펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
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Biology

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Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

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Abstract

Introduction

유리 구슬 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 시각화 DNA 기판 1,2- 고분자 물리학 DNA - 단백질 상호 작용, 단백질 역학 조사에 이용되었다. 3,4- 단일 닿는 큰 DNA 분자를위한 플랫폼 구별 몇 갖는다 이점, 다른 DNA의 고정화 방법으로 비교 하였다. (5) 우선, 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 결합 부위를 인식하는 DNA 결합 단백질에 대한 중요하다 전단 흐름없이 자연스러운 임의 코일 형태를 갖는다. 둘째, 유동 챔버에서 일련의 효소 반응에 대한 DNA 분자 주위의 화학적 환경을 변경하는 것은 매우 쉽다. 셋째, 미세 유체 전단 흐름 대안 DNA 신장을 사용하여 달성하는 것은 매우 어렵다 전체 윤곽 길이의 100 %까지 연신 분자량 DNA는 표면 고정화 6 및 나노 채널 가둠으로 접근 유도한다.도 7a stretche 완전히D DNA 분자는 게놈지도에서 효소의 움직임을 모니터링하는 데 유용 할 수의 위치 정보를 제공한다.

그럼에도 불구하고, DNA 테 더링 방식은 YOYO-1은 일반적으로 닿는 DNA 분자가 용이 형광 여기 광에 의해 파손되게로서 그 인터 염료의 중요한 단점을 갖는다. 일반적으로, 많은 DNA 분자는 형광 현미경 시각화 형광 염료로 염색 될 수있다. 이를 위해, YOYO-1 또는 다른 TOTO 계 염료는 이중 가닥 DNA를 층간 삽입 할 때 이러한 염료 만 형광 때문에 주로 사용된다. (8) 단, 비스 인터 염료 광 - 유도 DNA의 광 분열로 인해 발생하는 것이 잘 알려져 형광체의 인터. 9 항, 표면에 닿는 형광 염색 DNA 분자는 전단 흐름이 자유롭게 DNA 분자 이동에 힘을 깨고 발휘할 수 있기 때문에 더 약하고. 따라서, 우리는 새로운 D-FP로 DBP 개발표면에 닿는 큰 DNA 분자 이미징 NA 단백질 염색 염료. FP-DBP를 사용하는 이점은 그것이 바인딩하는 DNA 분자의 광 분열이 발생하지 않는다는 것이다. (10) 또한 비스 인터 염료 윤곽 길이를 증가하면서, FP-DBP는 DNA의 윤곽 길이가 증가하지 않는다 약 33 % 정도.

이 비디오 방법은 PEG-비오틴 표면에 큰 DNA 분자를 테 더링에 대한 실험 방법을 소개합니다. (1) 평활 말단 스티커 끝으로 DNA를 테 더링의 서로 다른 접근 방식을 보여줍니다. 따라서, 이러한 착색 방법은 DNA 분자의 모든 유형에 적용 할 수있다. 2 DNA 분자를 늘릴뿐만 아니라 화학적 및 효소를로드하는 전단 흐름을 생성하기 위해 주사기 펌프에 의해 제어 될 수 유량 용기 조립체의 개략적 인 표현을 도시 한 도표 솔루션을 제공합니다. 그림 3은 PEGylat에 닿는 완전히 뻗어 DNA 분자의 현미경 사진을 보여줍니다에드면 (11) 및 FP-DBP로 염색.

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Protocol

1. DNA 바이오 티 닐화

  1. 터미널 트랜스퍼하여 블런트 엔드 DNA의 바이오 티 닐화 (TDT)
    참고 : 무딘 엔드 DNA이다 사용 T4 DNA (166 KBP)를.
    1. 2.5 밀리미터의의 CoCl2, 10 × 반응 버퍼의 5 μL, 10 mM의 비오틴-11-dUTP를 0.5 μL, 터미널 전이 0.5 μL (10 대), 및 T4 DNA의 0.5 μL (0.5 μg의 / μL)을 5 μl를 추가 반응 혼합물에 관한 것이다. 물 38.5 μL를 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피로 만든다.
    2. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
      주의 : 연장 반응 시간, 즉 이중 닿는 DNA를 얻을 수 있고, biotins이 양단 태그 것이 가능하다.
    3. 0.5 M EDTA, pH가 8의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
    4. 4 ° C에서 튜브를 유지합니다.
  2. DNA 리가 제를 사용하여 접착 종단 DNA의 바이오 티 닐화
    참고 : 끈적 엔드 DNA이다 사용 λ DNA (48.5 KBP). <올>
  3. T4 DNA 리가 아제의 1 μL, 10 × 내고 버퍼의 5 μl를 25 ng의 1 μl를 추가 / λ 파지 DNA μL, 50 μL의 최종 부피를 만들기 위해 물을 43 μl를 추가합니다.
  4. 4 ° C에서 튜브를 유지합니다.

2. 기능화 표면 유도체 화

:.도 1에 도시 된 바와 같이 유리 표면에 DNA 분자의 말단 밧줄하기 위해, 차 아민기를 바이오틴 PEG 코팅 하였다 커버 슬립에 실란 화되고 이는 PEG 화 과정은 단일 분자 DNA 이미징에 중요한 그 때문에 크게 표면에 원하지 않는 분자의 부착에 의해 생성 된 랜덤 노이즈를 감소시킬 수있다.

  1. 피라냐 청소
    참고 : 피라냐 솔루션 따라서는 적절한 안전 지침에 따라주의하여 취급해야한다, 유기 물질과 격렬하게 반응한다.
    1. 장소는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 랙 된 커버, 및 B을 길게Y PTFE 길이 스레드 인감 테이프, 랙에 표면의 가장자리 반에 반. 래핑 후, 세정 과정에서 랙을 처리 테이프의 긴 조각 (~ 5cm)를 떠난다.
    2. SO H 2 O 2의 4, 150 ml의 흄 후드에서 피라 솔루션을 만들기 위해 H 2의 350 ml의 1 L의 유리 비커를 입력합니다. 2 시간 동안 피라냐 용액에 선반을 두십시오.
    3. 비커에서의 pH까지 탈 이온수로 철저하게 빈 비커에서 피라 솔루션 및 린스 된 커버는 중립에 도달한다. 산도 종이 스트립을 사용합니다.
    4. 30 분 동안 비이커에서 물을 함유 커버 슬립의 랙 초음파 처리. 비커에서 불과 아미노 실란 화하기 전에 빈 물. 유리 기판 청소 및 유도체 화하는 초음파 전력 75 W를 사용합니다.
  2. 유리 표면에 Aminosilanization
    1. N 2 ㎖를 추가 - [3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필] 에틸렌 디아민, 200 mL의 빙초산 10 ㎖aminosilanization 용액을 제조 깨끗한 폴리 프로필렌 용기에 메틸 알콜.
    2. 폴리 프로필렌 용기에 세척 된 커버를 놓습니다. 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어.
    3. W. 적어도 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어 75에서 15 분 동안 유도 된 커버 슬립으로 비이커를 초음파 처리.
    4. 에틸 알코올로 두 번 비커에서 솔루션을 비우기, 메틸 알코올로 한번 신중 된 커버를 세척합니다. 저장 에틸 알콜 된 커버와 2 주 내에서 사용합니다.
  3. 커버 슬립의 PEG 화
    1. 0.1 M 중탄산 나트륨 10 ㎖ (의 NaHCO3)을 만든다. 0.22 μm의 주사기 필터 솔루션 필터.
    2. 비오틴-PEG 숙신 카보네이트 (비오틴-PEG-SC)과의 NaHCO3 350 μL에 PEG 숙신 발레 레이트 80 mg의 (MPEG-SVG)의 2 mg을 녹이고. 가벼운 보호 튜브를 사용합니다.
    3. 1 적극적으로 튜브를 와동0 초 원심 분리는 1 분 거품을 제거하는 10,000 × g에서.
    4. 에틸 알콜로 세척 한 다음 아세톤 유리 슬라이드를 헹군다. 공기 슬라이드가 완전히 건조 할 수 있습니다.
    5. 깨끗한 유리 슬라이드에 PEG 용액의 방울 (50 μl를) 놓습니다. 모든 거품을 생성하지 않고, 아미노 실란 화 커버 슬립으로 부드럽게 방울을 커버.
    6. 3 시간 동안 장소 슬라이드 밤새 어둠 속에서, 실온에서 습기 챔버를 잘 평준화합니다. 바닥에 물 챔버로 빈 피펫 팁 홀더를 사용합니다. 튜브에 잔류 PEG 용액을 밀봉하고 4 ℃에서 보관하십시오.
    7. 탈 이온수로 철저하게 PEG 화 coverslip에 린스. 사용할 때까지 어둡고 건조한 장소에 보관하십시오.

3. 유량 용기를 조립

  1. .도 2에서와 같이, 펀칭 아크릴 홀더를 제작 튜브 인서트의 직경이 0.762 mm 인 것을 확인하고 하나의 구멍 입구 인 지정 다른 것은출구 (그림 2).
  2. 모든 채널에 구멍을 교란하지, 입구와 출구 구멍에 수직으로 정렬 양면 접착 테이프 스트립 아크릴 홀더 (폭 5-6mm) (그림 2)를 놓습니다. 멀티 채널 벽 챔버를 만들기 위해 이러한 테이프 스트립을 사용합니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 스크럽.
  3. 인쇄면이 밑으로 가도록 PEG 화면이 흐름 챔버를 만들기 위해 상단에 PEG 화 커버 슬립을 놓습니다.
  4. 누출되는 모든 솔루션을 방지하기 위해 양면 테이프가 배치되는 지역을 통해 커버 슬립의 상단을 누릅니다. 상단 및 하단 (그림 2 노란색)에서 챔버의 가장자리를 닫습니다 속건 에폭시 접착제를 추가합니다.
  5. 기밀 주사기에 튜브 (외경, OD, 0.042 ")의 짧은 조각 (2.5 cm)를 연결하고 에폭시 접착제와 공동 인감.
  6. 주사기에 연결된 튜브와 에폭시 접착제와 공동 밀봉 : 긴 유연한 튜브 (0.03 "OD)을 연결합니다.
  7. TUBI 채우기NG는 DI 워터와 주사기에 연결. 공기 거품이없는 것을 확인합니다.
  8. 에폭시 접착제로 밀봉 유량 용기의 구멍에 튜브를 삽입합니다.
  9. 저수지와 다른 구멍에 노란색 팁 (200 μL 팁)을 놓습니다.

유량 용기에 4 샘플로드

주 : 뉴트라 비딘는 스트렙 아비딘과 같은 다른 단백질로 대체 될 수있다. 이 언급하지 않는 한 모든 반응을 실온에서 수행 될 수있다. 노란색 끝에서 시료 용액을 가지고, 아크릴 홀더 (그림 2b)의 구멍에 솔루션과 팁을 설치합니다.

  1. / min로 50 μL로 시린지 펌프의 유량을 설정한다. 로드 아비딘 단백질의 20 μL (T50 용액 25 μg의 / ㎖, 10 mM의 트리스, 50 mM의 염화나트륨, pH가 8), 10 분 동안 유지.
  2. 로드 (20) 비오틴 올리고 데 옥시 뉴클레오티드의 μL (1 × TE 100 μM), 10 분 동안 유지. 터미널 트랜스퍼가 사용되는 경우,로드를 건너올리고 데 옥시 뉴클레오티드의.
  3. 부하 (20) 10 μL / 분의 유속으로 유동 챔버로 1 단계의 DNA 용액 μL, 30 분 동안 유지.
  4. 1 × TE와 유량 용기를 세척하고, FP-DBP (10) (~ 80 nm의) 40 μl를로드합니다.
  5. 60X 대물 렌즈에 1 × TE에서 염색 분자의 연속적인 흐름과 형광 현미경으로 DNA를 관찰한다. FP (eGFP는) -DBP의 여기에 대한 488 nm의 고체 레이저를 사용합니다. DNA 분자의 전체 신장을 위해 사용되는 DNA의 길이에 따라 서로 다른 유속을 적용한다. 예를 들어, T4 DNA의 166 KBP에 대한 λ DNA의 48.5 KBP, 100 μL / 분 동안 50 μL / 분을 적용합니다.
    1. 아크릴 홀더의 재활용, 가정용 세제 (12)에 조립 흐름 챔버를 흡수. 완전히 벗고 손으로 면도날과 마찰와 테이프와 에폭시를 제거합니다. 주사기 바늘 구멍을 방해를 없애기. 더 사용할 때까지 탈 이온수의 소유자를 유지합니다.

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Representative Results

1은도 1b도.도 1a는 스티키 종단 DNA 분자가 아비딘 코팅 된 PEG 상에 고정화 상보 오티 닐화 올리고 뉴클레오티드 혼성화 방법을 도시한다. DNA 분자의 말단 구조에 따라 두 개의 서로 다른 DNA 테 더링 방법을 도시의 첨가를 보여준다 바이오틴 어떤 ddNTP 또는 터미널 전이에 의해 무딘 엔드 DNA의 3 '히드 록실 그룹의 dNTP 우리는 DNA 분자 및 비오틴 사이의 유연한 링커를 추가했다. 이것은 1C 도표. 반응을위한 충분한 공간을 제공하기 위해 결찰하고 아비딘 - 바이오틴 결합 효율을 증가 아비딘 코팅 된 PEG 표면에 DNA 테 더링의 전체 개략도를 보여준다.

도 2는 아크릴 홀더와 함께 유동 챔버의 조립체를 도시한다. 한 유리에 비해S / 석영 슬라이드 안경, 사용자 정의 만든 아크릴 홀더 에피 형광 현미경 유량 용기의 제조를 단순화합니다. 12 유량 용기는 효소 반응, 6, 스트레칭 DNA 분자에 대한 버퍼 상태를 즉시 변경을 할 수 있습니다.

그림 3은 FP-DBP로 염색 단일 닿는 DNA와 T4 λDNA를 보여줍니다. 미세 유체 전단과 같은 16.5 μm의은과 56.4 μm의 (T4 DNA가 0.34 nm의 X 1백66킬로바이트) (48.5 KB λ DNA가 0.34 nm의 X) 전체 윤곽 길이까지 연장 된 단일 DNA 분자를 흐른다. 우리가 사진 분열을 일으키지 않는 FP-DBP를 사용하기 때문에 우리는 오랜 기간 (예를 들면, 반 시간) 동안 DNA 스트레칭과 휴식을 여러 번 반복 할 수 있었다.

그림 1
DNA 테 더링의 도식 그림을 그림. A)의ticky 종단 DNA는 비오틴 상보 올리고 뉴클레오타이드와 하이브리드 화된다. 트리 에틸렌 글리콜, 올리고 뉴클레오티드 및 바이오틴. b) 오티 닐화의 dNTP 터미널 트랜스퍼으로 이중 가닥 DNA의 평활 말단에 첨가 간의 유연한 링커이다. 폴리 탄소 스페이서 (11 원자) 공유 유리 표면에 결합 된 비오틴 화 PEG에 연결된 아비딘 단백질에 고정된다의 dNTP 및 비오틴. c) DNA 비오틴 사이의 유연한 링커이다. 정상 PEG에 바이오틴 PEG의 비율은. (1시 40분) 0.025이었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
2. 유량 용기를줍니다. a) 아크릴산 수지 홀더 이루어지는 유량 용기, 양면 테이프 및 PEG화된 스트립 슬립 커버. 크기 76mm X 26mm X 5mm (L x 폭 x 높이)의 아크릴 홀더는, 레이저 커팅으로 제작 된 b)는 유량 용기의 측면보기 :. 홀은 노란색 팁이 설치되어있는 입구 포트입니다 펀치 버퍼 저수지, 주사기 펌프에 의해 제어되는 튜브에 연결된 출구 포트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 FP-DBP로 염색 뻗어 DNA 분자의 3 형광 현미경 이미지. A) 박테리오파지 λ DNA 바이오틴 보완 올리고 뉴클레오티드에 결찰 후 표면에 닿는 (48.5 KBP). b)는 박테리오파지 T4 DNA (166 KBP) 단자 전이와 비오틴를 추가 한 후 표면에 닿는. 표시된 화살표는 DNA의 molecul를 표시ES는 자신의 전체 윤곽 길이 T4 DNA에 대한 다음과 같은 λ DNA에 대한 16.5 μm의 56.4 μm의까지 뻗어있다. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 우리가 표면에 고정을 위해 비오틴 긴 DNA 분자를 시각화 플랫폼을 제시한다. 우리는 바이오틴 소 혈청 알부민과 아비딘 단백질이 코팅 된 표면에 닿는 DNA 분자에 대한 접근 방식. 6 이전 방법에서보고, 우리는에 닿는 DNA 분자를 얼룩 비스 - 인터 염료에 의한 DNA의 사진 분열의 중요한 문제를 발견 표면. 이러한 지속적 여기 형광체는 여기 광 전력이 광 분열을 방지하기 위해 최소화되어야했다 (9), DNA 포스페이트 골격을 공격하는 높은 확률을 가지고있다.

이러한 불편 함을 극복하기 위해, 우리는 전적으로 광 분열없이 염색 DNA에 대한 DNA 결합능 (FP-DBP)와 형광 단백질을 설계 개발 하였다. 10 우리는 아비딘 - 피복 된 단백질의 표면 상에 신뢰성있는 DNA 염색을 관찰 하였다. 그럼에도 불구하고,이 플랫폼은에 형광 단백질의 바람직하지 않은 통합의 또 다른 문제가 있었다단백질 표면 증가 소음 발생. 백그라운드에서 DNA와 단백질의 콘트라스트를 향상시키기 위해 단일 ​​분자 DNA 분석이 랜덤 잡음을 최소화하는 것이 필수적이다. FP-DBP를 사용하므로 표면에 흡착되는 형광 단백질을 방지하기 위해 표면 보호를 필요로한다. PEG는 이러한 용도를위한 강력한 후보가 될 수있다. (12) 따라서, 우리는 극적 표면에 닿는 촬상 FP-DBP 염색 DNA 분자에 대한 신호 대 잡음비를 향상 비오틴-PEG를 사용했다.

높은 수율이 방법의 몇 가지 중요한 단계 및 메모가 있습니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 유리 표면에 DNA 분자의 말단 밧줄하기 위해, 차 아민 기가 비오틴 PEG 코팅 하였다 커버 슬립에 실란 화된다. 이것은 표면 패시베이션 공정은 단일 분자 DNA 이미징에 중요한 그 때문에 크게 표면에 노이즈 발생 임의의 흡착을 감소시킬 수있다.따라서, 밤새 aminosilanization 및 PEG 화 강력히 권장합니다. 또한, 유리 슬라이드뿐만 아니라 피라냐 용액과 커버 유리를 청소하는 상기 배경 잡음을 줄일 수있다.

비오틴 화 뉴클레오티드 큰 DNA 분자의 수산기 3 '에 연결하기 위해서는 엔드 5'인산기를 가져야한다. 비오틴 올리고 뉴클레오티드의 서열은 5'-P-GGGCGGCGACCT-TEG-비오틴-3 'λ DNA 테 더링을위한 것입니다. λ의 DNA 용액을 λ DNA 종종 오랜 스토리지 concatemers을 형성하기 때문에, (1.1에 기재되어 있음) λ DNA 용액의 제조 직후에로드되어야한다. 이러한 T4 DNA 등 둔단 DNA은 터미널 트랜스퍼는 특이성없이 DNA의 양 말단에 비오틴 dUTPs을 추가 할 수있다. 따라서, 단말 전이 반응 시간은 별도로 확장 반응 (즉, 양단 비오틴으로 표지 됨) 이중 표지 된 DNA를 얻을 수도 신중 약 1 시간 조정되어야한다. 추가에서이러한 λ와 T4 DNA 등의 바이러스에 ition는, DNA의 어떤 유형이 플랫폼에서 사용될 수있다. 그러나, 이러한 SwaI 또는를 NotI 희귀 커터 제한 효소에 의해 소화 후 거대한 게놈 DNA의 조각을 사용하는 것이 좋습니다.

다른 유량은 DNA의 길이가 다른이 적용됩니다. 통상적으로, 더 긴 DNA 분자는 완전히 정확한 형상의 길이와 일치하도록 상기 DNA 분자를 스트레칭 빠른 유속을 필요로한다. 예를 들어, λ DNA는 0.34 내지 X 48502 BP의 계산 값에 대응하는 16.5 μm의 최대 늘릴 수있다.

갓 모든 재료, 단백질과 쐐기 특히 모든 준비를하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어, 뉴트라 비딘 용이이 희석 용액으로서 저장되어 있으면 biotins 바인딩 그 기능을 잃게된다. PEG 용액의 경우, pH는 일차 아민 및 N- 하이드 록시 작용기 공역 중요하다. 따라서, 갓 적어도 매주 모든 자료를 준비하는 것이 좋습니다.

표면에 닿는 큰 DNA 분자의 시각화는 게놈, 후성, DNA 및 단백질 생화학 적 상호 작용 연구 및 고분자 물리학 연구와 같은 다양한 애플리케이션에 적용될 수있는 다목적 플랫폼이다. 그러나,이 방법은 현재 이러한 바이러스 게놈 비교적 간단한 공지의 DNA 분자를 사용하여 시스템을 모델링하는 경우에만 한정된다. 인간 게놈 후성 유전체를 연장하기 위해서는 실제 사용을위한 강력한 신뢰성 있고 단순 플랫폼을 설정하기 매​​우 중요하다. 빛에 의한 DNA의 사진 분열을 극복하고 표면에 형광 단백질의 임의의 흡착을 방지하여,이 플랫폼 따라서 전단 흐름과 신장 DNA에 대한 명확하고 높은 콘트라스트 이미지를 제공합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

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References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
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  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
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