Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Medicine

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Summary

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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Abstract

Anastasis (dal greco "risurrezione alla vita") è un fenomeno di recupero cellulare recentemente scoperto per cui morire cellule può invertire i processi di morte delle cellule della fase tardiva che sono presupposti generalmente per essere intrinsecamente irreversibili. Promozione anastasis potrebbe in principio salvataggio o preservare ferito le cellule che sono difficili da sostituire come cardiomiociti o neuroni, facilitando così il recupero dei tessuti. Al contrario, sopprimendo anastasis in cellule tumorali, che subiscono gli apoptosi dopo terapie anti-cancro, può garantire la morte della cellula tumorale e ridurre le probabilità di recidiva. Tuttavia, questi studi sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti per il monitoraggio il destino delle cellule che subiscono anastasis in animali vivi. La sfida consiste nell'identificare le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare nonostante il loro aspetto morfologicamente normale dopo il recupero. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato in Drosophila e sistemi di biosensore CaspaseTracker mammiferi che possono identificare e tracciare definitivamente anastatica cellule in vitro o in vivo. Qui, presentiamo in vivo protocolli per la generazione e l'utilizzo del sistema dual biosensore CaspaseTracker per rilevare e tenere traccia di anastasis in Drosophila melanogaster dopo esposizione transitoria agli stimoli di morte delle cellule. Mentre convenzionale biosensori e protocolli possono marcare le cellule attivamente che subisce la morte apoptotica delle cellule, il biosensore CaspaseTracker permanentemente può marcare le cellule che hanno recuperato dopo l'attivazione di caspase - un marchio di garanzia dell'apoptosi in fase avanzata, e contemporaneamente identificare processi apoptotici attivo. Questo biosensore può anche monitorare il recupero delle cellule che hanno tentato di altre forme di morte delle cellule che direttamente o indirettamente interessate attività di caspase. Di conseguenza, questo protocollo permette di monitorare continuamente il destino di queste cellule e la loro progenie, facilitando gli studi futuri delle funzioni biologiche, meccanismi molecolari, le conseguenze fisiologiche e patologiche e implicazioni terapeutiche di Anastasis. Inoltre discutiamo i controlli appropriati per distinguere le cellule che subiscono anastasis da quelle che visualizzano non apoptotiche caspase attività in vivo.

Introduction

Morte programmata delle cellule, come apoptosi, svolge un ruolo essenziale nello sviluppo embrionale e normale omeostasi eliminando le cellule indesiderate, ferite o pericolose in organismi multicellulari1,2,3. La perdita di equilibrio tra sopravvivenza e morte cellulare può portare a conseguenze fatali come cancro, insufficienza cardiaca, dell'autoimmunità e degenerazione4,5,6,7,8. Attivazione del boia caspases tradizionalmente è stato considerato come il "punto di non ritorno" in apoptosi9,10,11, come si innesca rapida e massiccia demolizione cellulare12, 13,14,15,16. Impegnativo questo dogma generale, abbiamo dimostrato che cellule primarie morente coltivate e le cellule tumorali possono recuperare non solo dopo l'attivazione delle caspasi, ma anche seguente cellula importante tra cui membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, tratti distintivi di morte frammentazione mitocondriale, rilascio di mitocondriale del citocromo c nel cytosol, nucleare e condensazione della cromatina, danno del DNA, frammentazione nucleare, l'esposizione di superficie delle cellule della fosfatidilserina (PS) e la formazione di corpi apoptotici 17 , 18 , 19 , 20 , 21. vi proponiamo quella anastasis è un fenomeno di recupero intrinseco delle cellule, come le cellule morte possono recuperare dopo la rimozione delle cellule morte stimoli17,18,19,20, 21. abbiamo coniato il termine "Anastasis" (Αναστάσης)18, che significa "rising alla vita" in greco, a descrivere questo fenomeno di recupero cellulare inaspettato. La nostra osservazione di anastasis è ulteriormente supportata da recenti studi indipendenti che rivelano anche il recupero delle cellule dopo la fosfatidilserina esternalizzazione22,23,24, limitata mitocondriale esterna di permeabilizzazione della membrana25, attivazione di stirpe misto chinasi-come (MLKL) e cella restringimento26.

Caratterizzare i meccanismi che regolano l'anastasis avrà implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche lo spostamento di paradigma. Anastasis potrebbe rappresentare un meccanismo di cytoprotective precedentemente sconosciuti per salvare o preservare importanti cellule postmitotic e tessuti che sono difficili da sostituire e possibilmente conto per l'inversione di insufficienza cardiaca ventricolare scaricando con ventricolare di sinistra assistere dispositivi (LVADs)27,28, recupero di cellule fotorecettrici dopo esposizione transitoria di luce eccessiva29,30,31, o la riparazione dei neuroni dopo la ferita di cervello32. Se è così promuovere anastasis potrebbe migliorare il recupero di cellule e tessuti. Al contrario, anastasis potrebbe essere una tattica di fuga inaspettata usata dalle cellule tumorali per sopravvivere terapia d'induzione di morte delle cellule, causando cancro ricorrenza17,18. Di conseguenza, sopprimendo anastasis morendo, le cellule tumorali durante e dopo il trattamento del cancro potrebbe essere una strategia terapeutica novella per curare tumori impedendo loro ricaduta.

Durante il processo di anastasis, abbiamo trovato che alcune cellule recuperate acquisito alterazioni genetiche permanente e ha subito la trasformazione oncogena, probabilmente a causa di danni al DNA sostenute durante l'apoptosi18,20,21 . Invertire il processo di morte delle cellule con DNA danneggiato potrebbe essere un meccanismo della tumorigenesi, potenzialmente sottostante l'osservazione che ripete la lesione del tessuto aumenta il rischio di cancro in una varietà di tessuti, come lesione cronica termica nell'esofago indotto tramite il consumo di bevande molto calde33,34,35, danni al fegato a causa di alcolismo36,37, evoluzione del tumore dopo genotossici cancro terapia38, 39,40e lo sviluppo di nuovi cancri dai tessuti normali che si verificano durante gli intervalli tra i cicli di terapia anti-cancro41,42,43,44 . Se true, targeting anastasis potrebbe prevenire o arrestare e progressione del tumore. Abbiamo trovato che indotta da inedia morente le cellule di germe subiscono anastasis in ri-nutriti Drosophila19.  In caso di anastasis in cellule di germe con danno del DNA, potrebbe essere conto per l'osservazione che il prolungato stress ambientale promuove lo sviluppo di malattie genetiche. Ad esempio, carestie e contribuire allo sviluppo di transgenerazionale ereditabili malattie come il diabete e malattie cardiache coronariche45. Di conseguenza, anastasis comprensione potrebbe portare a strategie per la prevenzione di malattie ereditarie causate da questo meccanismo potenziale di sviluppo.

Per sfruttare la scoperta dell'anastasis e dirigerla per sviluppare terapie innovative, è essenziale per studiare la causa e conseguenza di anastasis in animali vivi. Tuttavia, è tecnicamente difficile da identificare e tracciare anastatica cellule in vivo, perché le cellule che ha recuperato dal processo di morte cellulare appaiono morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali, e non c'è nessun biomarcatore dell'anastasis identificato ancora17,18,21. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un nuova in vivo caspase biosensore indicato "CaspaseTracker"19, per identificare e tenere traccia di cellule che sopravvivono apoptosi dopo19,l'attivazione di caspase46, il segno distintivo di apoptosi10,14. Distinguendola dai biosensori di caspasi "tempo reale" come SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 che rileva l'attività della caspasi in corso, il biosensore CaspaseTracker inoltre offre la possibilità per marcare permanentemente le cellule che attività di caspase espressa anche transitoriamente. Pertanto, il biosensore CaspaseTracker consente la registrazione a lungo termine dell'anastasis dopo inversione di caspase-mediata delle cellule morte processo in vivo.

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Protocol

1) preparazione del biosensore CaspaseTracker mosche

  1. Anestetizzare mosche con CO2e utilizzare un pennello per trasferire 7 a 10 caspase-sensibile Gal4 (DQVD)19 femmine vergini e 7 a 10 G-traccia53 Gal4 reporter giovane maschi mosche (o viceversa) nella stessa fiala con alimento e pasta di lievito fresco.
    Nota: Croce di mosche Gal4 Caspase-sensibili (DQVD) e G-traccia produrrà CaspaseTracker mosche di progenie. Croce dellaCaspase - sensibili (DQVA)19 Gal4e mosche G-traccia fornirà controllo negativo Vola (vedi discussione). Pasta di lievito fresco serve come fonte di proteine per migliorare la produzione di uova, così che aumenta il numero di discendenti. Selezionare le femmine vergini e giovane maschio vola secondo loro fenotipi54.
  2. Incubare le mosche a 18 gradi Celsius (oC) durante la croce per 3-7 giorni e quindi trasferire le mosche per un nuovo flacone per impostare una nuova croce a 18 ° C. Continuare a incubare il flaconcino originale a 18 ° C fino a progenie Vola eclose.
    Nota: Trasferire le mosche del padre a new Fiale per evitare sovraffollamento della progenie al flacone originale. Mosche di genitore in grado di produrre progenie con cibo fresco e pasta di lievito i primi 2-3 interruttori, e quindi la produttività significativamente diminuirà con il tempo. Alzando le mosche 18 ° C può ridurre il segnale aspecifiche di biosensore CaspaseTracker (vedi discussione).
  3. Selezionare progenie Vola con fenotipi corretta54 per i seguenti esperimenti.
    Nota: I transgeni di Gal4 caspase-sensibile e G-traccia qui si trova il secondo cromosoma, equilibrato con bilanciatore CyO. Selezionare la progenie di ala non-ricci (senza CyO), che ha entrambi transgeni di caspase-sensibili Gal4 e G-traccia.

2) applicazione di induzione di morte transitoria delle cellule CaspaseTracker biosensore mosche

  1. Trasferire 10 a 20 appena obtecta donna Vola in un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco per 1 giorno a 18 ° C per consentire la produzione di uova camera da oogenesi.
    Nota: Mantenendo la femmina con mosche maschi potrebbe migliorare la produzione di uova da camera.
  2. Per indurre l'uovo di Colombo all'apoptosi da colpo di freddo, trasferimento la femmina Vola al nuovo flacone vuoto, che viene poi collocato a-7 ° C per 1 h.
    Nota: Cold shock danneggia le cellule inducendo la rottura della membrana plasmatica55,56.
  3. Per indurre l'uovo chambers all'apoptosi da inedia di proteina, trasferire le mosche femminile ad un nuovo flacone con cibo di agar di saccarosio e 1% 8% a 18 ° C per 3 giorni.
    Nota: Fame di proteine (senza proteine alimentari) può innescare uovo di Colombo per subire apoptosi57,58,59 e autofagia60,61. Interruttore Vola in un nuovo flacone con 8% di saccarosio e 1% di cibo agar ogni giorno per mantenere condizioni ottimali del saccarosio volare.
  4. Trasferire le mosche stressate per 3 giorni a 18 ° C per consentire loro di recuperare un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco. Sezionare la fame e le mosche affamato-recuperati per ottenere l'uovo di Colombo alle ovaie come descritto62.
    Nota: Per sezionare Drosophila per ottenere le ovaie, anestetizzare mosche con CO2e utilizzare 2 paia di pinze per rimuovere la testa di Mosca e utilizzare le pinze per estrarre la base dell'addome per rimuovere le ovaie delle mosche.

3) fissazione e colorazione di Uovo sezionato alloggiamenti per l'Imaging

  1. Trasferire gli alloggiamenti di Uovo sezionato insieme con intorno salino di 0,5 mL tamponato fosfato (PBS) per provette da centrifuga 1 mL. Lasciare le uova a stabilirsi.
    Nota: Ricoprire le punte di pipetta di plastica con 1% albumina di siero bovino (BSA) dissolto in acqua o in PBS per impedire gli alloggiamenti di uovo a bastone sulla superficie di plastica delle punte. Eseguire le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching di proteina fluorescente rossa (RFP, noto anche come DsRed) e la proteina fluorescente verde (GFP) nelle camere di uovo.
  2. Rimuovere il PBS pipettando e quindi applicare paraformaldeide 4% 0,5 mL in PBS per fissare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente al buio per 20-30 min.
    Nota: Applicare la rotazione delicata in questa e le seguenti fasi di incubazione.
  3. Rimuovere il paraformaldeide pipettando e poi lavato la camera con 0,5 mL PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) per 3 volte.
    Nota: Fissazione prolungata potrebbe ridurre i segnali RFP e GFP.
  4. Incubare le camere di uovo con PBST per 1 o 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C con delicata rotazione per permeabilize gli alloggiamenti di uovo.
    Nota: PBST può anche evitare uovo alloggiamenti per attaccare la superficie di plastica rivestita di non-BSA.
  5. Rimuovere il PBST pipettando e quindi applicare 0,5 mL di 10 μg/mL di colorante Hoechst nucleare in PBST agli alloggiamenti di uovo per 1 o 2 h a temperatura ambiente a macchiare per nucleo.
    Nota 1: Evitare l'incubazione prolungata con colorante nucleare come questo aumenterà il segnale aspecifico.
    Nota2: Approccio alternativo a macchiare il nucleo senza Hoechst consiste nell'aggiungere 200 agente di montaggio anti-candeggio μL con DAPI (Vedi materiali) ed incubare overnight63, prima di montare i tessuti il coprioggetto di vetro come descritto al protocollo 3.8.
    Nota3: eseguire la colorazione e le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching.
  6. Rimuovere il colorante nucleare pipettando e quindi applicare 0,5 mL PBST per lavare gli alloggiamenti di uovo nelle provette da centrifuga 1 mL per 3 volte, con incubazione di 10-20 min con delicata rotazione tra ogni fase di lavaggio.
  7. Rimuovere tutti i PBST con pipetta bene e quindi applicare 200 agente di montaggio anti-candeggio μL (Vedi materiali) per Incubare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente per 3 ore o una notte a 4 ° C fino a quando gli alloggiamenti di uovo affondano sul fondo del tubo.
    Nota: i tessuti che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio affondano sul fondo del tubo.
  8. Montare gli alloggiamenti di uovo tinto trasferendoli con 200 μL anti-sbianca fissaggio agente su una lastra di vetro pre-pulito per l'imaging di pipettaggio, coprire gli alloggiamenti di uovo con un vetrino coprioggetto 20x20 mm vetro pre-pulito e sigillare il coprioggetto sul vetrino mettendo smalto al bordo del vetrino coprioggetti.
    Nota 1: Pre-pulire il vetrino e il coprioggetto con acqua o 70% di etanolo.
    Nota2: Applicare vaselina tra il vetrino e il coprioggetto per evitare di distruggere gli alloggiamenti di uovo di compressione.
  9. Gli alloggiamenti di uovo usando la fluorescenza o microscopio confocale, utilizzando un 20x, NA 0,8 di immagine obiettivo piano-apocromatico, con eccitazione luce lunghezza d'onda 405 nm per la macchiatura nucleare (rilevare emissioni ~ 461 nm), 561 nm per RFP (attività di caspase in corso o recente) segnale ( rilevare l'emissione ~ 590 nm) e 488 nm per segnale di GFP (passato l'attività della caspasi) (rilevare emissioni ~ 518nm).
    Nota: Vedi i nostri protocolli pubblicati per microscopia20,64.

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Representative Results

Mentre la microscopia time-lapse cellula viva è un metodo affidabile per tratto anastasis in cellule coltivate20, è difficile da identificare le celle che sono stati sottoposti a anastasis in animali, perché le cellule recuperate appaiono morfologicamente indistinguibili da cellule sane normali che non hanno tentato la morte delle cellule. Ad esempio, le cellule umane del cancro cervicale HeLa visualizzare caratteristiche morfologiche di apoptosi1,2,14, quali il restringimento delle cellule, condensazione nucleare e membrana plasmatica blebbing in risposta alla morte delle cellule stimolo di 1 µm staurosporine17 (Figura 1A, 1B figura i-ii). Dopo aver rimosso lo stimolo di morte delle cellule e la incubazione in terreno fresco, le cellule morenti invertire il processo di morte cellulare da anastasis17,18, come indicato dal recupero morfologico (Figura 1B iii-iv), seguita da proliferazione (Figura 1B v-vi). Nostri studi precedenti hanno utilizzato anche i biosensori caspasi "tempo reale", ad esempio ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) per dimostrare l'inversione dell'apoptosi dopo l'attivazione di caspase18,20. Questo biosensore si localizza nel citosol in cellule sane (Figura 1, 1 D io). Al momento dell'attivazione di caspasi innescato l'etanolo di 3,7% di cellule morte stimolo, questo biosensore YFP-basato è scisso dalla caspasi e trasloca al nucleo, dove si accumula e la fluorescenza nucleare risultante del suo tag YFP identifica le cellule con in corso attività della caspasi (Figura 1 C, 1 D ii-iii). Le cellule morenti anche visualizzare caratteristiche morfologiche dell'apoptosi durante etanolo-induzione1,14,18,20, come la frammentazione dei mitocondri tubolari, nucleari condensazione, restringimento delle cellule e della membrana plasmatica blebbing (Figura 1 : ii-iii). È interessante notare che, dopo la rimozione dello stimolo delle cellule morte, le stesse cellule possono recuperare e riconquistare la morfologia normale (Figura 1 iv-viii). In particolare, la fluorescenza nucleare di ApoAlert (fenduti biosensore) è andata entro 1 ora nelle cellule recuperate (Figura 1 iv-viii), possibilmente a causa di simili processi che eliminano i componenti danneggiati in anastatica cellule18 , quali caspase-3 fenduto, PARP e ICAD generati durante l'apoptosi. Pertanto, una nuova strategia è necessaria per il rilevamento di anastasis sopra un lungo lasso di tempo, soprattutto in vivo.

Per tenere traccia il destino delle cellule anastatica, abbiamo sviluppato il sistema di biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, che etichette permanentemente le cellule dopo essere spaccati di attività di caspase boia. Questo biosensore è composto di una rtTA caspase-sensibili (inversa transactivator tetraciclina-controllato) e un reporter Cre-LoxP-basato per rtTA attività (Figura 2A-B). Nelle cellule sane senza attività di caspase, il transactivator rtTA65 è legata alla membrana plasmatica anchor (Lyn11)66,67, segnale di esclusione di nucleo (NES) della chinasi della chinasi della mappa (MAPKK)68, e l'estrogeno recettore variante (ERT2)69 attraverso caspase-spaccabili linker di70 (DEVD) derivato da PARP (Figura 2A, 2B). Come rtTA tethered non traslocano dal cytosol al nucleo, essa non può attivare il reporter rtTA. Tuttavia, al momento dell'attivazione in risposta ad uno stimolo di morte delle cellule, caspasi fendono il linker DEVD, liberando la rtTA per traslocano nel nucleo (Figura 2B). Una volta nel nucleo, la rtTA si lega all'elemento di risposta di tet (TRE) e trigger espressione transitoria di Cre ricombinasi, che conduce a un evento di ricombinazione irreversibili che rimuove la cassetta del codone di stop tra il promotore CAG e le sequenze codificanti per proteina fluorescente rossa (DsRed). In questo modo permanente espressione di DsRed (Figura 2B), che serve come il marcatore fluorescente permanente di quelle cellule che può rimanere vivo dopo che essi hanno sperimentato l'attività della caspasi, come pure la loro progenie (Figura 2).

Per testare il biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, abbiamo introdotto in cellule HeLa di trasfezione transiente, trattato le cellule con uno stimolo di morte delle cellule (1 µm staurosporine) e monitorati recupero delle cellule mediante microscopia confocale a time-lapse cellule vive, come abbiamo descritto20. Doxiciclina (concentrazione finale di 1 µ g/mL), che è essenziale per consentire rtTA attività65,71, è stato aggiunto al medium della coltura cellulare per accendere il biosensore in tutto l'esperimento. In risposta allo stimolo di morte delle cellule, le cellule trattate visualizzare tratti distintivi dell'apoptosi, tra cui il restringimento delle cellule e la membrana plasmatica blebbing come previsto (Figura 2D i-iii). Dopo aver rimosso lo stimolo di morte delle cellule, risciacquo la cella strato una volta e terreno di coltura di nuovo aggiunta, anastasis può osservare nelle cellule morenti, come indicato dal loro ritorno a una morfologia normale (Figura 2D iv-vii). Diagnostico, recuperato solo cellule express il DsRed marcatore fluorescente durante e dopo l'anastasis (Figura 2D iv-vii), che li distingue da entrambe le cellule non recuperati (Figura 2D iv-vii) e le cellule di controllo non esposti allo stimolo di morte delle cellule (Figura 2E). Questo dimostra l'utilità del CaspaseTracker dei mammiferi come un romanzo nuovo strumento per l'identificazione e l'etichettatura permanentemente anastatica cellule riprendendo da attivazione di caspase e applicazione e fornisce un modo per monitorare e studiare il loro destino a più lungo termine.

Per rilevare e tenere traccia di anastasis in animali vivi, animali transgenici di biosensore CaspaseTracker sono necessari. Pertanto, abbiamo in primo luogo usato Drosophila melanogaster come un sistema di modello19, perché come è un importante organismo geneticamente trattabile per lo studio di sviluppo degli animali e malattie umane72,73,74 ,75. Modificato da biosensore CaspaseTracker dei mammiferi, il biosensore dual Drosophila può identificare e distinguere "recenti/on-going" dal "passato" attività di caspase. Questo biosensore dual è composto di un caspase-sensibile Gal419e il reporter di Gal4 G-traccia53 (Figura 3A). Nelle cellule con nessuna attività di caspase, il fattore di trascrizione Gal4 di lievito è legato a un dominio di ancoraggio (mCD8) di membrana plasmatica tramite un linker caspase-spaccabili (DQVD) derivato da DIAP1 (Figura 3B), avendo una mutazione di 21NN/GV22 per prevenire il degrado di Gal4 dalla regola N-fine su fenditura di caspase del linker afterAsp2076e una mutazione di D135R ad abolire la funzione inibitoria di caspase ZONESUN il dominio BIR177. Come tethered Gal4 non traslocano nel nucleo senza fenditura di caspase per rilasciarlo, il reporter di Gal4 G-traccia rimane inattivo nelle cellule avendo nessuna attività di caspase19. Al momento dell'attivazione di caspase, tuttavia, caspasi attivate fendono il linker DQVD, liberando Gal4 di traslocano nel nucleo per attivare il G-traccia reporter (Figura 3A)19. Gal4 si lega a specifici a Monte attivazione di sequenze (UAS) per innescare transitoria trascrizione ed espressione di RDP, che serve poi come reporter fluorescente di attività di caspase recenti o attuali fino al Gal4 (caspasi) attività si interrompe e quindi la proteina RFP è degradato. Gal4 innesca anche espressione della ricombinasi FLP dal transgene, portando a un evento di ricombinazione che rimuove la cassetta del codone di stop tra un promotore di ubiquitin (Ubi) e una sequenza di codici per nucleo-mirati GFP (nucGFP). In questo modo permanente espressione di nucGFP, che serve come il marcatore permanente di quelle cellule che hanno sperimentato l'attività di caspase e rimanere vivo.

Per testare il Drosophila CaspaseTracker biosensore per la rilevazione del apoptosis e anastasis in vivo, CaspaseTracker donna Vola sono stati sottoposti a stress fisiologico (Figura 3), come freddo shock19, che può in modo efficiente grilletto la morte delle cellule, tra cui apoptosi, come indicato dall'attivazione delle caspasi, condensazione nucleare e cella restringimento19,78e anche necrosi dovuto agghiacciante che causa perdita di integrità della membrana e perdita di citoplasmatica Indice55,56. Come previsto, CaspaseTracker non è stato attivato nell'uovo alloggiamenti di mosche di controllo dove non era morte legate allo stress cellulare indotto (Figura 3D). Al contrario, gli alloggiamenti di uovo di mosche sollecitati un giorno dopo cold shock hanno mostrato non solo restringimento delle cellule apoptotiche caratteristici e condensazione nucleare, ma anche RFP e GFP espressione, che indica la presenza di recente o in corso (RFP +) e passato (GFP +) caspase attività (Figura 3E). Tuttavia, a 3 giorni dopo il ritorno le mosche stressate a condizione di non-stress normale, GFP, ma nessun RFP, espressione è stata rilevata nelle camere di uovo recuperati (Figura 3F). Ciò indica che le camere a uovo che avevano espresso l'attività della caspasi segue lo sforzo erano in grado di superare il processo di morte cellulare e sopravvivere.

Per testare ulteriormente la reversibilità del processo di morte cellulare in uovo Colombo19, CaspaseTracker mosche femminili sono stati sollecitati da inedia proteina dopo essere alimentato 8% di saccarosio in 1% agar per 3 giorni. Gli studi precedenti hanno dimostrato che fame di proteina può innescare gli apoptosi caspase-mediati e autophagy in tessuti con somatiche e cellule germinali, tra cui uovo Colombo57,60,61. Come previsto, CaspaseTracker è stato attivato negli alloggiamenti di uovo dopo 3 giorni di inedia di proteina (Figura 3). Gli alloggiamenti di uovo morente ha esibito sia apoptotica morfologie ed espressione dei RFP e GFP biosensore marcatori, che indica in corso o recente (RFP +) e passato (GFP +) attività di caspase (Figura 3). Per dimostrare che CaspaseTracker può tenere traccia di cellule recuperate che precedentemente sperimentato l'attivazione delle caspasi dopo uno stimolo di morte, le mosche affamate sono state poi trasferite agli alimenti volare contenenti proteine normali. Come previsto, gli alloggiamenti di uovo recuperati di queste mosche ri-nutriti mancano il reporter di caspase transitoria RFP, che indica nessuna attività di caspase recente o in corso (Figura 3 H). Tuttavia, le camere a uovo di queste mosche dopo alleviare lo stress di restituirli al cibo normale visualizzazione il reporter di caspase GFP (Figura 3 H), che indica che le cellule in questi alloggiamenti di uovo avevano invertito il processo di morte cellulare iniziati in un punto dopo attivazione delle caspasi. Verifica che l'attività di biosensore CaspaseTracker è innescato da caspasi è stata ottenuta sostituendo la sequenza di clivaggio DQVD con la sequenza di DQVA, quali caspase è in grado di fendere e che aboliscono biosensore attività (Figura 3B, 3I ).

Dopo il CaspaseTracker di Drosophila ha recuperato dalla fame di proteina, abbiamo trovato che più tipi di cella nelle camere di uovo, come le cellule somatiche (follicolo) e cellule germinali (cellule di infermiera e ovociti), visualizzato solo GFP, ma non RFP (Figura 3J )19, che indica che queste cellule possono subire anastasis dopo l'attivazione delle caspasi. È interessante notare che, la GFP anche etichettati cellule a germarium (Figura 3J)19, che contiene cellule staminali, insieme a sue sezioni di uovo associato nella stessa catena di ovariole. Di conseguenza, questi alloggiamenti di uovo di GFP-positivi possono essere derivati dalle cellule staminali che hanno recuperato dal processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi. D'importanza, la fame e ri-fed femmina vola deporre le uova fertili che possono produrre che esprimono GFP progenie mosche19, suggerendo che potenzialmente le cellule invertito processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi può riguadagnare la funzione apparentemente normale. Gli studi futuri sono necessari determinare se mosche progenie che sopravvivono in conseguenza di anastasis presentano sequele permanenti.

Figure 1
Figura 1 . Recupero di HeLa cellule dopo induzione di morte cellulare.
(A) diagramma schematico dell'approccio per indurre la morte delle cellule e successivamente consentire morire cellule di recuperare dopo la rimozione di induttore di morte delle cellule.
(B) time-lapse cellule vive DIC microscopia delle cellule HeLa sane (mi), lo stesso gruppo di cellule dopo trattamento con staurosporine 1 µm (ii) e poi lavati e più ulteriormente incubate con terreno di coltura fresco per rimuovere staurosporine ( III-vi). Freccia bianca indica una cellula di divisione.
(C) rappresentazione schematica della proteina di fusione di caspase biosensore NES-DEVD-YFP-NLS e la localizzazione subcellulare di YFP durante l'induzione di morte cellulare e dopo anastasis.
Microscopia confocale di time-lapse cellule vive (D) di una cella di HeLa, che esprimono la proteina di fusione di biosensore NES-DEVD-YFP-NLS caspase prima (ho), durante l'esposizione al 3,7% di etanolo (ii - iii) e dopo rimozione di etanolo da terreno di coltura (iv - viii). Mostrato qui sono immagini del biosensore caspase solo (fluorescenza verde, riga superiore); unire immagini del nucleo Hoechst-macchiato (fluorescenza blu) e mitocondri (fluorescenza rossa) (riga centrale), e immagini nella riga centrale ulteriormente fuse con immagini DIC (riga inferiore). Frecce bianche nella riga superiore indicano nucleare YFP localizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Sistema di biosensore mammifero CaspaseTracker.
(A) schema di rtTA il caspase-sensibili.
(B) schema di sistema mammifero CaspaseTracker rtTA biosensore.
(C) diagramma di flusso di utilizzando il sistema di biosensore rtTA CaspaseTracker per rilevare anastasis. Triangolo rosso/giallo (applicare induttore di morte delle cellule) e i simboli verdi/blu (induttore di lavare fuori) sono come in Figura 1A.
(D) la microscopia confocale time-lapse di cellule vive di un cluster di cellule HeLa esprimendo mammiferi CaspaseTracker rtTA biosensore prima (io) e durante l'esposizione a 1 µm staurosporine (ii - iii) e dopo la rimozione staurosporine da terreno di coltura (iv - vii). Immagini unite dei segnali DIC e DsRed. Le frecce indicano la cella 1 (giallo) e delle cellule 2 (verde).
(E) microscopia confocale time-lapse tensione delle cellule delle cellule HeLa biosensore-esprimendo non trattate. Immagini unite dei segnali DIC e DsRed. Frecce bianche indicano la divisione delle cellule.
Doxiciclina (1ug/mL) era presente nel terreno in tutto gli esperimenti mostrati in pannelli (D) ed (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Drosophila CaspaseTracker sistema dual biosensore. (Adottato con permesso da Tang et al., Scientific Reports 2015, 9:9015 19 ).
(A) schema dell'apparato di biosensore CaspaseTracker Gal4 di Drosophila .
(B) rappresentazione schematica della caspase-sensibili (DQVD) e il controllo indipendente dalle caspasi (DQVA) Gal4.
(C) schema di ovaio di Drosophila e diagramma di flusso per cellule morte-induzione in 1 giorno-vecchio mosche, seguita dal recupero di 3 giorni a condizione normale. Drosophila immagine fornita da Darren Obbard.
Immagine confocale rappresentativa (D) delle camere a uovo dall'ovaio di una Mosca femmina biosensore nutriti con cibo normale volo per 6 giorni (non trattato).
(E) rappresentanza immagine confocale di alloggiamenti di uovo dall'ovaio di una Mosca di biosensore femmina freddo scioccato messi a-7 ° C per 1 h e poi passa alla condizione di cultura normale per 1 giorno (Cold Shock, CS).
(F) come pannello E tranne le mosche scioccate fredde erano passati a condizione di cultura normale per 3 giorni (recuperato dopo CS).
(G) rappresentanza immagine confocale di uovo di Colombo dall'ovaia di un biosensore affamato femmina vola alimentati con 8% di saccarosio in 1% agar senza proteine per 3 giorni (Starved).
(H) come pannello G tranne le mosche trattate erano passati a volo normale cibo per 3 giorni dopo il trattamento di inedia di proteina (re-immessi).
(I) come pannello G tranne che mostra l'inedia di caspase insensibile mosche di biosensore femminile di CaspaseTracker (DQVA), che serviva come controllo negativo.
(J) rappresentanza immagine confocale di alloggiamenti di uovo da una femmina affamato e ri-nutriti della drosofila. Le frecce indicano nucleare GFP esprimendo nelle cellule infermiera (nere), gli ovociti (bianchi) e le cellule del follicolo (gialle) di alloggiamenti di uovo e nel germarium (verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche dell'anastasis. (Adottato con permesso da Tang et al., F1000Res 2017, 06:43 21 ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il sistema di biosensore dual CaspaseTracker è un romanzo e l'unico strumento che permette la rilevazione di recente o attività di caspase in corso, rilevamento delle cellule che hanno invertito la morte delle cellule e di sopravvivere dopo aver sperimentato caspase attività in vivo. Mentre l'attività della caspasi è stato tradizionalmente assunto come un segno distintivo dell'apoptosi, crescente gli studi rivelano che non apoptotiche caspase attività svolge ruoli potenziali nella funzioni diversificata delle cellule normali, come la regolazione di attività neuronale79, 80, apprendimento e memoria81,82,83,84, soppressione del necroptotic delle cellule morte85,86, spermatid individualizzazione87, 88, microRNA elaborazione89, cellula proliferazione90e destino delle cellule patterning91. Oltre a apoptosi e anastasis, il sistema di biosensore CaspaseTracker può pertanto rilevare attività di caspase non-apoptotica, che è presente nel cervello e ottica lobi, cardia, gut, Malpighian tubuli, trachea, muscoli e altri tessuti di Drosofila19,46,64. Questo segnale di biosensore potrebbe anche rappresentare l'attività corrente o passato anastatica durante lo sviluppo dell'embrione o normale omeostasi in questi tessuti. Per studiare gli anastasis dopo transitoria delle cellule morte che inducono stress ambientale negli animali vivi, è fondamentale scegliere tessuti con le cellule che non presentano alcuna attività di caspase biosensore in condizioni fisiologiche normali, ma che possono essere indotte per subire caspase attivazione tramite induzione di morte transitoria delle cellule. Uovo di Colombo è ideali per questo scopo, perché non hanno in genere alcuna attività di caspase dal germarium alla fase 10 durante l'oogenesi58,59,92.

Esponendo femmina Drosophila a transitorio stress ambientali, come proteina fame e freddo shock, può in modo efficiente innescare l'attivazione di caspase e morte delle cellule in uovo Colombo19,57,58, 78. Fasi critiche all'interno del protocollo includono evitando di induzione di morte cellulare prolungato alle mosche. Condizioni ottimizzate di proteina fame (8% di saccarosio in 1% agar per 3 giorni) e shock freddo (1h a-7 oC) per mosche femminile possono innescare il processo di morte cellulare di caspase-attivata negli alloggiamenti di uovo e consentire loro di recuperare dopo le mosche stressate vengono restituite al condizione normale19. Il trattamento prolungato con uno stimolo di morte delle cellule può innescare più uovo alloggiamenti per subire il processo di morte cellulare, ma il tasso di recupero è anche ridotto, presumibilmente perché gli alloggiamenti di uovo morente esperienza enormi danni oltre la riparazione.

Un ulteriore passaggio critico in questo protocollo è quello di ridurre il segnale di fondo di CaspaseTracker nelle camere a uovo da crossing, sollevare e mantenere che il CaspaseTracker vola ad una temperatura inferiore, ad esempio 18 oC. Mentre la maggior parte delle camere a uovo da allevati in modo ottimale mosche non visualizzare l'attività della caspasi in germarium attraverso stage 10 durante l'oogenesi58, circa l'1% delle camere a uovo ha potuto esibire l'attività della caspasi biosensore senza induzione di morte cellulare19 . Questo può riflettere il tasso di abbandono normale a causa di errori innati o può essere innescato involontariamente durante l'oogenesi dalle condizioni standard di laboratorio. Come Gal4 vengono visualizzati meno attività in mosche a bassa temperatura93, alzando mosche a 18 oC, piuttosto che a temperatura ambiente, può ridurre il segnale endogeno che attiva il sistema di CaspaseTracker. In alternativa, mosche di commutazione ad una temperatura superiore, ad esempio 29 oC, può aumentare la sensibilità del sistema CaspaseTracker, dovuta ad per aumentare l' attività Gal493e potenzialmente altri endogeno temperatura-dipendente enzimatico attività.

È importante distinguere le cellule CaspaseTracker-positive che subiscono il processo di morte cellulare o anastasis da cellule che presentano l'attività della caspasi non-apoptotica. Cellule apoptotiche esprimono RFP (indicatore transitoria per l'attività della caspasi in corso o recente) e spesso GFP (creatore di permanente per attività di caspase precedenti) nel trattamento di induzione di apoptosi, come queste cellule hanno attività di caspase in corso quello Gal4 fendere-attivato, che poi attiva i transitori (Gal4 attività-dipendente RFP) e permanenti (Gal4 attivato FLPase-FRT mediata GFP) reporter del sistema G-traccia. Apoptosi di queste cellule possono essere confermata dalla morfologica e biochimica segni distintivi quali condensazione nucleare rilevato mediante colorazione con tinture nucleari14,19,58e la fenditura di caspase rilevato da immunostaining19,94. Le cellule che sono già stati sottoposti a anastasis visualizzare permanente espressione di GFP a causa dell'evento di ricombinazione FLPase-mediata del sistema G-traccia. Queste cellule non esprimono nessuna RFP come non hanno alcuna attività di caspase in corso, né altri segni distintivi di apoptosi19. Queste cellule inoltre visualizzano normale morfologia nucleare. Le cellule hanno in corso attività di caspase non apoptotiche mostrano spesso espressione sia RFP e GFP, e hanno anche un normale morfologia nucleare19.

Può essere difficile distinguere le cellule che sperimentato anastasis da quelle cellule che avevano passato l'attività della caspasi non-apoptotica, poiché entrambi visualizzare solo GFP e non avere nessun segno distintivo della morte delle cellule. Di conseguenza, accurati esperimenti di controllo deve essere incluso19. Per esempi, per studiare anastasis in alloggiamenti di uovo, è essenziale per esaminare l'espressione di GFP in sia sollecitato-recuperati mosche e mosche non sollecitato (controllo negativo). Recuperati mosche dovrebbero mostrare più cellule che esprimono GFP che unstressed mosche, se anastasis si è verificato dopo l'attivazione delle caspasi. È inoltre importante distinguere i segnali fluorescenti CaspaseTracker da auto-fluorescenza aspecifica, come osservato nella cuticola, pigmenti e corpi grassi19. Abbiamo generato controllo negativo biosensore mosche mutando il luogo di fenditura di caspase del biosensore (DQVD) a una sequenza non liberabili (DQVA) e quindi rendendo il biosensore di controllo non-responsivi agli caspase attività19. Il segnale rilevato nel caspase sensibili (DQVD) ma non nelle mosche di biosensore di controllo negativo (DQVA) è il segnale di interesse, innescato da attività di caspase, piuttosto che auto-fluorescenza.

Il nostro attuale Drosophila dual CaspaseTracker biosensore può identificare con attività di caspase "recente" dall'espressione di RFP e cellule con attività di caspase "passato" dall'espressione di GFP19. Notiamo che la RFP non è un indicatore di attività di caspase "tempo reale", perché ci vogliono un paio d'ore di tempo di reazione per Gal4 guidare l'espressione di RFP in risposta all'attività di caspase. Per aggiungere una funzione di "tempo reale", il biosensore CaspaseTracker di Drosophila possa essere combinato con il biosensore sviluppata di recente iCasper52, un "tempo reale" e "buio luminoso" in vivo biosensore che mostra solo il suo segnale da' quando è spaccati di caspases.

Oltre a apoptosi, CaspaseTracker potrebbe potenzialmente essere attivato anche durante i tipi alternativi di morte delle cellule come cellule possono passare vie di morte delle cellule durante il loro corso che direttamente o indirettamente coinvolge l'attivazione delle caspasi, come ad esempio l'autofagia dopo inedia95,96, necrosi dal freddo la scossa-indotta della membrana plasmatica rottura19,55,56,78e indotta da staurosporine necroptosis97, 98. I nostri attuali e precedenti studi hanno dimostrato che i biosensori di CaspaseTracker possono etichettare cellule recuperate da queste cellule morte induzioni in vitro o in vivo17,18,19 , 20 , 21. come queste induzioni di morte cellulare da solo potrebbero attivare contemporaneamente più vie di morte cellulare nelle cellule stesse, il recupero di queste cellule suggerisce quel anastasis è un fenomeno di recupero generale delle cellule che può invertire la morte delle cellule differenti processi tra cui l'apoptosi, autofagia, necrosi e necroptosis, singolarmente o contemporaneamente.

In vivo CaspaseTracker biosensore faciliterà inseguimento delle funzioni ancora sconosciute, meccanismi ed implicazioni terapeutiche della anastasis (Figura 4)21. Per rivelare la firma molecolare dell'anastasis, abbiamo effettuato studi di microarray di espressione genica di intero genoma di corso di tempo per analizzare le cellule di fegato primario del mouse durante l'inversione dell'apoptosi indotta da etanolo e interessante, trovato cambiamenti notevoli in trascrizione di geni coinvolti in vie multiple compreso pro-sopravvivenza, anti-ossidazione, risposta al danno al DNA, modifica dell'istone, angiogenesi, migrazione cellulare e trasformazione18,21. Questa constatazione è confermata dal nostro studio di convalida del recupero delle cellule tumorali del fegato umane HepG2 da apoptosi18,21e anche un recente studio indipendente di RNA-sequenziamento delle cellule HeLa in recupero di apoptosi99. È interessante notare che, up-regolazione di alcuni fattori pro-sopravvivenza trovato in anastatica cellule si osservano anche in inversione di insufficienza cardiaca, progressione del tumore e cancro recidiva100,101,102, suggerendo la partecipazione potenziale di anastasis. Per studiare le potenzialità fisiologiche, patologiche e terapeutiche dell'anastasis, è importante identificare le cellule anastatica e tiene traccia del loro destino nei piccoli animali, come questo consentirà studi meccanicistici e terapeutici. La nostra Drosophila e mammiferi CaspaseTracker biosensori sarà strumenti utili per testare i potenziali contributi dell'anastasis in uno sviluppo normale, omeostasi, recupero dei tessuti, evoluzione del tumore, recidiva del tumore e metastasi. Ricerca da questi studi sarà aumentare la nostra comprensione del ruolo naturale di anastasis e offrono il potenziale per identificare rivoluzionari nuovi approcci terapeutici per malattie intrattabili mediando la morte delle cellule e la sopravvivenza attraverso il controllo di anastasis.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Darren Obbard per Drosophila immagine in figura 3 e nel manoscritto dei video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb per la preziosa discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e NCI K22 concedere CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang è stato un Hildi e Kay Curci Foundation Fellow della Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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