Обнаружение иконографии в естественных условиях , CaspaseTracker биосенсор

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Воскресение Христово технически сложно обнаружить в естественных условиях , потому что клетки, которые обратили вспять процесс гибели клеток может быть морфологически отличаются от нормальных здоровых клеток. Здесь мы описываем протоколы для обнаружения и отслеживания клетки, которые проходят иконографии в живых животных с помощью нашей недавно разработанных в естественных условиях системы биосенсор CaspaseTracker.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Воскресение Христово (греческого «восходящая к жизни») явление недавно обнаружили клеток восстановления которой умирая клетки можно отменить смерти поздней стадии клеточных процессов, которые обычно считаются сути необратимым. Содействие иконографии может в принципе спасения или заповедник ранения клетки, которые трудно заменить например кардиомиоцитов или нейроны, способствуя тем самым восстановлению тканей. И наоборот подавления иконографии в раковых клетках, проходят apoptosis после противораковых терапий, может обеспечить смерть клетки рака и уменьшить вероятность рецидива. Однако эти исследования сдерживаются отсутствием инструментов для отслеживания судьбы клеток, которые проходят иконографии в живых животных. Задача заключается в определении клетки, которые обратили вспять процесс смерти клеток, несмотря на их морфологически нормальных внешний вид после восстановления. Для преодоления этой трудности, мы разработали дрозофилы и млекопитающих CaspaseTracker биосенсор систем, которые могут идентифицировать и постоянно следить за anastatic клетки в vitro или в естественных условиях. Здесь мы представляем в vivo протоколы для генерации и использования системы CaspaseTracker двойной биосенсора для обнаружения и отслеживания иконографии в Drosophila melanogaster после переходных воздействия раздражителей смерти клетки. В то время как обычные биодатчики и протоколы можно пометить клетки активно проходят смерть клетки apoptotic, CaspaseTracker биосенсор постоянно можно пометить клетки, которые оправились после активации caspase - признаком поздней стадии апоптоза, и одновременно определите активные apoptotic процессы. Этот биодатчик можно также отслеживать восстановление клеток, которые пытались другие формы смерти клетки, которые прямо или косвенно вовлечены активность каспазы. Таким образом этот протокол позволяет нам постоянно отслеживать судьбу этих клеток и их потомства, облегчения будущих исследований биологических функций, молекулярные механизмы, физиологических и патологических последствий и терапевтические последствия Воскресение Христово. Мы также обсуждаем соответствующие элементы управления для различения клетки, которые проходят иконографии от тех, которые отображают активность каспазы-apoptotic в естественных условиях.

Introduction

Программированной гибели клеток, например, апоптоз, играет важную роль в эмбриональном развитии и нормальный гомеостаз, устраняя нежелательные, раненых или опасные клетки многоклеточных организмов1,2,3. Потеря равновесия между клеточной смерти и выживания может привести к фатальным последствиям таких, как рак, сердечная недостаточность, аутоиммунные заболевания и дегенерации4,5,6,,78. Активация палача, который caspases традиционно считается «точка невозврата» в апоптоз9,10,11, как он вызывает быстрое и массовое разрушение клеточных12, 13,14,,1516. Вызов этой общей догма, мы продемонстрировали, что искусственный умирающего первичные элементы и раковые клетки можно восстановить не только после активации caspase, но также следующие важные ячейки признаки смерти, включая плазматической мембраны блеббинг, сжатие клеток, митохондриальной фрагментации, выпуск митохондрий цитохрома c в цитозоль, ядерной и конденсацию хроматина, повреждение ДНК, ядерных фрагментации, клеток поверхностного воздействия фосфатидилсерина (PS) и формирование apoptotic тела 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Мы предлагаем, что воскресение — это явление восстановления внутренней ячейки, как умирающий клеток можно восстановить после удаления клеток смерть раздражители17,18,19,20, 21. Мы придумал термин «Воскресение» (Αναστάσης)18, что означает «растет к жизни» в переводе с греческого, до описать это явление восстановления неожиданные клеток. Наши наблюдения иконографии подкрепляется последние независимые исследования, которые также выявить восстановление клеток после Фосфатидилсерин экстернализации22,23,24, ограниченный митохондриальной наружной мембрана permeabilization25, активация линии смешанных киназа как (MLKL) и клеток усадка26.

Характеризуя механизмы, регулирующие Воскресение Христово будет иметь радикальным изменениям физиологических и патологических терапевтического последствия. Воскресение Христово может представлять ранее неизвестных цитопротективного механизм для спасения или сохранить важные постмитотических клеток и тканей, которые трудно заменить и, возможно, учетная запись для разворота сердечной недостаточности, желудочковая разгрузки с левого желудочка помощь после травмы мозга32устройства (LVADs)27,28, восстановление фоторецепторных клеток после переходных воздействия чрезмерной свет29,30,31, или ремонт нейронов. Если так содействия иконографии может повысить восстановления клеток и тканей. И наоборот Воскресение Христово может быть неожиданным побег тактика, используемая раковые клетки выжить вызывая клеток смерть терапии, вызывая рак повторения17,18. Таким образом подавляя иконографии смерти раковые клетки во время и после лечения рака может быть Роман терапевтические стратегии для лечения рака путем предотвращения их возобновления.

Во время процесса иконографии мы обнаружили, что некоторые восстановленные клетки приобрела постоянных генетические изменения и прошли онкогенных преобразования, вероятно, из-за повреждения ДНК понесенные в апоптоз18,20,21 . Вспять процесс смерти повреждение ДНК клеток может быть механизмом tumorigenesis, потенциально лежащие в основе наблюдения, что повторные повреждения тканей увеличивает риск развития рака в различных тканях, таких, как хронический термической травмы пищевода индуцированной потребление очень горячие напитки33,34,35, повреждение печени из-за алкоголизма36,37, эволюция опухоли после генотоксичных рака терапии38, 39,40и разработка новых видов рака от нормальных тканей, которые возникают в периоды между циклами терапия против рака41,42,,4344 . Значение true, если ориентация иконографии может предотвратить или задержать развитие рака и прогрессии. Мы обнаружили, что голод индуцированной умирающие клетки семенозачатка проходят иконографии в повторную отправку дрозофилы19.  Если иконографии встречается в зародышевых клеток с повреждения ДНК, это может быть счет для наблюдения, что продолжительное экологический стресс способствует развитию генетических заболеваний. Например голод способствуют развитию следующих наследуемых болезней, таких как диабет и ишемической болезни сердца45. Таким образом воскресение понимание может привести к стратегии для предотвращения развития наследуемые заболеваний, вызванных этой потенциальным механизмом.

Чтобы использовать открытие иконографии и направить его в разработке инновационных методов лечения, важно изучить причину и следствие иконографии в живых животных. Однако это технически сложно идентифицировать и отслеживать anastatic клетки в естественных условиях, потому что клетки, которые оправились от процесса смерти клетки появляются морфологически отличаются от нормальных здоровых клеток, и нет никаких биомаркер иконографии выявлены еще17,18,21. Для решения этих проблем, мы недавно разработали новый в vivo caspase биосенсор места для «CaspaseTracker»19, идентифицировать и отслеживать клетки, которые выживают после активацию caspase19,46, апоптоз Отличительной чертой апоптоз10,14. Отличить его от «реального времени» caspase биодатчики Скат12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50,51 C3AIs и iCasper52 , обнаруживать активность каспазы продолжается, CaspaseTracker биосенсор дополнительно включает способность постоянно ярлык клетки что Экспресс caspase деятельность даже временно. Таким образом CaspaseTracker биосенсор позволяет долгосрочные отслеживания иконографии после обращения вспять caspase опосредованной ячейки смерти процесс в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) подготовка CaspaseTracker биосенсор мух

  1. Анестезировать мух с CO2и использовать кисть для передачи 7 до 10 caspase чувствительных Gal4 (DQVD)19 девственной женщины и 7 10 G-Trace53 Gal4 репортер молодых мужчин мух (или наоборот) в же флакон с летать продовольствия и пасты свежих дрожжей.
    Примечание: Крест Gal4 каспазы чувствительных (DQVD) и G-Trace мух будет производить CaspaseTracker потомства мух. Крест Caspase -вчувствительных (DQVA)19 Gal4 и G-Trace мух даст отрицательный контроль мухи (см. обсуждение). Свежие дрожжи вставить служит источником белка для повышения яйценоскости, так что увеличивается количество потомства. Выберите девственной женщины и молодые мужчины летит согласно их фенотипов54.
  2. Инкубировать мух на 18 градусов по Цельсию (oC) во время крест 3-7 дней, а затем передать мух на новый флакон, чтобы настроить новый крест на 18 ° C. Продолжать инкубировать оригинальный флакон при 18 ° C до потомства мухи Эклоз.
    Примечание: Передать новые пузырьки во избежание переполненности потомства на оригинальный флакон родительского мух. Родительский мух могут производить потомство с свежих продуктов и вставить дрожжей в первые 2-3 переключатели, а затем со временем значительно снизится производительность. Повышение мух 18 ° C может уменьшить неспецифичный сигнал CaspaseTracker биосенсора (см. обсуждение).
  3. Выберите потомков летит с правильным фенотипов54 для следующих экспериментов.
    Примечание: Трансгенов caspase чувствительных Gal4 и G-Trace здесь расположены на второй хромосоме, сбалансированный с CyO балансировки. Выбор номера фигурные крыло потомства (без CyO), который имеет обе трансгенов caspase чувствительных Gal4 и G-Trace.

2) применение переходных клеток смерть индукции CaspaseTracker биосенсор мух

  1. Передача 10-20 недавно eclosed самка летит в новый флакон с свежие покупать продукты и свежие дрожжи вставить за 1 день на 18 ° C, чтобы позволить камере производство яиц, женских.
    Примечание: Сохраняя самка с мужской мух могут повысить производство яиц камеры.
  2. Чтобы побудить яйцо камер проходят apoptosis путем холодного шока, передачи самка летит в новый пустой флакон, который затем помещается в-7 ° C в течение 1 ч.
    Примечание: холодный шок повреждает клетки, вызывая плазматической мембраны разрыв55,56.
  3. Побудить яйцо камер проходят apoptosis голодной белки, передать женского мух новый флакон с 8% сахарозы и 1% агар пищи на 18 ° C в течение 3 дней.
    Примечание: Белка голода (не протеиновый корм) могут вызвать яйцо камер проходят apoptosis57,,5859 и autophagy60,61. Переключитесь мух новый флакон с 8% сахарозы и 1% агар пищу каждый день держать оптимальное состояние сахарозы покупать продукты питания.
  4. Передача подчеркнул мухи обратно в новый флакон с свежие покупать продукты и свежие дрожжи паста для 3 дней при 18 ° C, чтобы дать им возможность восстановить. Вскрыть голодали и морили голодом восстановленные мух для получения яиц камер в яичниках как описано62.
    Примечание: Для того чтобы рассечь дрозофилы получить яичников, анестезировать мух с CO2и использовать 2 пары щипцы для удаления летать голову и используйте щипцы для вытягивания база брюшной полости для удаления яичников мух.

3) фиксации и пятнать расчлененных яйцо камер для изображений

  1. Передать расчлененных яйцо камер вместе с около 0,5 мл фосфатный буфер (PBS) 1 мл пробирок. Разрешить яйца, чтобы успокоиться.
    Примечание: Герб пластиковые наконечники с бычьим сывороточным альбумином (БСА) растворяют в воде или PBS для предотвращения яйцо камер держаться на поверхности пластиковой советы 1%. Выполните следующие процедуры в темноте, чтобы избежать Фотообесцвечивание Красного флуоресцирующего белка (ППП, также известный как DsRed) и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в камерах яйцо.
  2. Удалите PBS, дозирование, а затем применить параформальдегида 4% 0,5 мл в PBS исправить яйцо камер при комнатной температуре в темноте для 20-30 мин.
    Примечание: Примените нежное поворот в этом и следующих шагов инкубации.
  3. Удалите параформальдегида, дозирование, а затем промывают яйцо камеры с 0,5 мл PBST (PBS + 0.1% тритон X-100) за 3 раза.
    Примечание: Длительной фиксации может уменьшить ППП и GFP сигналов.
  4. Проинкубируйте яйцо камер с PBST для 1-2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C с нежным вращения для разрушения яйцо камеры.
    Примечание: PBST можно также избежать камеры яйцо придерживаться покрытые пластиковые поверхности-BSA.
  5. Удалите PBST, дозирование, а затем применить 0,5 мл 10 мкг/мл синий ядерных Хойста в PBST яйцо камер для 1-2 ч при комнатной температуре пятно для ядра.
    NOTE1: Избегайте длительного инкубации с ядерной красителя, как это увеличит неспецифичный сигнал.
    NOTE2: Альтернативный подход к пятно ядро без Hoechst необходимо добавить 200 мкл анти отбеливание установки агента с DAPI (см. материалы) и инкубировать ночь63, перед установкой ткани на стекла Крышка выскальзования, как описано в протоколе 3.8.
    NOTE3: выполняют окрашивание и следующие процедуры в темноте, чтобы избежать Фотообесцвечивание.
  6. Удаление ядерного красителя, закупорить, а затем применить 0,5 мл PBST мыть яйца камер в 1 мл пробирок для 3 раза, с 10 до 20 минут инкубации с нежным ротации между каждым шагом стиральная.
  7. Удалите все PBST с тонкой пипеткой, а затем применить 200 мкл анти отбеливание монтажа агента (см. материалы) для инкубации яиц камер при комнатной температуре в течение 3 ч, или на ночь при 4 ° C до тех пор, пока яйцо камер опускаться на дно трубки.
    Примечание: тканей, которые полностью поглотили агент монтаж раковины в нижней части трубки.
  8. Смонтировать окрашенные яйца палат путем передачи их с 200 мкл анти отбеливание установки агента на слайде предварительно очищенного стекла для воображения, дозирование, охватывают яйцо камер с 20 x 20 мм предварительно очищенного стекла Крышка выскальзования и уплотнение крышки выскальзования на стеклянное скольжение, поставив Лак на краю крышки выскальзования.
    NOTE1: Предварительно очистите слайд стакан и крышку выскальзования с водой или 70% этанола.
    NOTE2: Примените вазелином между слайд стакан и крышку скольжения, чтобы избежать уничтожения яйцо камер пережимов массой.
  9. Изображения камеры яйцо, используя флуоресценции или конфокального микроскопа, с помощью 20 x, NA 0,8 Цель плана-Апохромат, с возбуждением света длиной волны 405 нм для ядерных пятнать (обнаружения выбросов ~ 461 Нм), 561 Нм для сигнала (ППП (продолжающихся или недавних caspase деятельность) обнаружения выбросов ~ 590 нм) и 488 нм для GFP (в прошлом активность каспазы) сигнала (обнаружения выбросов ~ 518nm).
    Примечание: Смотрите наш опубликованные протоколы микроскопии20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Хотя промежуток времени живой клетки микроскопии является надежным методом для тракта иконографии в культивируемых клеток20, это сложно определить, какие клетки претерпели иконографии в животных, потому что восстановленные клетки появляются морфологически отличаются от нормальных здоровых клеток, которые не пытались смерти клетки. Например клетки HeLa человеческого рака шейки матки отображения морфологических признаков апоптоз1,2,14, такие как сжатие клеток, ядерной конденсации и плазматической мембраны блеббинг в ответ на гибель клеток стимул 1µм staurosporine17 (рис. 1A, 1B рисунок i-ii). После удаления стимул смерть клетки и инкубации в свежих средних, умирающих клеток обратный процесс гибели клеток по иконографии17,18, как указано на морфологических восстановления (рис. 1B iii-iv), После распространения ( v-viрис. 1B ). Также наши предыдущие исследования использовали «реального времени» caspase биодатчики, например ApoAlert (NES-DEVD-рекламы ЯФП-NLS), чтобы продемонстрировать разворота апоптоза после caspase активации18,20. Этот биодатчик локализуется в цитозоле в здоровых клетках (рис. 1 c, 1 D, я). После активации caspase, вызванные клетки смерти стимул 3,7% этанола это биосенсор на основе рекламы ЯФП расщепляется caspases и перемещен в ядро, где он накапливается и результате ядерной флуоресценции своей рекламы ЯФП тега определяет клетки с продолжается активность каспазы (рис. 1 C, 1 D ii-iii). Умирающие клетки также отображать морфологических признаков апоптоз во время этанол индукционные1,14,18,20, как фрагментация трубчатых митохондрий, ядерной конденсация, сжатие клеток и плазматической мембраны блеббинг (рис. 1 d ii-iii). Интересно, что после удаления стимул смерть клетки, те же клетки можно восстановить и восстановить нормальной морфологии (рис. 1 d iv-viii). Примечательно, ядерной флуоресценции ApoAlert (рассеченного биосенсор) ушли в течение 1 часа в восстановленных клеток (рис. 1 d iv-viii), возможно из-за аналогичных процессов, которые удаляют поврежденные компоненты в anastatic клетках18 , например рассеченного каспазы-3, ППА и МКСР, созданные во время апоптоз. Таким образом новая стратегия необходима для отслеживания воскресение в течение длительного времени, особенно в естественных условиях.

Чтобы отслеживать судьбу anastatic клеток, мы разработали млекопитающих CaspaseTracker биосенсор системы, которая постоянно этикетки клетки после будучи расщепляется на активность каспазы палач. Этот биодатчик состоит из caspase чувствительных rtTA (обратный тетрациклин контролируемых transactivator) и на основе Cre-LoxP репортер rtTA активности (рисунок 2A-B). В здоровых клетках при отсутствии активности каспазы, transactivator rtTA65 привязаны к плазматической мембране якорь (Lyn11)66,67, ядро исключения сигнал (РЭШ)68киназы киназы карты (MAPKK), и эстроген рецептор вариант (ERT2)69 через caspase горные линкеры70 (DEVD) происходит от ППА (рисунок 2A, 2B). Как привязанный rtTA нельзя перемещать из цитозоль для ядра, он не может активировать rtTA репортер. Однако после активации в ответ на стимул смерть клетки, caspases прилепится линкеры DEVD, освобождая rtTA перемещают в ядро (рис. 2B). Однажды в ядре, rtTA связывает тет ответ элемента (TRE) и переходных выражение рекомбиназа Cre, который приводит к необратимым рекомбинации событие, которое удаляет кассету кодон остановки между CAG промоутер и кодирования последовательностей для триггеров красный флуоресцирующий белок (DsRed). Это приводит к постоянным выражением DsRed (рис. 2B), который служит постоянный маркер флуоресцентные тех клеток, которые могут остаться в живых после того, как они пережили активность каспазы, а также их потомков (рис. 2 c).

Для тестирования млекопитающих биосенсор CaspaseTracker, мы ввели его в клетки HeLa, переходных трансфекции, лечение клетки с стимул смерть клетки (1µм staurosporine) и контролируется покадровой живой клетки confocal микроскопии восстановление клеток, как у нас описал20. Доксициклин (1µg/мл конечная концентрация), которая необходима для разрешения rtTA деятельность65,71, был добавлен в средних культуры клеток и включите биосенсор на протяжении всего эксперимента. В ответ на раздражитель смерти клетки обработанные клетки отображения клейма апоптоза, включая сжатие клеток и блеббинг плазматической мембраны, как предполагаемое (Рисунок 2D i-iii). После удаления стимул смерть клетки, ополаскивание клетки слоя один раз и добавление свежей питательной среды, иконографии можно наблюдать в смерти клетки, как указано на их возвращение к нормальной морфологии (2D рис iv-vii). Диагностически только восстановить клетки Экспресс DsRed флуоресцентные маркер во время и после Воскресение Христово (2D рис iv-vii), отличающей их от как клетки не восстановлены (Рисунок 2D iv-vii), так и клетки управления не подвержены стимул смерть клетки (Рисунок 2E). Это демонстрирует приложения и полезность млекопитающих CaspaseTracker как Роман новый инструмент для выявления и постоянно маркировки anastatic клетки, восстанавливающихся caspase активации и предоставляет способ для отслеживания и изучения их долгосрочной судьбы.

Для обнаружения и отслеживания иконографии в живых животных, требуются CaspaseTracker биосенсор трансгенных животных. Таким образом, мы впервые использовали Drosophila melanogaster как модель системы19, потому что как это важный генетически шансов справиться с возникающими организм для изучения развития животных и человека заболеваний72,73,74 ,-75. Как изменение от млекопитающих биосенсор CaspaseTracker, двойной биосенсор дрозофилы можно определить и отличать «последние/продолжается» от «мимо» активность каспазы. Этот двойной биосенсор состоит из caspase чувствительных Gal419и Gal4 репортер G-Trace53 (рис. 3A). В клетках при отсутствии активности каспазы, дрожжи транскрипционный фактор Gal4 привязал к домену плазматической мембраны якорь (mCD8) через caspase горные компоновщик (DQVD), производные от DIAP1 (рис. 3B), имея мутации 21NN/GV22 для предотвращения деградации от Gal4 N-конец правилом при caspase расщепления компоновщик afterAsp2076, и мутация D135R отменить функцию тормозящее caspase drICE в домен BIR177. Как привязанный Gal4 нельзя перемещать ядро без расщепления caspase выпустить его, Gal4 репортер G-след остается неактивным в ячейки, имеющие не активность каспазы19. Однако, после активации caspase, активированные caspases прилепится DQVD компоновщик, освобождая Gal4 перемещают в ядро для того чтобы активировать G-Trace репортер (Рисунок 3А)19. Gal4 связывается с конкретным вверх по течению активации последовательности (УАС) приведет к временной транскрипции и выражение запроса предложений, которые затем служит флуоресцентные репортер недавних или текущих caspase деятельности до Gal4 (caspase) деятельность прекращается, а затем ППП белок деградации. Gal4 также вызывает выражение ФЛП рекомбиназа от трансген, ведущих к рекомбинации событие, которое удаляет кассету кодон остановки между убиквитин (Ubi) промоутер и последовательности кодирования для ориентированных на ядро GFP (nucGFP). Это приводит к постоянным выражением nucGFP, который служит постоянный маркер тех клеток, которые испытали активность каспазы и остаться в живых.

Для тестирования Drosophila CaspaseTracker биосенсора для обнаружения апоптоза и иконографии в естественных условиях, CaspaseTracker, самка летит были подвергнуты физиологического стресса (рис. 3 c), такие, как холодный шок19, которая может эффективно триггер смерть клетки, включая апоптоза, как указано на активацию caspase, ядерной конденсации и ячейки усадка19,78, а также некроз вследствие охлаждения, что вызывает потери целостности мембраны и утечки цитоплазмы содержимое55,56. Как и ожидалось, CaspaseTracker не был активирован в яйце палаты управления мух где стрессом клеток смерть не была индуцированная (рис. 3D). В противоположность этому яйцо палаты подчеркнул летит один день после холодного шока показал не только сжатие Характеристика apoptotic клеток и ядерных конденсации, но также ППП и GFP выражение, указывающих на наличие недавних или текущих (ЗП +) и прошлого (GFP +) caspase активность (Рисунок 3E). Однако на 3 дня после возвращения подчеркнул мух в нормальное состояние, не подчеркивая, GFP, но не ППП, выражение был обнаружен в восстановленных яйцо камер (Рисунок 3F). Это означает, что яйцо камер, которые выразили активность каспазы после стресса смогли преодолеть процесс гибели клеток и выжить.

Для дальнейшего тестирования обратимость процесса смерти клетки в яйцо камер19, CaspaseTracker женщин мухи были подчеркнули белка голода после кормят 8% сахарозы в агар 1% в течение 3 дней. Предыдущие исследования показали, что белок голода может вызвать caspase опосредованной апоптоз и autophagy в тканях с соматической и клетки семенозачатка, включая яйцо камер57,,6061. Как и ожидалось, CaspaseTracker был активирован в камерах яйцо после 3 дней голодания белка (Рисунок 3 g). Умирающий камер яйцо выставлены apoptotic морфологии и выражение ППП и GFP биосенсор маркеров, указывающее недавних или текущих (ЗП +) и мимо (GFP +) активность каспазы (Рисунок 3 g). Чтобы продемонстрировать, что CaspaseTracker можно отслеживать восстановленные клетки, которые ранее испытывали активацию caspase после смерти стимул, голодали мух затем были переведены в нормальную пищу белковые летать. Как и ожидалось, восстановленные яйцо палаты повторную отправку этих мух не хватает ППП переходных caspase репортер, указывающее нет недавних или текущих caspase активности (рис. 3 H). Однако яйцо камеры в этих мух после снятия стресса, возвращая их к нормальной пищи GFP caspase репортер (рис. 3 H), указывая, что клетки в этих камерах яйцо пересмотрел процесс смерти начатый клеток в точке после активацию caspase. Проверка, что активность биосенсор CaspaseTracker инициируется caspase был получен путем замены расщепления последовательности DQVD последовательность DQVA, который caspase не способна расщеплять и который упразднить биосенсор активности (рис. 3Б, 3I ).

После CaspaseTracker дрозофила оправился от голода белка, мы обнаружили, что несколько типов клеток в яйцо камер, таких как соматические (фолликула) клетки и микрофлорой клетки (клетки медсестра и яйцеклеток), отображаются только GFP, но не ППП (Рисунок 3J )19, указав, что эти клетки можно пройти иконографии после активацию caspase. Интересно, что GFP также помечены клетки в germarium (Рисунок 3J)19, которая содержит стволовые клетки, а также его ассоциированных яйцо камер в одной и той же цепочки ovariole. Таким образом эти камеры яйцо GFP-положительных может были заимствованы из стволовых клеток, которые оправились от процесса смерти клетки после активацию caspase. Важно отметить, что от голода и повторную отправку самка летит лежал оплодотворенные яйца, которые могут производить GFP-выражая потомства мух19, предполагая, что потенциально клетки вспять процесс гибели клеток после активацию caspase можно восстановить видимо нормальной функции. Будущие исследования необходимы для определения, если потомства мух, которые выживают вследствие иконографии выставку постоянным осложнениям.

Figure 1
Рисунок 1 . Восстановление НеЬа клетки после смерти клетки индукции.
(A) принципиальная схема подхода к вызывают гибель клеток и впоследствии позволяют умирающих клеток для восстановления после удаления клеток смерть индуктором.
(B) микроскопия DIC покадровой живой клетки здоровых клеток HeLa, (я), той же группы клеток после лечения с 1µм staurosporine (ii) и затем промывают и далее инкубировали с свежей питательной среды для удаления staurosporine ( iii-vi). Белая стрелка указывает делящейся клетки.
(C) принципиальная схема caspase биосенсор синтез белка NES-DEVD-рекламы ЯФП-NLS и внутриклеточных локализации рекламы ЯФП во время индукции смерти клетки и после иконографии.
(D) промежуток времени живой клетки confocal микроскопии одной клетки HeLa, выражая caspase биосенсор синтез белка NES-DEVD-рекламы ЯФП-NLS до (я), во время выдержки до 3,7% этанола (ii - iii) и после Удаление этанола из питательной среды (iv - viii). Показанный здесь образы caspase биосенсора только (зеленая Флуоресценция, верхний ряд); слияние изображений Хехст окрашенных ядра (голубой флуоресценцией) и митохондрии (красной флуоресценцией) (посередине), и изображения в среднем ряду дальнейших объединилась с DIC изображения (Нижняя строка). Белые стрелки в верхней строке указывают ядерной рекламы локализованных ЯФП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Млекопитающих система биосенсор CaspaseTracker.
(A) принципиальная схема caspase чувствительных rtTA.
(B) принципиальная схема системы млекопитающих CaspaseTracker rtTA биодатчик.
(C) блок-схема с использованием системы биосенсор rtTA CaspaseTracker для обнаружения иконографии. Красный/желтый треугольник (применить индуктором смерть клетки) и зеленый/синий (мыть индуктором выкл) символы, как показано на рисунке 1A.
(D) промежуток времени живой клетки confocal микроскопии кластера клеток HeLa, выражая млекопитающих биосенсор rtTA CaspaseTracker до (я) и во время экспозиции 1µм staurosporine (ii - iii) и после удаления staurosporine от питательной среды (iv - vii). Объединенного изображения DIC и DsRed сигналов. Стрелки показывают ячейки 1 (желтый) и клетки 2 (зеленый).
(E) промежуток времени живой клетки confocal микроскопии необработанных клеток HeLa биосенсор выражая. Объединенного изображения DIC и DsRed сигналов. Белые стрелки указывают деления клеток.
Доксициклин (1ug/мл) был в среде на протяжении эксперименты, показан в панели (D) и (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Дрозофилы CaspaseTracker двойной биосенсор системы. (Принят с разрешения от Тан et al., научная доклады 2015 года, 9:9015 19 ).
(A) принципиальная схема системы биосенсор Drosophila CaspaseTracker Gal4.
(B) схема caspase чувствительных (DQVD) и caspase нечувствительным контроля (DQVA) Gal4.
(C) схема дрозофилы яичник, и схема для клеток смерть индукция в 1-дневных мух, следуют 3-х дней восстановления в нормальное состояние. Дрозофилы изображения, предоставляемые Darren Obbard.
(D) представитель конфокальное изображение палат яйцеклетки из яичника женщины биосенсор мухи кормили нормально летать пищей для 6 дней (лечить).
(E) представитель конфокальное изображение яйцо палат из яичника холодной потрясен женского биосенсор мухи на-7 ° C в течение 1 ч и затем переключился на условие нормальной культуры за 1 день (холодный шок, CS).
(F) как группа E за исключением холодного потрясен мух были перешли условие нормальной культуры в течение 3 дней (восстановленные после CS).
(G) представитель конфокальный изображение яйца, камеры из яичника Голодная женщина биосенсор летают кормили с 8% сахарозы в 1% агар без белка для 3 дней (морили).
(H) как группа G за исключением обработанных мух были переключается нормально летать пищу для 3 дней после лечения голода белка (повторно ФРС).
(I), как группа G за исключением показаны голод caspase вчувствительных CaspaseTracker (DQVA) женский биосенсор мух, которые служили отрицательного контроля.
(J) представитель конфокальное изображение яйцо камер от голода и повторную отправку женщин дрозофилы. Стрелки указывают ядерных GFP, выражая в медсестра клетки (черный), ооцитов (белый) и клеток фолликула (желтый) яйцо камер и в germarium (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Физиологические, патологических и терапевтические последствия иконографии. (Принят с разрешения от Тан et al., F1000Res 2017 года, 6:43 21 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Система двойной биосенсор CaspaseTracker Роман и уникальный инструмент, который позволяет обнаруживать последние или текущих caspase активности и отслеживания клеток, которые обратили вспять смерти клетки процесс и выжить после испытывают caspase активность в естественных условиях. В то время как активность каспазы традиционно считалось как отличительной чертой апоптоза, растущей исследования показывают, что активность каспазы-apoptotic играет потенциальной роли в различных нормальной клеточной функции, такие как регулирование активности нейронов79, 80, обучения и памяти81,82,,8384, подавление necroptotic клеток смерть85,86, сперматид индивидуализации87, 88,89, клеток распространения90и ячейки судьба кучность91микроРНК. В дополнение к apoptosis и иконографии система биосенсор CaspaseTracker поэтому может обнаружить-apoptotic caspase активности, которая присутствует в мозга и зрительного лопастями, кардии, кишечнике, Malpighian трубочки, трахеи, мышцы и других тканей Дрозофила19,46,64. Этот биодатчик сигнал также может представлять текущих или прошлых anastatic деятельность во время развития эмбриона или нормальный гомеостаз в этих тканях. Для изучения иконографии после переходных клеток вызывая смерть-экологического стресса в живых животных, важно выбрать тканей с клетками, которые проявляют активность биосенсор не caspase нормальных физиологических условиях, но это может быть наведено пройти каспазы Активация индукции смерти переходных клеток. Яйцо камеры идеально подходят для этой цели, потому что они, как правило, имеют активность каспазы germarium этап 10 во время женских58,,5992.

Подвергая женщин дрозофилы переходных экологическим стрессам, как белка голода и холодный шок, может эффективно инициировать активацию caspase и гибели клеток в яйцо камер19,,5758, 78. Важнейшие шаги в рамках Протокола включают, избегая длительных клеток смерть индукции мух. Оптимизированные условия белка голода (8% сахарозы в агар 1% для 3-х дней) и холодный шок (1 час на-7 oC) для женского мух могут инициировать процесс смерти caspase активации клеток в камерах яйцо и дать им возможность восстановить после того, как подчеркнул мух возвращаются в нормальное состояние19. Длительное лечение с стимул смерть клетки может вызвать больше камер яйцо пройти процесс гибели клеток, но скорость восстановления также уменьшается, предположительно потому, что умирает яйцо камер опыт огромный ущерб не подлежит ремонту.

Дополнительный критический шаг в этот протокол является уменьшение фонового сигнала CaspaseTracker в камерах яйцо путем пересечения, повышение и поддержание CaspaseTracker летит при более низкой температуре, например 18 oC. Хотя большинство камер яйцо от оптимально воспитал мух не отображать активность каспазы в germarium через этап 10 во время женских58, около 1% яйцо камер может проявлять caspase биосенсор деятельность без ячейки смерти индукции19 . Это может отражать нормальной текучести кадров из-за врожденной ошибок или может быть вызвано непреднамеренно при женских стандартных лабораторных условиях. Как Gal4 отображает меньшую активность в мух на низкой температуре93, поднимая мух на 18 oC, а не при комнатной температуре, может уменьшить эндогенного сигнал, который активирует систему CaspaseTracker. Кроме того переключение мух до более высокой температуры, например 29 oC, может увеличить чувствительность системы CaspaseTracker, из-за увеличение активности Gal493и потенциально другие эндогенной ферментативной температур зависимая деятельность.

Важно различать CaspaseTracker положительных клеток, которые проходят процесс смерти клетки или воскресение из клеток, которые проявляют активность каспазы-apoptotic. Apoptotic клетки Экспресс ППП (временный маркер для продолжаются или недавно caspase деятельности) и часто GFP (постоянный чайник на прошлое активности каспазы) в лечении индукции апоптоза, как они умирать клетки имеют текущие caspase деятельности что расщеплять активированный Gal4, который затем активирует переходные (Gal4 зависящих от деятельности ППП) и постоянного (Gal4 вызвало FLPase-FRT опосредованной GFP) репортеры G-трассировки системы. Апоптоз этих клеток могут быть подтверждены, что морфологические и биохимические клейма такие США ядерной конденсации, обнаруженных путем пятнать с ядерными красители14,19,58и расщепление caspase, обнаруженных 19,иммуноокрашивания94. Клетки, которые уже прошли иконографии отображения постоянных экспрессия гена GFP вследствие событий FLPase опосредованной рекомбинации G-трассировки системы. Эти клетки Экспресс не ППП, как у них нет активности каспазы продолжается, ни другими отличительными чертами апоптоз19. Эти клетки также отображать нормальные Ядерное словотолкование. Клетки имеют продолжается apoptotic caspase деятельность часто отображения ППП и GFP выражение, а также имеют нормальное Ядерное словотолкование19.

Это может быть трудно отличить клетки, которые испытали иконографии от тех клеток, которые последние активность каспазы-apoptotic, потому что оба отображаются только GFP и не отличительной чертой клеточной смерти. Таким образом тщательного управления эксперименты должны быть включены19. Для примеров для изучения иконографии в камерах яйцо, важно изучить экспрессия гена GFP в подчеркнул восстановленные мух и мух подчеркнул (отрицательный контроль). Восстановленные мух должен показать больше GFP-выражая клеток, чем безударные мух, если воскресение произошло после активацию caspase. Также важно различать CaspaseTracker флуоресцентные сигналы от неспецифических auto флуоресценции, как отмечалось в кутикулу, пигментов и жир органы19. Отрицательный контроль биосенсор мух мы порожденных мутирует на сайте расщепления caspase биосенсора (DQVD) для не горные последовательности (DQVA) и тем самым рендеринга биосенсор управления не отвечающих активность каспазы19. Сигнал обнаружен в чувствительных caspase (DQVD) но не в мух биосенсор отрицательного контроля (DQVA) сигнал интерес, вызванных активности каспазы, вместо того чтобы авто флуоресценции.

Наши текущие дрозофилы биосенсор двойной CaspaseTracker можно определить клетки с «недавние» активность каспазы выражением запроса предложений и клетки с «прошлое» активность каспазы по экспрессии гена GFP19. Мы отмечаем, что запрос не является индикатор активности каспазы «реального времени», потому что она занимает несколько часов времени реакции на Gal4 ехать выражение ППП в ответ на активность каспазы. Чтобы добавить функцию «реального времени», дрозофила CaspaseTracker биосенсор могут быть объединены с биосенсор недавно разработанных iCasper52, в «реальном времени» и «темные до ярких» в vivo биосенсор, который показывает только его far-red сигнал, когда это расщепляется caspases.

Отдельно от апоптоза, CaspaseTracker потенциально может также быть активированы во время альтернативных видов клеточной смерти клетки можно переключать pathways смерти клетки во время их курс, который прямо или косвенно предполагает активацию caspase, например autophagy после голод95,96, некроз, холодный шок индуцированной плазматической мембраны разрыв19,55,56,78и staurosporine индуцированной necroptosis97, 98. Нашего нынешнего и предыдущих исследований показали, что CaspaseTracker Биодатчики можно пометить клетки, оправился от этих клеток смерть индукции в vitro или в естественных условиях17,18,19 , 20 , 21. как эти клетки смерти индукции только одновременно может активировать несколько путей смерти клеток в тех же камерах, восстановление этих умирающих клеток предполагает, что Воскресение Христово является общей ячейки восстановления явление, которое может изменить различные клеточной смерти процессы, включая апоптоза, autophagy, некроз и necroptosis, одновременно или по отдельности.

Биосенсор CaspaseTracker в естественных условиях будет способствовать достижению еще неизвестных функций, механизмов и терапевтические последствия иконографии ()Рисунок 4)21. Чтобы выявить молекулярные подпись иконографии, мы провели время курс всего генома ген выражение microarray исследования для анализа первичных клеток печени мыши во время отмены этанола индуцированного апоптоза и интересно, что нашел разительные изменения в транскрипция генов, участвующих в нескольких путей, включая про выживание, антиокислительные, ответ повреждения ДНК, изменения гистона, ангиогенез, клетки миграции и трансформации18,21. Этот вывод поддерживается нашей проверки изучение восстановления клеток рака печени человека HepG2 от апоптоза18,21, а также недавнее независимое исследование РНК последовательности клеток HeLa в восстановлении апоптоз99. Интересно, что вверх регулирование некоторых факторов про выживание, обнаруженные в anastatic клетках наблюдаются также в сердечной недостаточности разворота и прогрессии опухоли, рак повторения100,,101102, предлагая потенциал участия иконографии. Для изучения физиологических, патологических и терапевтические возможности иконографии, важно для выявления anastatic клеток и отслеживать их судьбы в мелких животных, как это позволит механистическим и терапевтические исследования. Наши дрозофилы и млекопитающих CaspaseTracker биосенсорах будут полезными инструментами для тестирования потенциальный вклад иконографии в нормального развития, гомеостаза, восстановления тканей, опухоли эволюции, рецидивирования рака и метастазов. Вывод из этих исследований будет увеличить наше понимание естественной роли иконографии и открывают возможности для выявления революционный Новые терапевтические подходы для сложных заболеваний путем посредничества гибель клеток и выживание путем контроля иконографии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Darren Obbard для дрозофилы изображения в рисунок отождествлены и видео рукописи; J. Мари Hardwick, Уэйд Гибсон и Хизер м. Lamb ценные обсуждения этой рукописи. Эта работа была поддержана, сэр Эдвард Youde Мемориал стипендий (H.L.T.), д-р Вальтер Szeto Мемориальная стипендия (H.L.T.), Фулбрайт Грант 007-2009 (H.L.T.), наука о жизни исследовательский фонд стипендий (H.L.T.) и NCI K22 Грант CA204458 (H.L.T.). Хо Лам Тан был Shurl и Кей Курчи фонд парень жизни наук исследовательский фонд (2014-2017 годы).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics