Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

sequenciação de ARN (RNA-Seq) é um método versátil que pode ser utilizado para detectar e caracterizar a expressão do gene, mutações, fusões de genes, e RNAs não codificantes. Padrão RNA-Seq requer 30-100.000.000 sequenciamento lê e pode incluir vários produtos de RNA, tais como mRNA e RNAs não codificantes. Demonstramos como alvejado RNA-Seq (captura) permite um estudo focado em produtos de RNA selecionados usando um sequenciador de desktop. captura de RNA-Seq pode caracterizar transcrições não anotadas, baixa ou transitoriamente expressas que podem de outra forma ser atendidas através de métodos RNA-Seq tradicionais. Aqui nós descrevemos a extração de RNA a partir de linhas celulares, depleção de RNA ribossomal, síntese de cDNA, a preparação de bibliotecas de código de barras, hibridação e captura de transcritos alvo e sequenciamento multiplex num sequenciador desktop. Nós também destacar o pipeline de análise computacional, que inclui a avaliação de controle de qualidade, o alinhamento, a detecção de fusão, a quantificação expressão genética e identificação de único nucvariantes leotide. Este ensaio permite a sequenciação transcrição direccionada para caracterizar a expressão do gene, fusões de genes e mutações.

Protocol

Nota: Este protocolo descreve o processamento ea análise de quatro amostras em simultâneo. Este método é compatível com ARN isolado a partir de células, tecidos congelados frescos e tecido embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE). Esse protocolo começa com 50 - 1000 ng (250 ng recomendado) a partir da entrada de ARN para cada amostra.

1. rRNA Exaustão e fragmentação de RNA Procedimento

  1. rRNA Esgotamento
    1. Remover eluto, prima, mistura fragmento, mix de remoção de rRNA, tampão de ligação rRNA e tampão de ressuspensão de -20 ° C e descongelar à temperatura ambiente. Remover o tampão de eluição, grânulos de remoção de rRNA e / ADNc ARN esferas paramagnéticas específica de 4 ° C e trazer para a temperatura ambiente.
    2. Adicionar 0,25 g de RNA para tubo de PCR. Dilui-se o ARN total com água ultra-pura, livre de nuclease para um volume final total de 10 pi. Adicionar 5 uL de tampão de ligação de rRNA a cada tubo, em seguida, adicionam-se 5 ul de mistura a remoção de rRNA e suavemente pipetae para cima e para baixo para misturar. Colocar os tubos no termociclador com tampa pré-aquecido a 100 ° C e um programa de termociclador a 68 ° C durante 5 minutos para desnaturar o ARN.
    3. Após desnaturação do ARN, remover tubos do termociclador e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Vortex rRNA tubo de sucção de talão vigorosamente para voltar a suspender as esferas. Adicionar 35 ul de pérolas de remoção de rRNA para novos tubos e transferir a reacção desnaturação ARN (20 ul) a tubos contendo grânulos de remoção de rRNA.
    4. Ajuste pipeta para 45 mL e pipeta rapidamente para cima e para baixo 20 vezes para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 1 min. Em seguida, coloque os tubos em suporte magnético à temperatura ambiente durante 1 min. Transferir o sobrenadante para tubos de PCR recentemente rotulados e colocar estes tubos novamente em suporte magnético à temperatura ambiente durante 1 min. Isto assegura que não há grânulos são transferidos. Transferir o sobrenadante para tubos de PCR marcados recentemente.
    5. Vortex ARN / ADNc esferas paramagnéticas específica e adicionar 99 ul de contas para cada tubo. Delicadamente toda pipetavolume para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Se começando com degradada-ARN, adicionar 193 ul de ARN / ADNc bem misturada esferas paramagnéticas específicos para cada tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Em seguida, colocar os tubos no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min. Retirar e descartar o sobrenadante.
    6. Adicionar 200 ul de etanol preparada de fresco de 70% (EtOH). Mantenha tubos em suporte magnético e tome cuidado para não perturbar as esferas. Incubar à temperatura ambiente durante 30 segundos, em seguida, remover e descartar o sobrenadante. Deixe os tubos em repouso à temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos para secar.
    7. Centrífuga descongelado quarto tampão temperatura de eluição a 600 × g por 5 s. Adicionar 11 ul de tampão de eluição a cada tubo e gentilmente pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 2 min. Colocar os tubos no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min. Transferir 8,5 mL de sobrenadante para tubos de PCR marcados recentemente.
  2. Fragmentação do rRNA empobrecido RNA
    1. Adicionar 8,5 mL elute, 8,5 privilegiada ul e 8,5 ul mix fragmento a cada tubo. Pipeta suavemente para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Colocar os tubos no aparelho de ciclos térmicos com o seguinte programa: tampa pré-aquecido a 100 ° C, 94 ° C durante 8 min, em seguida 4 ° C preensão.
      NOTA: Este passo destina-se a gerar um tamanho médio de inserção de 155 pb. Se tamanho médio fragmento da amostra de RNA é menor do que 200 pb, ignore esta etapa e vá para a First Strand cDNA Synthesis.

2. Síntese de ADNc

  1. Sintetizar cDNA First Strand
    1. Remover primeira mistura síntese da cadeia de -20 ° C e descongelamento à temperatura ambiente.
    2. Pré-programar o aparelho de ciclos térmicos com os seguintes ajustes: opção tampa de pré-aquecimento e ajustado para 100 ° C, em seguida 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 15 min, 70 ° C durante 15 minutos e manter a 4 ° C . Guardar o programa como "Sintetizar Strand."
    3. Centrífuga tubo descongelado-primeira vertente de síntese mix em 600 & #215; g durante 5 seg. Misture 1 ml de transcriptase reversa com 9 ul de primeira mistura síntese da cadeia.
    4. Adicionar 8 mL de síntese da primeira cadeia e mix de transcriptase reversa a cada tubo, gentilmente pipeta cima e para baixo 6x para misturar. tubos de centrífuga para 4 segundos usando uma velocidade fixa de mini mesa centrifugar a 6,0 xg para levar o líquido para baixo. Coloque tubos no termociclador e selecione Sintetizar Strand. Quando o termociclador atingir 4 ° C, remover os tubos e prosseguir imediatamente para sintetizar cDNA Segundo Strand.
  2. Sintetizar cDNA Segundo Strand
    1. Pré-aqueça termociclador a 16 ° C com tampa pré-aquecida a 30 ° C. Thaw segunda mistura principal vertente e tampão de re-suspensão em gelo. Em adiantamento, remover o frasco de contas paramagnéticas de 4 ° C e deixar em repouso durante pelo menos 30 min a trazê-los à temperatura ambiente.
    2. Adicionar 5 uL de tampão de ressuspensão a cada tubo de PCR. Centrífuga segunda mistura principal vertente a 600× g durante 5 seg e adicionar 20 ul a cada tubo de PCR. Colocar os tubos no termociclador pré-aquecido a 16 ° C durante 1 h. Quando a incubação estiver completa, remover do aparelho de ciclos térmicos e permite que os tubos voltar à temperatura ambiente.
    3. Vortex as esferas paramagnéticas até que eles são bem dispersa. Adicionar 90 ul de contas paramagnéticas bem misturado a cada tubo. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min. Colocar os tubos no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Remova e descarte 135 ul de sobrenadante em seguida, deixar tubos no suporte magnético para realizar lavagem de EtOH. Adicionar 200 mL preparados de fresco de 80% de EtOH a cada tubo, sem perturbar as esferas, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 30 seg. Remover e rejeitar todo o sobrenadante de cada. Repetir para um total de duas lavagens de EtOH a 80%.
    5. Deixe tubos repousar à temperatura ambiente durante 5 - 10 min para secar sobre o suporte magnético. Centrifugar a temperatur quarto descongeladotampão de ressuspensão e a 600 × g por 5 s. Retire os tubos de PCR de suporte magnético. Adicionar 17.5 ul de tampão de ressuspensão a cada tubo de PCR e gentilmente pipeta todo o volume 10x cima e para baixo para misturar completamente. Incubar os tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente.
    6. Colocar os tubos no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, transferir 15 sobrenadante ul (ADNc de cadeia dupla) para 0,2 ml de PCR tubos de strip.
      NOTA: Este é um ponto de paragem seguro quanto o cDNA pode ser armazenado a -20 ° C durante até 7 dias.

3. Biblioteca Preparação

  1. Termina ciclase 3 '
    1. Remover A-tailing mistura entre -20 ° C e descongelamento à temperatura ambiente. Pré-programar o aparelho de ciclos térmicos com os seguintes ajustes: escolher a opção de pré-aquecimento da tampa e definir a 100 ° C, em seguida, ajustado a 37 ° C durante 30 min, 70 ° C durante 5 minutos e manter a 4 ° C. Guardar o programa como "ATAIL70."
    2. Adicionar 2,5 uL de ressuspensãotamponar a cada tubo. Em seguida, adicionar 12,5 mL de mistura descongelada seguindo-A. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem. Colocar os tubos no termociclador e seleccionar ATAIL70. Quando a temperatura é termociclador a 4 ° C, remover os tubos de PCR no ciclizador térmico e prosseguir imediatamente para ligar adaptadores.
  2. Adaptadores ligadura
    1. Retire os tubos de adaptador de ARN adequadas, pare de tampão de ligação e tampão de ressuspensão a partir de -20 ° C e descongelamento à temperatura ambiente. Não remova o tubo de ligação mix de -20 ° C até que seja instruído a fazê-lo no protocolo. Retirar o frasco de contas paramagnéticas de 4 ° C e deixar em repouso durante pelo menos 30 min para trazer para a temperatura ambiente.
    2. Pré-aqueça o termociclador a 30 ° C e escolher a opção de pré-aquecimento da tampa e definido como 100 ° C. Centrifugar os tubos de adaptador de ARN descongeladas a 600 × g durante 5 seg. Imediatamente antes da utilização, remover o tubo de ligação mix de -20 ° Carmazenamento.
    3. Adicionar 2,5 mL de tampão de ressuspensão para cada tubo de amostra. Adicionar 2,5 uL de mistura de ligação. Devolver o tubo de ligação mistura a -20 ° C de armazenamento imediatamente após o uso. Adicionar 2,5 uL de ARN adaptador do índice descongelada para cada tubo de amostra. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem.
    4. tubos de centrífuga para 4 segundos usando um mini centrífuga de mesa velocidade fixa em 6,0 x g. Colocar os tubos no termociclador pré-aquecido. Fechar a tampa e incubar a 30 ° C durante 10 min.
    5. Retire os tubos de termociclador e adicionam-se 5 uL de tampão de ligação de paragem a cada tubo para inactivar a ligação. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem.
    6. Repetir a lavagem conforme descrito no ponto 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 42 ul de contas paramagnéticas mistos, e descartando 79,5 sobrenadante ul. Com os tubos no suporte magnético, deixe a amostras de ar seco à temperatura ambiente durante 5 - 10 min.
    7. Retire os tubos da tira PCR a partir dosuporte magnético e adicionar tampão de ressuspensão 52,5 uL a cada tubo. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 2 min. Colocar os tubos no suporte magnética à TA durante 5 min ou até que o líquido é clara. Transferir 50 uL de sobrenadante de cada tubo para novos tubos de PCR de 0,2 ml de tira. Tome cuidado para não perturbar as esferas.
    8. Repetir a lavagem conforme descrito no ponto 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 ul de contas paramagnéticas mistos, e descartando 95 sobrenadante ul. Com os tubos no suporte magnético, deixe a amostras de ar seco à temperatura ambiente durante 5 - 10 min.
    9. Retire os tubos da tira de PCR a partir do suporte magnético e adicionar tampão de ressuspensão 22,5 uL a cada tubo. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem.
    10. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 2 min. Colocar os tubos no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min ou até que o líquido é clara. Transferir 20 uL de sobrenadante de cada tubo para umnovo 0,2 ml tubo tira PCR. Tome cuidado para não perturbar as esferas. Este é um ponto de paragem seguro e ADNc podem ser armazenadas a -20 ° C durante até 7 dias.

4. Biblioteca Amplification

  1. Enriquecer fragmentos de DNA
    1. Retirar a mistura de PCR mestre, cocktail de PCR primer e tampão de ressuspensão do armazenamento a -20 ° C e descongelamento à temperatura ambiente. Retirar o frasco de contas paramagnéticas de armazenamento de 4 ° C e deixar em repouso durante pelo menos 30 min para trazer para a temperatura ambiente.
    2. Pré-programar o aparelho de ciclos térmicos com os seguintes ajustes: escolher a opção de tampa pré-aquecimento e ajustado para 100 ° C, em seguida, definir desnaturação inicial a 98 ° C durante 30 seg, 15 ciclos de desnaturação a 98 ° C durante 10 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 30 segundos, um ciclo de extensão final a 72 ° C durante 5 minutos e manter a 4 ° C. Guardar o programa como "PCR".
    3. Centrifugar o mestre PCR descongeladomisturar e iniciadores de PCR tubos a 600 × g durante 5 seg. Adicionar 5 uL de iniciadores de PCR descongeladas para cada tubo de amostra. Adicionar 25 ul de descongelado PCR Master Mix para cada tubo de amostra. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem.
    4. Colocar os tubos tapados tira de PCR no ciclizador térmico pré-programado. Feche a tampa e executar o programa de PCR. Quando é concluída por PCR, remover tubos do termociclador e manter em gelo.
    5. Repetir a lavagem conforme descrito no ponto 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 ul de contas paramagnéticas mistos, e descartando 95 sobrenadante ul. Com os tubos no suporte magnético, deixe a amostras de ar seco à temperatura ambiente durante 5 - 10 min.
    6. Retire os tubos do suporte magnético e adicionar tampão de ressuspensão 32,5 ul a cada tubo de amostra. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Colocar os tubos de PCR no suporte magnético à temperatura ambiente durante 5 min ou até que o líquido é clara. Em seguida, transferir 30 ul supernatant a 0,2 ml tubos de PCR fresco.
    7. Realizar quantificação de ADNc utilizando um fluorómetro 7 e determinar a qualidade de ADNc, utilizando um sistema de electroforese capilar 8.
      NOTA: Este é um ponto de paragem seguro e ADNc podem ser armazenadas a -20 ° C durante até 7 dias. Nota: Esta biblioteca é considerado uma biblioteca de RNA-Seq.
      Os passos subsequentes levar a uma biblioteca de captura.

5. A hibridização, Captura e Sequencing

  1. Hibridização multiplexado
    1. Remover sondas costume hidratada, ADN Cot-1, oligos de bloqueio universal, e o adaptador de bloqueio oligos específicos de -20 ° C e descongelar em gelo.
    2. Em um ligamento 1,5 tubo de baixo ml, misture 500 ng de ADN (125 ng por amostra quando multiplexação 4 amostras), 5 jul Cot-1 DNA (1 mg / mL), oligos bloqueio universais 1UL, p7 0,5 mL (6 nucleotídeo) adaptador específico Os oligos de bloqueio (esta quantidade pode necessitar de ser ajustado dependendo condiciona multiplexons) e p7 0,5 mL (8 nucleotídeo) Adaptador oligos bloqueadores específicos (este montante poderá ter de ser ajustada dependendo das condições multiplex).
    3. Coloque o tubo de amostra em um concentrador de vácuo com o tampão aberto voltado para a direção oposta de rotação. conteúdo seco a 45 ° C durante 20 min ou até completa evaporação do líquido.
    4. Ressuspender o conteúdo seco com 8,5 ul 2x tampão de hibridação, 3,4 ul componente hibridação A e água livre de 1,1 ul nuclease. Permitir 10 min para a ressuspensão e vortex cada 2,5 min. Transferir material ressuspenso para um tubo de PCR de 0,2 ml e incuba-se a 95 ° C durante 10 minutos num termociclador.
    5. Remover o tubo da amostra de hibridação termociclador e adiciona-se 2 ul de sondas de mercadorias ressuspensas a uma concentração de 1,5 pmoles / ul. Alternativamente, adicionar 4 mL de sondas de mercadorias ressuspensas a uma concentração de 0,75 pmol / uL. Incubar a reacção de hibridação durante a noite (16-24 horas) a 65 ° C.
      NOTA: Probes adquiridos de vários fornecedores podem ser utilizados e as instruções do fabricante devem ser seguidas. A duração do passo de hibridação podem também variar.
  2. Bead Preparação e Captura
    1. Remover garrafa de esferas paramagnéticas acopladas com estreptavidina de 4 ° C e equilibrar à temperatura ambiente durante 30 min. Diluir lavagem 10X buffers (I, II, III e rigorosas) e tampão de lavagem de 2,5x Bead para criar soluções de trabalho 1x.
    2. Aliquota de 140 ul de 1x tampão de lavagem I num para um novo tubo de 1,5 ml. todo o calor quantidade de 1x tampão rigorosa e alíquota de 1X tampão de lavagem I, a 65 ° C num bloco de aquecimento durante pelo menos 2 h.
    3. Alíquota de 100 ul de contas paramagnéticas acopladas com estreptavidina por captura para um tubo de 1,5 ml. Coloque no ímã e descartar o sobrenadante. Adicionar 200 mL de tampão de lavagem talão por 100 esferas ul e vortex por 10 segundos. Coloque em ímã para 2-5 min ou até que o sobrenadante é clara. Uma vez sobrenadante é clara, descartá-lo e returfa uma vez mais para um total de duas lavagens.
    4. Após a remoção do tampão de lavagem talão, adicionar tampão de lavagem talão volume igual ao volume inicial de partida (ou seja, 100 ul para uma captura). Ressuspender e transferir para um tubo de PCR de 0,2 ml. Coloque tubo na cremalheira magnética para 2-5 min ou até que o sobrenadante é clara. sobrenadante de descarte.
    5. Com tanto a amostra de hibridação e grânulos no termociclador a 65 ° C, transferir a mistura de hibridação para o tubo de talão e pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar a 65 ° C durante 45 min, vortex e girar para baixo amostra durante 4 seg utilizando uma velocidade fixa (6,0 xg) de mesa mini-centrifugador.
  3. Bead Wash
    1. Retire o tubo de captura do termociclador e adicione 100 ml de pré-aquecida 1X tampão de lavagem I do tubo e vortex por 10 segundos para misturar. Transfira a mistura para uma baixa ligamento 1,5 tubo fresco ml. Coloque o tubo num suporte de separação magnética e permitir 2-5 min para a separação ou até sobrenadante é clara. Dsobrenadante iscard.
    2. Adicionar 200 mL pré-aquecido tampão de lavagem rigorosa 1x e pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar a 65 ° C durante 5 min. Colocar o tubo no suporte de separação magnética e permitir 2-3 min para a separação ou até que o sobrenadante é clara. sobrenadante de descarte. Repita lavagem rigorosa uma vez mais para um total de duas lavagens.
    3. Adicionar 200 mL de quartos 1x temperatura tampão de lavagem I e vortex por 2 min para misturar. Colocar o tubo no suporte de separação magnética e permitindo 2-5 min para a separação ou até que o sobrenadante é clara. sobrenadante de descarte.
    4. Adicionar 200 mL 1x temperatura ambiente tampão de lavagem II e vortex por 1 min para misturar. Colocar o tubo no suporte de separação magnética e permitindo 2-5 min para a separação ou até que o sobrenadante é clara. sobrenadante de descarte.
    5. Adicionar 200 mL 1x temperatura ambiente tampão de lavagem III e vortex por 30 segundos para misturar. Colocar o tubo no suporte de separação magnética permitindo 2-5 min para a separação ou até sobrenadanteestá claro. sobrenadante de descarte.
    6. Retire o tubo do rack separação magnética e adicionar 20 mL de água livre de nuclease para voltar a suspender as contas. Misture bem, pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
  4. Pós Captura PCR Amplification
    1. Remover esferas paramagnéticas de 4 ° C e equilibrar à temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Remover o arranque a quente da mistura de PCR Ready (2x) e de mistura de PCR Primer entre -20 ° C e descongelamento à TA e depois colocar em gelo. Prepare biblioteca Mix Master amplificação através da combinação de 27,5 ul de 2x começo quente PCR Ready Mix, com 2,75 l de PCR Primer 1 e 2,75 ul de iniciador de PCR 2 (esses volumes são para uma biblioteca de hibridização, acrescido de 10% de excesso).
    3. Configuração da reacção no tubo de PCR adicionando 20 ul de pérolas de mais ADN capturado com 30 ul de amplificação de biblioteca de mistura principal para um volume total de 50 ul. Cap tubo corretamente e vortex para misturar. tubos de centrífuga para 4 segundos usando um mini guia de velocidade fixale-top centrífuga em 6,0 x g.
      1. Defina-se o seguinte programa de PCR: escolher a opção de tampa pré-aquecimento e ajustado para 100 ° C, em seguida, definir desnaturação inicial a 98 ° C durante 45 seg, 10 - 12 ciclos de desnaturação a 98 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 65 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 60 segundos, um ciclo de extensão final a 72 ° C durante 60 segundos e manter a 4 ° C.
    4. Remover a amostra de termociclador e adicionar 75 uL esferas paramagnéticas. Misturar bem e incubar à TA durante 15 min.
    5. Coloque tubos no ímã à temperatura ambiente durante 2-3 minutos e, em seguida, remover o sobrenadante. Lavar os grânulos no ímã adicionando 200 mL de 80% de etanol, incubação durante 30 segundos, em seguida, remover o sobrenadante. Repita o procedimento para um total de dois 80% lavagens.
    6. Incubar à temperatura ambiente durante 5 - 10 min para permitir que os grânulos para secar. Não mais de seca a rachar. grânulos Ressuspender em 22 ul de Tris-EDTA a pH 8,0 (TE 1X Solução) e permitem 3 min durante a eluição. Coloque amostra no ímã para 3 - 5 min then transferência de 20 l de produto eluido a um baixo-bind 1,5 tubo fresco ml, garantindo que não haja contas são transitadas.
    7. Execute quantificação de cDNA capturados usando fluorômetro 7 e determinar a qualidade do cDNA capturado usando um sistema de eletroforese capilar 8.
  5. Área de trabalho Sequencer Carregando Processo 9
    1. Diluir biblioteca de ADNc capturado para uma concentração final de 4 nM, utilizando 10 mM Tris-Cl pH 8,5 com 0,1% de Tween 20. Descongelar NaOH 10 N e tampão de hibridação em gelo. Cerca de 30 minutos antes do uso, sequenciador de desktop caixa de kit de reagentes v2 1 em água RT degelo. Não encha acima linha de preenchimento MAX 10. Por favor note que este é um procedimento específico plataforma de sequenciamento e podem variar de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Prepare 1 ml de NaOH 0,2 N, combinando 20 ul de NaOH 10 N, com água isenta de nuclease 980 ul num tubo de microcentrífuga (sempre preparar fresco). Diluiu-se a biblioteca phix (controlo biblioteca) de 4 nM porcombinando 2 uL de 10 nM de controlo biblioteca com 3 ul de 10 mM Tris-Cl pH 8,5 com 0,1% de Tween 20.
    3. Desnaturar biblioteca final e controle de biblioteca através da combinação de 5 l de biblioteca de 4 nM com 5 mL de NaOH 0,2 N e vortex brevemente para misturar. tubos de centrífuga para 4 segundos usando uma velocidade fixa mini-table-top centrífuga em 6,0 x g. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos para desnaturar bibliotecas.
    4. Adicionar 990 ul de tampão de hibridação pré-arrefecido para os tubos contendo 10 ul de bibliotecas desnaturadas. Isto resulta numa biblioteca de 20 pM. Marque a biblioteca de 20 pM desnaturado com a data e pode ser armazenado durante até 3 semanas a -20 ° C.
    5. Misturar 375 mL de 20 pM controlo biblioteca com 225 ul de tampão de hibridação pré-gelada e controlo biblioteca diluído para resultar numa biblioteca 12:05 controlo. Gire várias vezes para misturar a solução.
    6. Combine 594 mL de biblioteca definitiva desnaturada com 6 ul de 12:05 controle biblioteca desnaturado e vortex para misturar. Defina o SAMP combinadole biblioteca e controle de biblioteca de lado em gelo até amostras estão prontos para carregar no cartucho de reagente sequenciador desktop.

Análise 6. Os dados

  1. Avaliação da Qualidade de sequência
    1. Calcule a qualidade dos dados da sequência cru (arquivos fastq) utilizando sequência de avaliação da qualidade 11.
      NOTA: Este passo ajuda a avaliar os dados antes de ser submetido a análise a jusante. O software é executado com parâmetros in-construídos e produz um conjunto de métricas para cada arquivo fastq.
  2. Alinhamento
    1. Sequência alinhar lê (arquivos fastq) para o hg19 genoma de referência humana e transcriptoma usando Tophat2 12 (versão 2.0.10), proporcionando transcrições conhecido como um arquivo de GTF. A saída é sob a forma de um formato de alinhamento binário chamado o ficheiro de BAM.
    2. Execute as etapas de pós-processamento, nomeadamente a triagem e indexação usando Samtools 13 (versão 0.1.19) No arquivo BAM. Execute duplicado marcação, reordenando SAM, insira o cálculo do tamanho e adicionar ou substituir grupos de leitura, utilizando ferramentas Picard 14 (versão 1.84).
  3. Avaliação da Qualidade RNA-Seq
    1. Calcular uma série de métricas de controle de qualidade para os dados de RNA-Seq usando a avaliação da qualidade RNA-Seq. A entrada para este programa é um arquivo BAM 15 do alinhamento Tophat2. A saída é um arquivo HTML que lista contagem de leitura total duplicatas, mapeou ler e Percentual de rRNA, etc., entre outros.
  4. Chamado Variant
    1. Use STAR (versão 2.4.0) 16 para alinhamento e, em seguida, chamar único nucleotídeo variantes usando de GATK (Versão 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM etapas de pós-processamento e critérios de filtragem para a bandeira e eliminar falsos positivos a partir da saída.
  5. Expressão genetica
    1. Calcular expressão gênica usisoftware ng Abotoaduras (versão 2.1.1) from suite Tuxedo 18.
      NOTA: A entrada é um arquivo BAM da ferramenta de alinhamento Tophat2. A saída é produzido a nível isoforma, gene e transcrição, onde a expressão é calculada como FPKM (fragmentos por quilobase por milhão mapeada Lê).
  6. chamada de fusão
    1. Chamada fusões de cada amostra utilizando ChimeraScan 19 (versão 0.4.5), Tophat Fusão 20 personalizada e TRUP 21. Anotar as fusões de domínios usando Oncofuse 22 (versão 1.0.9b2).

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Representative Results

A destacando esquemática passos chave na captura de RNA-Seq é mostrado na Figura 1. Quatro linhas celulares de cancro com mutações conhecidas foram usadas para demonstrar a eficácia da técnica de captura de RNA-Seq (K562 com ABL1 fusão, LC2 com fusão Ret, EOL1 com PDGFRalpha fusão e RT- 4 com a fusão FGFR3). As quatro amostras foram reunidas e sequenciados com 2x 100 pb lê num sequenciador de desktop, que gera arquivos FASTQ. arquivos FASTQ foram executados através de um gasoduto análise de RNA-Seq, que inclui cinco componentes principais: 1) avaliação do controle de qualidade, 2) o alinhamento com transcriptoma humano, 3) quantificação de expressão gênica, 4) de chamada de fusão, e 5) chamada variante. O arquivo de alinhamento (BAM) é usado para chamar variantes de nucleotídeo único e calcular a expressão do gene. Fusões são chamados usando chamadas de fusão, tais como Fusão TopHat (efectuando o seu próprio alinhamento) ea saída é anotada using software de detecção de fusão.

Comparação da expressão de genes a partir de RNA-Seq captura e demonstra o enriquecimento dos transcritos alvo de 10 a 1000 vezes utilizando o método de captura (Figura 2A). Além disso, a Figura 2B mostra um aumento na percentagem de leituras de mapeamento para as regiões de transcrição-alvo utilizando a captura em comparação com RNA-Seq. Avaliação de medidas de controle de qualidade é representado na Figura 3. Capturar e RNA-Seq desempenho igualmente em termos de alinhamento para o transcriptoma (3A, 94% vs. 93%) e tamanho médio de inserção (3B, 174 pb contra 162 pb). Usando o método de captura, um percentual maior de regiões ex�icas são sequenciados (3C, 77% vs. 60%), e, inversamente, uma menor percentagem de regiões intrônicas são sequenciados (3D, 4% vs. 20%). As contagens totais de leitura por amostra estão representadas na 3E (3F, 4% vs 15%).

Saída de detecção de fusão mostrado na Tabela 1 é gerado com fusão normalizada apoio lê. Captura de RNA-Seq foi bem sucedida na detecção de fusões para todas as quatro linhas celulares. Comparação das variantes de nucleotídeos únicos chamados em regiões de captura e RNA-Seq sobreposição é exibida na Figura 4. Isso demonstra uma alta concordância de variantes entre Captura e RNA-Seq dentro da região de destino.

figura 1
Figura 1. Esquema de RNA-Seq captura Passos. Nesta demonstração experimental, o RNA é o primeiro depleTed de ARN ribossomal, seguido por fragmentação química e síntese de DNA complementar (cDNA), utilizando transcriptase inversa. Em seguida, o ADNc é poliadenilado e ligado em ambas as extremidades para adaptadores específicos da plataforma para gerar uma biblioteca. Somente bibliotecas de cDNA com adaptadores adequados são, em seguida, amplificado por PCR. As bibliotecas são então hibridados com sondas de oligonucleótidos personalizados e capturados usando esferas magnéticas. Esta pequena quantidade de biblioteca capturado deva ser amplificado por uma segunda vez para ter o suficiente para o próximo sequenciamento geração. Várias bibliotecas pode então ser sequenciados em paralelo. Dados de sequenciamento é analisado para eventos de ARN de interesse, tais como fusões de genes, expressão ou mutações. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. COMPARAÇÃO de genes alvo na captura contra o RNA-Seq. A, a comparação da expressão gênica entre Captura e RNA-Seq em quatro linhas celulares de cancro K562, LC2, EOL1 e RT-4 medidos por leituras por quilobases por milhão mapeados lê (FPKM) (Log escala). Genes específicos de interesse são enriquecidos (azul) em comparação com genes não-alvo (cinza). B, Percentagem de lê mapeamento para a região alvo é aumentada em captura contra bibliotecas RNA-Seq em quatro linhas celulares de cancro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 3
Figura 3. Sequenciação Métricas de Captura contra o RNA-Seq em linhas celulares de cancro da Quatro Representante. A, Percentagem de lê mapeamento para o transcriptoma, C, percentagem de leituras em regiões ex�icas. D, porcentagem de leituras em regiões intrônicas. E, sequenciamento total lê. F, Percentagem de lê mapeamento para RNA ribossomal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Linha celular Fusão Type Library total de Lê No alvo Lê Fusão normalizada Apoio Lê (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TRACIMA
K562 BCR-ABL RNA-Seq 150300482 279438 0 438 0
Capturar 9.341.148 7.566.087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNA-Seq 128861790 307566 0 97 0
Capturar 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNA-Seq 135321406 225222 0 0 170
Capturar 9.317.418 7.680.818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNA-Seq 161350024 208741 0 131 469
Capturar 8.305.950 6.563.574 358 88 34

Tabela 1. Detecção Fusion for captura contra o RNA-Seq de K562, LC2, EOL1 e RT-4. Esta tabela exibe quatro linhas celulares de cancro e três algoritmos de detecção de fusão diferentes, TopHat2, ChimeraScan e TRUP utilizados nesta demonstração. Esta tabela demonstra a capacidade para detectar fusões com captura utilizando menos do que 10 milhões Total de leituras em comparação com mais de 60 milhões lê utilizado para a RNA-Seq. Fusão suportando leituras foram calculados dividindo-se a fusão de apoio lê por quinase lê, multiplicado por um milhão.

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Figura 4. SNV ligando para captura contra RNA-Seq. Estes diagramas de Venn mostra o número de variantes de um Único Nucleótido (SNVS) que foram detectados por captura e RNA-Seq para cada uma das quatro linhas celulares (K562, LC2, EOL1 e RT-4). Isto ilustra alta concordância do SNVS entre Captura e RNA-Seq dentro segmentada por região:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) e RT-4 (73,9%) Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

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Discussion

RNA-Seq Capture é uma estratégia intermediária entre RNA-Seq e microarray abordagens para avaliar uma parte selecionada do transcriptoma. As vantagens de captura incluem o custo, tempo de resposta rápido reduzida num sequenciador de mesa, de alto rendimento, e a detecção de alterações genómicas. O método pode ser adaptado para caracterizar ARN não codificadoras 23, um único nucleótido detectar variantes 4-6, examinar o RNA splicing, e para identificar fusões de genes ou de rearranjos estruturais 24. Além disso, esta abordagem pode ser aplicada a amostras clínicas ou processados ​​que tenham sido submetidos a fixação com formalina e embebidos em blocos de parafina 24,25.

Existem várias vantagens significativas de captura de RNA-Seq, em comparação com microarray, PCR em tempo real quantitativo, de Sanger de sequenciação e sequenciação de ADN. Microarray é limitado por um fundo elevado devido à hibridação cruzada e ligação não específica de sondas. Quantificação de genes com Lexpressão ow é restrita devido ao ruído de fundo, enquanto medições de genes altamente expressos são afetados pela saturação de sinal 1. Comparado a captura de RNA-Seq, PCR em tempo real prova difícil de reproduzir. Além disso, RNA-Seq permite a detecção de novos transcritos, exige menos material de partida de entrada e pode detectar splicing alternativo 26 .Em contraste com Sanger de sequenciação, RNA-Seq permite um maior rendimento e a análise de baixo miARN expressa. Seqüenciamento Sanger provou ser uma ferramenta valiosa para a verificação da fusões com junções exão-exão conhecidos e mutações no DNA somáticas, no entanto identificação de novos fusões é dificultada por exigências de um ponto de interrupção candidato priori. sequenciamento de DNA não é custo eficiente, requer maior espaço de armazenamento para os dados, e é incapaz de detecção de modificações pós-transcricional.

Há vários passos críticos envolvidos na captura de RNA-Seq. Em primeiro lugar, para melhorar o rendimento de produtos de biblioteca doRNA / cDNA contas paramagnéticas específica e esferas paramagnéticas durante lavagens, ser cauteloso para não mais secar as contas, o que levará à perda de rendimento. Também não, fazer sub-secar os grânulos, garantir todo o etanol é removido dos tubos de amostra, tal como o etanol pode reduzir o rendimento de ADNc. Em segundo lugar, a hibridação de bibliotecas de ADNc com sondas complementares é dependente da temperatura consistente, recomendamos aquecimento tampão de lavagem I e rigoroso para Tampão 65 ° C durante pelo menos duas horas de antecedência. Além disso, após a hibridação é essencial para manter a 65 ° C durante os passos de ligação e de lavagem. As sondas utilizadas aqui foram projetados para os exons de genes de interesse para o desenvolvimento de drogas, incluindo quinases, genes envolvidos em rearranjos comuns, como fatores de transcrição, e arrumação genes. Além disso, o conteúdo gene é personalizável e tamanhos de painéis de captura pode variar. Além disso, como nova informação sobre regiões genómicas surge, as sondas complementares podem ser concebidos e adicionou-se tEle painel de captura existente.

Avaliação de métricas de alinhamento, especificamente taxa on-alvo, fornece informações sobre quão bem a região alvo foi enriquecido. Uma taxa baixa no-alvo pode ser devido a uma falha de hibridação e de captura, em que a região alvo desejado não foi capturado e enriquecido. Neste caso, uma re-hibridação e a captura do conjunto de biblioteca devem ser executadas. Uma taxa baixa no-alvo também pode ser devido a uma falha de esgotar rRNA, que pode ser confirmada através do cálculo da percentagem de ARNr nas amostras. alta porcentagem de rRNA dentro da amostra vai exigir re-preparação da amostra começando com depleção de rRNA. Além disso, se a concentração de biblioteca desce abaixo dos requisitos para a hibridação e de captura, seria aconselhável para optimizar a quantidade de entrada de partida para o tipo de amostra e a qualidade (gama: 50-1.000 ng).

Embora existam várias vantagens para aplicações de RNA-Seq direcionados, também há limitações paraconsiderar. As amostras com má qualidade RNA baseado em RIN ou grau de fragmentação não pode produzir bibliotecas de qualidade para sequenciação. Vários grupos têm demonstrado sucesso com amostras embebidos em parafina fixadas em formalina, no entanto, existem amostras que não vai passar para o sequenciamento 24,25,27. Além disso, como RNA-Seq captura concentra-se em transcrições conhecidos, ele perde os benefícios de RNA-Seq imparcial para romance ou transcrições não anotadas. Além disso, para a detecção de SNP, métodos RNA-Seq só pode detectar mutações de transcritos expressos.

oportunidades futuras de captura de RNA-Seq incluem a investigação e aplicações clínicas. Recente descoberta de milhares de longo ARN não codificante e o seu papel na biologia exigirá caracterização focado. Na clínica, RNA-Seq Captura pode estender-se para além dos testes de pesquisa e traduzir-se em ensaios clínicos para caracterizar doenças humanas, como o cancro, as doenças infecciosas, e teste não-invasivo. Em conjunto com genômica approa sequenciaçãoChes, RNA-Seq captura pode ser integrado para estudar e caracterizar o genoma expresso.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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