соответствии с таблицей 1.
Компонент Объем (мкл) Конечная концентрация
реакционный буфер 2x 10 1x
Прямой праймер 0,5 200 нМ
Обратный праймер 0,5 200 нМ
зонд 0,5 200 нМ
Ревертазам & РНКазы Ингибитор 0,1 0,25 Ед / мл
шаблон 1 100 нг общей РНК
РНКазы свободной воды 7.4 Не Доступно
Total Mix 20

Таблица 1. Количественный ОТ-ПЦР Master Mix Приготовление

  1. Выполните 20 мкл RT-КПЦР реакции с использованием теплового профиля Таблица 2.
Обратный шаг транскрипции 30 мин, 48 ° С
полимер ДНКактивация аза / инактивация обратной транскриптазы 10 мин, 95 ° C
40 циклов 15 сек, 95 ° С
1 мин, 60 ° С

Таблица 2. Количественный ОТ-ПЦР термический профиль

5. Иммунологическое

  1. Закрепить монослойной культуре в 2,5 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида / PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
  2. Проницаемыми образцов в 2,5 мл 0,1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Передача образцов в увлажненной камере. Блок образцов в 2,5 мл блокирующего буфера (0,1% неионный ПАВ / PBS, 10% нормальной козьей сыворотки) в течение 30 мин при 37 ° С.
  4. Откажитесь блокирующий буфер и применять 800 мкл первичного антитела против тяжелой цепи миозина, разведенного в блокирующем буфере (1: 100). Инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при комнатной температуре.
  5. Промыть пластины 3 тимэс (10 мин каждый) с 2,5 мл буфера для промывки (0,1% полисорбат 20 / PBS) на 2-й день.
  6. Удалите промывочный буфер и применять 800 мкл вторичного антитела (козье антитело против мышиного IgG, 1: 500, разбавленный в PBS). Инкубируйте в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 1 часа.
  7. Промыть два раза (10 мин каждая) с 2,5 мл буфера для промывки.
  8. Инкубируют 800 мкл DAPI (1 мкг / мл, разбавленного в дистиллированной деионизированной H 2 O) в течение 5 мин.
  9. Промыть с 2,5 мл буфера для промывки снова в течение 10 мин.
  10. Изменение промывочного буфера в 2,5 мл PBS и использовать флуоресцентный микроскоп для захвата изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Клетки C2C12 трансфицировали GFP-CUG5 или GFP-CUG200. После выбора лекарственной устойчивости, были созданы стабильные бассейны, которые могут быть визуализированы с помощью экспрессии GFP (Фигура 1А). Формирование Myotube в дифференцированных миобластов была обнаружена тяжелой цепи миозина иммунным окрашиванием 10 (Фигура 1В). Количественное myotube формирования показали , что показатели слитые снизились с 35,4 ± 4,1% до 2,6 ± 1,1% и myotube площади снизились с 35,6 ± 2,2% до 2,7 ± 0,8% аномальным расширением СГГ в GFP-CUG200 (Рисунок 1С). Индекс расплавление и площадь myotube подсчитывали с помощью общего числа ядер в мышечных трубочек (≥ 2 ядер), деленное на общее число ядер и процент от общей площади изображения, охватываемой мышечные трубки, соответственно. В режиме реального времени ОТ-ПЦР 10 было проведено с целью анализа экспрессии для ряда мышц различнойтельная часть родственных генов, включая MyoD, MyoG, MEF2C и Celf1. По сравнению с CUG5 культур, CUG200 повышал экспрессию мРНК Celf1 в пролиферирующих миобластов в начале дифференцировки. Конгруэнтное с предыдущими сообщениями, Celf1 повышающей регуляцией был связан с СГГ-расширения в миогенного дистрофии 1 (рис 1D). Кроме того, Вестерн - блоттинга 10 последовательно показал уровень белка Celf1 был повышен (рис 1E), и CUG200 ингибирует экспрессию MyoD, MyoG и MEF2C во время дифференцировки (рис 1D). Эти результаты свидетельствуют о том, что ЗГП-расширение приводит к myotube дефектов и нарушенную дифференцировку миобластов.

Изучить роль Celf1 в миобластов дифференциации, ретровирусный вектор pMSCV- Celf1Flag был построен для трансдукции клеток С2С12. 10 Пуромицин-резистентные клоны были объединены для исследований дифференцировки. Вестерн-блот-результаты показали, что флаг-таgged Celf1 присутствовал только в pMSCV-Celf1Flag трансдуцированных культур и экспрессия белка Celf1 была повышающей регуляции (фиг.2А). Формирование мышечных трубочек в Celf1-гиперэкспрессией клетки редко когда по сравнению с контрольными культурами (рис 2В), что свидетельствует о том , что избыточная экспрессия Celf1 серьезно ухудшает миобластов дифференциации.

Для того, чтобы определить, является ли Celf1 нокдауна спасает дефицит дифференцировки в клетках ЗГП-расширения, Celf1 shRNA был доставлен в GFP-CUG200 клеток лентивирусов векторов. Двойные резистентные клоны (G418 и пуромицин) были отобраны и объединены для исследований дифференцировки. Уровень эндогенного белка Celf1 была заметно снижена в присутствии Celf1 shRNA (Фиг.3А). Через 6 дней дифференциации, эффект Celf1 shRNA на повышение myotube образование было очевидным (фигура 3В). Индексы Fusion и myotube являютсяравно как и 16,1 ± 3,0% и 15,2 ± 1,2%, соответственно, по сравнению с 4,6 ± 0,8% и 5,1 ± 1,3% в контрольных культурах (рис 3C). В то же время, результаты в режиме реального времени RT-PCR позволяют предположить , что экспрессия MyoD, MyoG и MEF2C была значительно увеличена в клетках Celf1 shRNA (Рисунок 3D) с поддержкой Celf1 нокдауна спасли миоцит дифференциации дефицита.

Рисунок 1
Рисунок 1. ЗГП-Расширительный Угнетает миоцитов Дифференциация в С2С12 клетках. (A) C2C12 клетки экспрессируют GFP-CUG5 или GFP-CUG200 Повсеместно после выбора. Шкала баров 100 мкм. Эта цифра была изменена с нашей предыдущей работе 10. (Б) мышечных трубках были сформированы в GFP-CUG5 клетках , но в меньшей степени в GFP-CUG200 клетках. Мышечные трубки визуализировали с помощью тяжелой цепи миозина (MF-20) иммунное окрашивание. Шкала баров 100 мкм. (C) (D) в режиме реального времени RT-PCR анализ Celf1, транскрипционные факторы MyoD, MyoG и выражение MEF2C во время миобластов дифференциации. уровни мРНК были нанесены после того, как GAPDH нормализуется. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. T-критерий Стьюдента проводили сравнение тестов с контрольной группой. п> 3, * Р <0,05. (E) GFP-CUG200 трансфекция увеличение экспрессии белка Celf1. ß-актина показана в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Сверхэкспрессия Celf1 ухудшающее миобластов дифференциацию. (A) Доказательство экзогенного Celf1Flag expression в клетках С2С12 с помощью Вестерн - блоттинга. формация (B) Myotube была нарушена в Celf1Flag сверхэкспрессией миобластов С2С12. Мышечные трубки визуализировали с помощью MF-20 иммунным окрашиванием. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Нокдаун Celf1 Частично Спасает ЗГП-Расширительный-индуцированный миобластов Дифференциация Дефицита. (A) Доказательство Celf1 нокдаун с помощью Вестерн - блоттинга. (Б) Celf1 shRNA индуцируется образование myotube в GFP-CUG200 миобластов. Мышечные трубки визуализировали с помощью MF-20 иммунным окрашиванием. Шкала баров 100 мкм. (C) Celf1 shRNA-Спасенные клетки , которые увеличили размер индекса слияния и myotube областей. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. (D) в режиме реального времени RT-PCR анализ Celf1, транскрипционные факторы MyoD, MyoG и выражение MEF2C во время дифференцировки. Уровень мРНК была построена после нормализации, чтобы у GAPDH. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. T-критерий Стьюдента проводили для сравнения тестов для контроля. п> 3, * Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клеточная линия C2C12 была использована в качестве модели для изучения миогенез 11-14. Эти клетки сохраняют фибробластоподобных внешний вид, быстро пролиферируют в среде , содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и легко дифференцировать в среде , содержащей 2% лошадиной сыворотки , 15 ед . Быстрый рост и дифференциация являются выгодные характеристики в модели миогенез клеток. Здесь мы демонстрируем использование плазмиды, ретровирусных и лентивирусов векторов для введения кДНК, 3'-UTR и shRNA в клетки С2С12. Критические точки для трансфекции / трансдукции и поддержание согласованности в дифференциации выдвинуты на первый план ниже.

Плотность клеток в ежедневном обслуживании клеток имеет решающее значение. Эти клетки должны быть культивированы ниже 50 - 70% слияния. Из-за короткого времени удвоения популяции, высокая Стечение (> 70%) C2C12 культура спонтанно дифференцирует, когда оставляют на ночь. В то время как фракция спонтанно дифференцированных клеток может быть небольшим, наличиедифференцированных клеток будет способствовать к несоответствиям в последующих опытах дифференцировки. Кроме того, недавно размороженные клетки С2С12, которые имеют малое число проходов, являются предпочтительными. Для дифференцировки, клетки высевают в заранее определенных чисел, так что они достигают полного слияния через 24 часа. Инсулин хранить в замороженном состоянии в виде небольших аликвот и добавляется каждый раз, когда изменяется дифференцировка среда. Эти меры улучшения результатов дифференциации.

Бессывороточной среде усиливает клеточную трансфекцию С2С12. Клетки можно инкубировать в трансфекции смеси / бессывороточной среды в течение ночи. В нашей лаборатории, мы достигаем до скорости трансфекции 20%, сопровождается небольшими признаками цитотоксичности. Концентрация лекарственного средства, используемого для выбора С2С12 ячейки выше, от 1,2 до 1,6 мг / мл G418 или от 1 до 3 мкг / мл пуромицин, а длительность отбора больше, чем большинство других клеточных линий. Из-за потенциальной токсичности при высокой концентрации лекарственного средства и расширенного инкубационного периода, партии к партииизменение потенциала дифференциации может возникнуть. Крайне важно, чтобы скорректировать схему выбора (концентрации и продолжительности) на основе внешнего вида клеток и для лечения контрольной и экспериментальной группы вместе.

Мы успешно внедрили GFP-CUG200 в клетки С2С12, воспроизводящих 3'-UTR расширение CUG в DM1. Представляя Celf1 в клетки С2С12 и Celf1 shRNA в клетки GFP-CUG200 С2С12 позволило оценку клеточных и молекулярных событий, вызванных Celf1 повышающую регуляцию и разведки ориентации Celf1, чтобы помочь DM1 миобластов дифференциации, соответственно. Таким образом, модель миобластов C2C12, представленные здесь преимущества исследование миотонической дистрофии, а также общей биологии мышечных клеток и миогенной дифференцировки. Ограничение этой модели заключается в том, что выводы, содержащиеся в клеточных линиях, не могут полностью распространяться на организмы. Полученные результаты в нынешних моделях часто выдвигается к выделению свежих миобластов от животных и изучения их отличительноеции. В конечном счете мы обосновать миобластов выводы, содержащиеся в организмах.

Уникальная сила данного исследования является многоуровневая манипуляции ген в С2С12 миобластов, что позволяет моделирования последовательные генетические / патологические события в DM1. Ранее эффект токсичности РНК расширения ДМПК СГГ было зафиксировано в миобластов 11-14, в то время как патологические роли Celf1 были отдельно изучены в моделях мышей 16,17. Моделирование этих последовательных генетических / патологических событий является технически сложным и трудоемким, если оно проводится на животных моделях времени. Как показано в этом исследовании, комбинированное применение флуоресцентных и лекарственной устойчивостью маркеров позволяет моделировать дополнительных молекулярных событий в миотонической дистрофии. Модели, созданные в данном исследовании, было бы полезно в рассечение детальные механизмы в патогенезе DM1. Они будут также ценным для скрининга лекарственных средств, которые нацелены на различные стадии DM1 патогенеза. Стратегии и процедуры этогоисследование может пролить свет на установление других мышечных модели заболеваний в миобластов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45, (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68, (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244, (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23, (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28, (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6, (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32, (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852, (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10, (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8, (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453, (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265, (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19, (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19, (6), 1066-1075 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics