Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Immunology and Infection

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Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

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Abstract

Regolamentazione delle cellule T (T reg), che esprimono Foxp3 come un fattore di trascrizione, sono sottoinsiemi di cellule T CD4 +. Le cellule T reg svolgono un ruolo cruciale nella tolleranza immunitaria e manutenzione omeostasi dalla regolazione della risposta immunitaria. Il ruolo primario delle cellule T reg è di sopprimere la proliferazione delle cellule T effettrici (T eff) e la produzione di citochine, quali IFN-γ, TNF-α e IL-2. È stato dimostrato che la capacità delle cellule T reg di inibire la funzione delle cellule T eff è migliorata durante l'infezione patogeno persistente e lo sviluppo del cancro. Per chiarire la funzione delle cellule T reg in condizioni di riposo o infiammate, una varietà di saggi in vitro soppressione utilizzando cellule reg topo o T umana sono stati ideati. L'obiettivo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo per confrontare le differenze di fenotipo e la funzione soppressiva tra riposo e reg T attivatecellule. Per isolare le cellule T attivate reg, i topi sono stati infettati con il virus linfocitica choriomeningitis (LCMV) clone 13 (CL13), un ceppo cronica di LCMV. Le cellule T reg isolate dalla milza di topi LCMV CL13-infettati esposti sia il fenotipo attivato e l'attività soppressiva maggiore rispetto a riposo cellule T reg isolate da topi naive. Qui, descriviamo il protocollo di base per l'analisi ex vivo fenotipo di distinguere le cellule T attivate reg dal riposo cellule T reg. Inoltre, si descrive un protocollo per la misurazione dell'attività soppressiva di cellule T reg pienamente attivato.

Introduction

T regolatorie (T reg) cellule esprimono scatola forkhead P3 (Foxp3) come un fattore di trascrizione per il loro sviluppo e la funzione 1. Inoltre, le cellule reg T esprimono varie altre molecole come CD25 2, gene linfociti-attivazione 3 (GAL-3) 3, indotta da glucocorticoidi tumor necrosis factor receptor 4, e linfociti T citotossici-proteina associata 4 (CTLA-4) 5 sulla loro superficie o regione intracellulare. Durante l'infezione cronica con vari tipi di agenti patogeni come virus, batteri 6,7 8,9 e parassiti 10-12, o in corso di sviluppo del cancro 13,14, le cellule T reg si differenziano in cellule attivate, visualizzando la funzione soppressiva migliorata cellule effettrici mira CD4 + e CD8 + T. Un certo numero di documenti hanno suggerito che le cellule T espanse reg e attivati ​​contribuiscono ai deteriorate respons cellule CD8 + Te durante amico retrovirus (FV) l'infezione 15-17. Le cellule T reg FV-indotte inibiscono IFN-γ o l'espressione granzima B e reattività citotossica delle cellule T CD8 + 15-17. Inoltre, in un modello di infezione da virus herpes simplex, è stato riferito che la deplezione delle cellule reg T CD4 + CD25 + provocato l'espansione di cellule T CD8 + specifiche per virus e gravi danni ai tessuti da infiltrazione di cellule T CD4 + immunopatogenici 18-20.

Topi infettati cronicamente con il clone 13 ceppo di virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV CL13) 21-24 sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare il fenotipo e la funzione delle cellule T effettrici (T FEP) e le cellule T reg durante l'infezione cronica da virus. Durante l'infezione LCMV persistente, specifico per il virus T cellule eff perdono progressivamente la loro funzione effettrici e diventano esaurite le cellule T (T exh). D'altra parte, Tcellule reg rafforzano la loro capacità di sopprimere la risposta delle cellule specifiche del virus T 25. La diminuzione della capacità di funzionamento delle cellule eff T può essere spiegato da diversi fattori quali upregulation dei recettori inibitori su cellule eff T, alterata funzione delle cellule presentanti l'antigene, la produzione di citochine immunomodulanti, e aumento della frequenza o migliorata funzione di T reg cellule 26. Tra i fattori coinvolti nella soppressione delle cellule T, morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) esprimente cellule EXH T e le cellule T reg sono stati ampiamente considerati come i tratti distintivi di antigene persistenza e l'ambiente soppressivo. Recentemente, è stato riferito che il blocco della via PD-1 e l'ablazione delle cellule T reg portare ad una maggiore funzione delle cellule T e una diminuzione del carico virale durante LCMV infezione cronica 27. Inoltre, le cellule T reg vengono attivate durante l'infezione cronica di topi con LCMV 23,25 25. PD-1 è altamente espresso sulle cellule T reg così come le cellule T EXH, e il livello di PD-1 espressa dalle cellule T reg correla con la forza della loro funzione soppressiva di inibire la proliferazione delle cellule T 25.

Qui, descriviamo un metodo per confrontare le caratteristiche delle cellule T attivate reg isolati da topi infettati con LCMV CL13 e le cellule reg riposo T isolate da topi naive. Inoltre, si spiega una serie di processi per separare le cellule T attivate reg ed esaminare la loro ex vivo fenotipo, nonché misurare la loro attività soppressiva in vitro.

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Protocol

In questo studio, i topi sono stati mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni della Yonsei Laboratory Animal Research Center della Yonsei University. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida Korean Food and Drug Administration utilizzando protocolli approvati dal Comitato Internazionale cura degli animali e uso del centro Animal Research Laboratory presso Yonsei Yonsei University.

1. preparazione di soluzioni

  1. Preparare 2% RPMI mezzi diluendo siero bovino fetale (FBS) al 2% e la penicillina-streptomicina al 1% in RPMI
  2. Preparare i media RPMI completo. Per RPMI media aggiungi 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina, 1% di L-glutammina e 50 mM 2-mercaptoetanolo.
  3. Preparare la fluorescenza attivato l'ordinamento delle cellule del buffer (FACS). Per fare in modo salina, supplemento tampone fosfato (PBS) con il 2% di FBS.
  4. Preparare buffer di isolamento delle cellule T. Per fare ciò, integrare PBS con il 2% di FBS e 2 mm ethylenediaminetetraaL'acido CETIC.

2. Isolamento dei linfociti della milza

  1. Rimuovere la milza di topi naive o LCMV CL13-infetti come descritto in precedenza 19 e metterli in x 15 mm piastre di Petri contenenti 10 ml di 2% dei media RPMI 60mm.
    NOTA: In questo studio esperimenti, da 5 a 6 settimane di età C57B1L / 6J topi di sesso femminile ha ricevuto 2 x 10 6 unità formanti placca (PFU) di LCMV CL13 mediante iniezione endovenosa attraverso la vena della coda. Sacrificare i topi a giorno 16 dopo l'infezione (16 d pi) 25. topi ingenui Analizzare ge-abbinati erano lo stesso giorno.
  2. Inserire un colino cella in una provetta da 50 ml e sciacquarlo con 2 ml di 2% Mezzi RPMI. Posizionare la milza sul setaccio cellulare 70 micron e macinare con lo stantuffo di una siringa. Risciacquare il filtro cella con 2 ml di 2% Mezzi RPMI e rimuoverlo dal tubo 50 ml.
  3. Riempire il tubo con 2% Mezzi RPMI e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere ilpellet di cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK. Incubare i campioni a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
    NOTA: Il volume di ACK tampone di lisi sopra indicato è per una milza. Scalare il volume di conseguenza per i campioni di milza pool.
  4. Riempire il tubo con 2% Mezzi RPMI e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml in mezzi RPMI completo.
    NOTA: Per il conteggio delle cellule vive, le cellule macchia con trypan blu e contare vivere solo cellule che non sono macchiati con emocitometro.

3. Fenotipizzazione di splenica convenzionale T (T conv) Cellule e cellule T reg

NOTA: Prima di isolamento delle cellule T reg, esaminare il fenotipo dei linfociti splenici isolati da topi naive o infetti colorando le cellule con diversi anticorpi e analizzandoli mediante citometria a flusso.

  1. Trasferire 50 ml di cellule(5 x 10 5 cellule) rispetto al totale dei linfociti splenici in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti u-basso e aggiungere 150 ml di tampone FACS per pozzetto. Centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C.
  2. Eliminare il surnatante. Agitare il pellet di cellule e aggiungere 200 ml di tampone FACS per pozzetto. Centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C (2 volte).
  3. Preparare il cocktail di anticorpi per marcatori di superficie delle cellule di colorazione in 50 ml di tampone FACS per bene con i seguenti anticorpi e reagenti. colorante anti-CD4 viola, colorante verde anti-CD25, anti-PD-1 dye viola, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 tintura e la vitalità delle cellule di rilevamento reattivo nel vicino infrarosso (IR) colorante reattivo fluorescente.
    NOTA: Per analizzare ulteriormente il fenotipo delle cellule T attivate reg, anti-CD103 23,25 può essere aggiunto per cellulare di superficie-marcatore colorazione.
  4. Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di anticorpi cocktail per pozzetto. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule due volte conFACS tampone per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C.
  5. Dopo l'ultimo lavaggio, decantare il surnatante e fissare le cellule per 20 minuti al buio a 4 ° C con 100 pl di tampone di fissaggio preparati secondo il protocollo del produttore.
  6. Lavare le cellule due volte con il tampone di lavaggio permeabilizzazione (preparato secondo il protocollo del produttore) mediante centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C.
  7. Preparare la soluzione di anticorpi per intracellulare colorazione Foxp3, e risospendere il pellet cellulare con 50 ml di soluzione di anticorpi anti-Foxp3.
    NOTA: Per analizzare ulteriormente i fenotipi di conv T e le cellule T reg, anti-CTLA può essere aggiunto in questa fase.
  8. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C e ripetere il passo 3.6. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 200 ml di buffer di FACS ed esaminare il fenotipo delle cellule da citofluorimetro 25.
  9. Porta il popula cellule vivezione. Per analizzare i fenotipi di cellule T conv durante l'infezione LCMV CL13, esaminare la frequenza di Foxp3 - PD-1 + cellule tra le cellule CD4 + o CD8 +.
    NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di Foxp3 - PD-1 + è superiore al 50% in popolazioni di cellule CD4 + e CD8 + a 16 d pi con LCMV CL13.
    1. Per analizzare la frequenza e fenotipi di cellule T reg, esaminare le frequenze di Foxp3 + o Foxp3 + PD-1 + cellule tra cellule T CD4 +.
      NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di Foxp3 + o + PD-1 + cellule Foxp3 è superiore al 20% della popolazione di cellule T CD4 +, rispettivamente.

4. Isolamento dei CD25 + T CD4 + Cellule reg

NOTA: I volumi di tutti i reagenti indicati di seguito sono per unpartendo numero di cellule di 1 x 10 7 splenociti totali.

  1. Preparare le cellule come descritto nella sezione 2 utilizzando topi con infezione cronica ingenui e LCMV. Lavare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di tampone isolamento delle cellule T. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 40 ml di tampone.
  2. Per l'arricchimento delle cellule CD4 + T utilizzando il sistema di separazione cellulare magnetica, aggiungere 10 ml di cocktail di biotina-anticorpo e mescolare bene. Incubare per 10 minuti a 4 ° C.
  3. Aggiungere 30 ml di tampone, 20 ml di anti-biotina microsfere per l'etichettatura di cellule non-CD4 + T e 10 ml di anticorpi CD25-PE per l'etichettatura fluorescente di cellule CD25 +. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio.
  4. Aggiungere 2 ml di tampone e superare le cellule attraverso un filtro 40 micron cella in un nuovo tubo 50 ml per rimuovere i detriti cellulari. Lavare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C.Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di buffer ad una densità massima di 1,25 x 10 8 cellule.
  5. Applicare le celle nella colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna. Lavare la colonna con l'aggiunta di 2 ml di tampone e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e sospendere nuovamente le cellule T CD4 + isolate in 90 ml di tampone.
  6. Per l'etichettatura magnetica di cellule CD25 +, aggiungere 10 ml di microsfere anti-PE, mescolare bene, e incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C.
  7. Aggiungere 2 ml di tampone e lavare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone ad una densità di fino a 1 x 10 8 cellule.
  8. Per arricchire le cellule reg CD25 + T CD4 +, applicare le cellule nella colonna di selezione positiva, e lavare la Column aggiungendo 2 ml di tampone. Ripetere il lavaggio tre volte.
  9. Quando la colonna è vuota, dopo la fase di lavaggio finale, aggiungere 1 ml di tampone sulla colonna, e stanare il magneticamente etichettato CD4 + CD25 + cellule usando lo stantuffo.
  10. Ripetere i passaggi 4,8-4,9 per migliorare la purezza delle cellule isolate reg CD4 + T + CD25. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule isolate reg CD4 + T + CD25 ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in mezzi RPMI completo.
  11. Per controllare la purezza delle cellule T reg isolato-CD4 + CD25 +, utilizzare 2 x 10 5 cellule dal totale cellule reg isolato-CD4 + CD25 + T. Colorare le cellule con 50 ml di tampone FACS contenente anti-CD4 FITC e la vitalità delle cellule rilevamento reattivo vicino infrarosso colorante reattivo fluorescente.
    NOTA: CD25 è stato già etichettato con PE durante l'isolamento.
  12. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 100 ml di buffer di FACS e verificare la purezza mediante citometria di flusso.
  13. Porta la popolazione live-cell. Per analizzare la purezza delle cellule T reg, confermare la percentuale di cellule CD4 + CD25 +.
    NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di cellule CD4 + CD25 + tra le cellule purificate è superiore a circa 80%.

5. L'isolamento di cellule T CD8 + e l'etichettatura delle cellule T CD8 +

NOTA: I volumi di tutti i reagenti indicati di seguito sono per un numero di cellule di partenza di 1 x 10 7 splenociti totali.

  1. Preparare le cellule come descritto nella sezione 2 utilizzando topi naive. Lavare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di isolamento delle cellule T appassionatoER. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente, e risospendere il pellet cellulare in 40 ml di tampone.
  2. Per l'isolamento delle cellule T CD8 + utilizzando il sistema di separazione cellulare magnetica, aggiungere 10 ml di cocktail di biotina-anticorpo per l'etichettatura delle cellule + T CD8 non e mescolare bene. Incubare per 5 minuti a 4 ° C.
  3. Aggiungere 30 ml di tampone e 20 ml di microsfere anti-biotina. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C.
  4. Applicare le celle nella colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna. Lavare la colonna aggiungendo 2 ml di tampone per tre volte.
  5. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere le cellule isolate + T CD8 in 2 ml di tampone.
  6. Per verificare la purezza delle cellule isolate, preparare 50 ml di soluzione di anticorpo in tampone FACS. Risospendere le 2 x 10 5 cellule tra isolato T CD8 + cells in 50 ml di soluzione di anticorpi.
    NOTA: Per preparare la soluzione di anticorpi, aggiungere l'anti-CD8 FITC, e la rilevazione vitalità cellulare reagente (vicino infrarosso colorante fluorescente reattiva) nel buffer FACS.
  7. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 100 ml di tampone FACS, e verificare la purezza delle cellule mediante citometria di flusso.
  8. Porta la popolazione live-cell. Per controllare la purezza delle cellule T CD8 +, confermare la percentuale di cellule T CD8 +.
    NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di cellule CD8 + tra le cellule purificate è superiore a circa il 90%.
  9. Aggiungere PBS le cellule isolate T CD8 +. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule T CD8 + isolati ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml in PBS.
  10. Per etichettare ce T CD8 +lls per il saggio di soppressione in vitro, diluire proliferazione cellulare colorante inseguimento violetto in PBS per ottenere una concentrazione di 5 mM a RT.
    NOTA: Le approssimate eccitazione ed emissione picchi del colorante inseguimento viola proliferazione cellulare utilizzato nello studio sono 405 e 450 nm, rispettivamente.
  11. Mescolare bene volumi uguali di proliferazione cellulare colorante inseguimento viola (5 mM) e sospensione cellulare (1 x 10 7 cellule / ml di cellule CD8 + T) in una provetta da 15 ml, e incubare a 20 min a 37 ° C. Agitare il tubo ogni 10 min.
  12. Riempire il tubo con freddo multimediale completo RPMI, e lasciare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante completamente, e risospendere le cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml con mezzi RPMI completo pre-riscaldato. Incubare le cellule per 15 minuti a RT.

6. Impostazione del test in vitro soppressione Utilizzando CD4 + CD25 + T <sub> reg e cellule T CD8 +

  1. Per preparare anti-CD3 / CD28 perle rivestite, trasferire il volume appropriato di sfere magnetiche ad un 15 ml di tubo (2,5 ml / 1 x 10 5 cellule). Aggiungere un volume uguale di PBS e mescolare. Lavare per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Diluire le sfere magnetiche in completa media (50 pl / pozzetto).
  2. Aliquota 50 ml di cellule reg T CD4 + CD25 + per pozzetto della piastra da 96 pozzetti u-basso (1 x 10 5 cellule / pozzetto). Aggiungere 50 ml di cellule T CD8 + T come responder (resp T) cellule per pozzetto (1 x 10 5 cellule / pozzetto). Aggiungere 50 ml di anti-CD3 / CD28 perle rivestite diluito in ogni pozzetto.
    NOTA: In questa fase, l'etichetta e impostare pozzetti di controllo come segue: "non stimolata linfociti T CD8 + solo" senza anti-CD3 / CD28 perle rivestite; "Solo linfociti T CD8 +" con anti-CD3 / CD28 perle rivestite; Solo "delle cellule T CD8 +"Con anti-CD3 / perline CD28 rivestite;". T cellule reg solo "con anti-CD3 / perline CD28 rivestite cellule reg T possono essere diluiti dai media complete e co-coltura con cellule T resp in un diverso rapporto tra T cellule resp: cellule T REG (1: 0,25-1: 1).
  3. Aggiungere 50 ml o il volume appropriato di supporto in tutti i pozzetti a volume totale di 200 ml. Coprire la piastra con un foglio e incubare in un incubatore CO 2 a 37 ° C per 72 ore.

7. Analisi di CD8 + T Cell Proliferation e produzione di citochine da cellule T CD8 +

  1. Per l'analisi produzione di citochine, dopo 3 giorni di coltura, separare il surnatante di ogni bene in un altro piatto e di eseguire test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
    NOTA: Il supernatante può essere aliquotati e conservati a -70 ° C. In questo esperimento, la piastra rivestita di anticorpo anti-topo IFN-γ è stato utilizzato per rilevare IFN-γ accordo di produzionezione al protocollo del produttore s. Per determinare la produzione di IFN-γ delle cellule proliferanti T CD8 + su un unico livello cellulare, intracellulare di citochine colorazione può essere eseguita.
  2. Dopo aver separato il surnatante da ogni pozzetto, lavare la piastra contenente le cellule con tampone FACS e centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C (3 volte).
  3. Dopo il lavaggio, scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di cocktail di anticorpi per la colorazione delle cellule T CD8 + proliferato. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C.
    NOTA: Per preparare cocktail di anticorpi, aggiungere l'anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5, e il reagente di rilevamento vitalità cellulare (vicino infrarosso colorante fluorescente reattiva) nel buffer FACS.
    NOTA: anticorpi contro vari marcatori quali CD44 o CD69 possono essere combinati con altri anticorpi per confermare l'attivazione delle cellule T CD8 +. Ricordate che le cellule T CD8 + sono già stati etichettati con la proliferazione cellulare di monitoraggio vtintura iolet a Passo 5.10.
  4. Lavare due volte per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo l'ultimo lavaggio, scartare il surnatante, e fissare le cellule per 20 minuti al buio a 4 ° C con 100 pl di tampone di fissaggio.
  5. Lavare due volte per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule con 200 microlitri di tampone FACS e misurare la proliferazione delle cellule T CD8 + dye-marcato inseguimento viola proliferazione cellulare mediante citometria di flusso.
    1. Porta la popolazione di cellule T CD8 + tra le cellule vive. Misurare le percentuali di cellule divise e indivise seconda della diluizione della proliferazione cellulare colorante inseguimento violetta e diluizione cellule T CD8 + secondo la seguente equazione. % Di inibizione = [(% di cellule T CD8 + proliferavano in assenza di cellule T reg -% di cellule T CD8 + proliferato in presenza di cellule T reg) / (% di cellule T CD8 + proliferavano inl'assenza di cellule T reg)] x 100. Ulteriori analizzare i dati utilizzando il software di citometria a flusso 25.

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Representative Results

Abbiamo generato topi con infezione da virus persistente, iniettando loro con 2 x 10 6 pfu di LCMV CL13 per via endovenosa. Per studiare i cambiamenti fenotipici nelle cellule T reg e le cellule T conv durante l'infezione cronica da virus, linfociti splenici ottenuti da topi naive e infetti sono state colorate con vari anticorpi e analizzati mediante citometria di flusso. A 16 anni d PI, PD-1 è stato upregulated in entrambi Foxp3 - T CD4 + conv (Figura 1A, pannello superiore) e Foxp3 - T CD8 + conv (Figura 1B, pannello superiore) cellule. La frequenza di cellule T reg + Foxp3 + CD4 era due volte maggiore nei topi LCMV CL13-infettati che nei topi naive (Figura 1A). In particolare, la maggior parte delle cellule reg Foxp3 + CD4 + T visualizzato il fenotipo attivato, esprimendo alti livelli diPD-1 in questo momento (Figura 1A).

Per il saggio di soppressione in vitro, sono stati richiesti un numero considerevole di cellule T CD8 + conv e cellule reg CD4 + T + CD25. Per ottenere cellule T CD8 + dye-marcato proliferazione di monitoraggio viola 1 x 10 7 cellule, splenociti da due milze di topi naive sono stati raggruppati. Per ottenere 2 x 10 6 o 3 x 10 6 di cellule reg T CD4 + CD25 +, almeno tre milza di topi naive e LCMV CL13-infettati rispettivamente, sono stati raggruppati. Cellule T CD8 + da cellule T resp stati separati con successo senza significativa contaminazione con altre cellule immunitarie (Figura 2A). Cellule reg T potrebbero essere isolati, con una popolazione dominante di cellule T CD25 + CD4 con più di 80% di purezza (Figura 2B).

Per confrontare la funzione soppressiva delle cellule T reg naive e croniche, la T reg isolata e le cellule T sono state incubate resp insieme sotto stimolazione con perline anti-CD3 / CD28 rivestite a 37 ° C per 3 giorni. % Di inibizione di + T CD8 proliferazione cellulare resp è aumentata in cellule T reg dese-dipendente modo (Figura 3A). Quando le cellule T CD8 + resp sono stati co-coltura con cellule T reg cronica in un rapporto di 1: 1, la proliferazione delle cellule T CD8 + resp erano significativamente inibito (Figura 3B). Produzione di IFN-γ da parte delle cellule T CD8 + resp erano significativamente inibita quando le cellule CD8 + T resp sono stati co-coltura con cellule T reg attivate da topi con infezione cronica piuttosto che con le cellule T reg riposo da topi ingenuo in un reg T (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1: fenotipi di cellule CD4 + e CD8 + T nella milza di topi naive o topi LCMV CL13-infettati a 16 d pi (A) L'espressione di PD-1 o CD25 in Foxp3 - T CD4 + conv e Foxp3 + CD4 + le cellule T reg. (B) L'espressione di PD-1 o CD25 in Foxp3 - cellule conv T CD8 +. linfociti splenici sono state colorate con anticorpi anti-CD4, CD8, CD25, PD-1, e Foxp3. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Pannello A è stato modificato da 25 come riferimento. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Purezze di cellule resp T isolate da topi naive e le cellule T reg isolate da topi naive o LCMV CL13-infetti (a) percentuale di cellule T CD8 + dopo l'isolamento.. (B) percentuale di cellule reg T CD4 + CD25-esprimendo dopo l'isolamento. Ciascun quadrante in (B) è stato determinato dai livelli di espressione di CD4 e CD25. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Effetto di cellule T reg attivate sulla risposta delle cellule T CD8 + (A)% di inibizione delle cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in modo dose-dipendente delle cellule T reg.. (B) La proliferazione delle cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in rapporto 1: 1. (C) IFN-γ produzione di cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in modo dose-dipendente delle cellule T reg. La proliferazione delle cellule T CD8 + è stata misurata mediante diluizione di colorante di monitoraggio viola proliferazione delle cellule in cellule T CD8 + proliferato e la secrezione di IFN-γ è stata valutata mediante ELISA. Cellule T CD8 + dye-marcato monitoraggio viola proliferazione cellulare sono state stimolate con anti-CD3 / CD28 perle rivestite per 3 giorni in assenza o la presenza di T + co-coltivate con e senza cellule T reg rispettivamente. Riempito picchi grigio nell'istogramma indicano proliferazione delle cellule T CD8 + co-coltura senza cellule T reg. Ogni gruppo è stato progettato in triplicato. Le barre rappresentano significare + SEM. Questa cifra è stata modificata da 25 come riferimento. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Anche se solo un piccolo numero di cellule T reg esiste nei topi e nell'uomo, è importante capire la loro funzione come giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta immunitaria e mantenimento della tolleranza immunitaria. Le funzioni di numeri e soppressive di T reg cellule aumenta nel corso di una infezione da virus cronica 15-20 così come la progressione del cancro 13,14. Questo è probabilmente dovuto alla stimolazione antigenica continua. Per valutare l'cellule T reg funzionano sotto antigene persistenza e lo sviluppo della malattia, la loro attività soppressiva deve essere misurato.

Qui, descriviamo un protocollo per analizzare la ex vivo fenotipo delle cellule T reg e misurare la loro attività soppressiva utilizzando un sistema in vitro di co-coltura di cellule T CD8 + e cellule T reg. Passaggi critici nel protocollo corrente sono l'analisi e l'isolamento di cellule T reg. Live e fresco isolato T in vitro. Abbiamo anche esaminato i fenotipi di T conv e le cellule T reg nel corso di una infezione da virus cronica. Cellule conv T, cioè, Foxp3 - cellule CD4 + e CD8 + hanno mostrato una diminuzione in attività cellulare dopo l'infezione cronica da virus (Figura 1). L'espressione PD-1 è stato upregulated in entrambe le popolazioni di cellule T conv. Aumento del numero di cellule T reg e up-regolazione di PD-1 sono le caratteristiche di risposta immune nel corso di una infezione da virus cronica. Inoltre, anti-corpi di altri recettori inibitori come TIM-3 e CTLA-4 possono essere utilizzati in combinazione con PD-1 per esaminare il fenotipo delle cellule T mediante FACS dopo l'infezione del virus corale.

Per studiare l'attività soppressiva, cellule T e cellule resp reg T sono state co-coltivate con un rapporto di 1 a 1. Co-coltura con T regle cellule di topi con infezione cronica significativamente ridotta proliferazione delle cellule T CD8 + e la secrezione di IFN-γ rispetto alle cellule T reg da topi naive. Ciò implica che la proliferazione e produzione di citochine di cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg sono inversamente proporzionali alla funzione soppressiva delle cellule T reg. Anche se questo protocollo raccomanda l'uso di un sistema di separazione cellulare magnetica per l'isolamento delle cellule T reg, la contaminazione con cellule reg non-T non può essere esclusa. Le cellule T reg ottenute da topi reporter Foxp3-GFP 28-30 sono candidati migliori per indagare accuratamente la funzione delle cellule T reg rispetto al sistema di separazione cellulare magnetica, come CD25 è spesso overexpressed sulle cellule T reg T CD4 + conv e attivati.

La funzione soppressiva delle cellule T reg è stato valutato da vari in vitrotest di soppressione 16,28,31-34. Il vantaggio del test di soppressione in vitro è che valuta l'effetto diretto di cellule T reg sulla inibizione della risposta delle cellule T CD8 +, perché solo le cellule T sono resp co-coltura con cellule T reg. Oltre alle cellule T CD8 +, il CD25 - cellule T CD4 + può essere usato al posto di cellule T Resp 25. Gli effetti di reg T o cellule T conv sulle cellule immunitarie come le cellule dendritiche e cellule natural killer possono essere valutate variando le condizioni sperimentali.

Molecole come il CD103 35, GAL-3 36, glicoproteina A ripetizioni predominante 37, CD43 38, CD11a 38, o cellule killer lectina-like receptor sottofamiglia membro G 1 38 sono stati utilizzati come marcatori di cellule reg T attivate in malattie specifiche. In questo protocollo, abbiamo usato PD-1 comeIndicatore di identificare attiva le cellule T reg durante l'infezione cronica da virus. Questo protocollo può essere utilizzato per le analisi poliedriche (fenotipici e funzionali) delle cellule T reg in condizioni specifiche.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

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References

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