Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In - vitro - Kultur von primären humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) Zellen unter Verwendung von Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Bedingungen ein nützliches Modell stellt die Prozesse der Atemwegszelldifferenzierung und Funktion zu untersuchen. In den letzten Jahren wurde die Verwendung von lentiviralen Vektoren für die Transgen Lieferung gängige Praxis. Während es Berichte über Transduktion von vollständig differenzierten Epithelzellen der Atemwege mit bestimmten nicht-HIV pseudo-typisierten Lentiviren sind, ist die Gesamt Transduktionseffizienz in der Regel weniger als 15%. Das Protokoll vorgestellt hier stellt eine zuverlässige und effiziente Methode Lentiviren zu produzieren und primären humanen bronchialen Epithelzellen zu transduzieren. Verwendung undifferenzierter bronchialen Epithelzellen, Transduktion in bronchial epithelial Wachstumsmedien, während die Zellen anschließen, mit einer Multiplizität der Infektion Faktor 4 stellt Wirkungsgrade nahe 100%. Dieses Protokoll beschreibt, Schritt-für-Schritt, der Herstellung und der Konzentration von hohem Titer lentiviralen Vektoren und the Transduktionsprozesses. Es werden die Experimente, die die optimalen Kulturbedingungen bestimmt hocheffiziente Transduktionen von primären humanen bronchialen Epithelzellen erreichen.

Introduction

Die Entwicklung von replikationsdefektiven, pseudotypisiertem Lentiviren (LV) hat mit einem sicheren und effizienten Methode Forscher bereitgestellt Transgenen in vitro 1 zu liefern. Aufgrund ihrer langfristigen Expression könnte diese LV auch für die Abgabe von therapeutischen Mitteln in vivo 2,3 verwendet werden. Die Herstellung von LV erfordert die Cotransfektion von menschlichen embryonalen Nieren (HEK - Zellen) mit verschiedenen Plasmiden: Transfervektor, Verpackungs gag / pol, rev Verpackung und umhüllen vesikulären Stomatitis - Virus - Glycoprotein (VSV-G) Plasmiden. Die dritte Generation der Verpackungssysteme sind als sicherer als Systeme der zweiten Generation , weil die rev - Gen auf einem separaten Verpackung Plasmid codiert wird, wodurch die Möglichkeit der Rekombination Reduzieren eines Replikations - kompetenten Lentiviren zu erzeugen. Obwohl der zweiten Generation Verpackungssysteme fünffach höhere Gesamtübertragungseinheiten ergeben, auf die Spaltung des ursprünglichen viralen Genoms erstellendas System der dritten Generation hat sich nur minimal 3,4 die Höhe der Übertragungs verringert.

Während Zelllinien können einfacher und effizienter transduziert werden, haben Forscher ihren Fokus auf Primärzellen verschoben werden , da diese mehr repräsentativ für in vivo 5,6 Geweben. Allerdings sind Primärzellen refraktär Transduction. Während Transduktion von Epithelzellen der Atemwege ausdifferenzierten berichtet hat der Gesamtwirkungsgrad 15% 7 nicht überschritten wird .

Hier beschrieben ist ein Protokoll, das die Produktion von LVs mit hohem Titer ermöglicht. Ein Schritt-für-Schritt-Ansatz skizziert nahezu 100% Transduktionseffizienz in primäre HBE-Zellen zu erreichen. Genauer gesagt beschreibt das Protokoll , um die optimalen Kulturbedingungen instrumental 3 erfolgreich zu sein. Kurz gesagt, werden HEK 293T-Zellen-Promotor die Expression von enhanced green fluorescent mit dem lentiviralen Expressionsvektor pcdh mit dem EF-1 transfiziertProtein (eGFP) oder mCherry, ein rot fluoreszierendes Protein und ein Verpackungssystem der dritten Generation. LVs in den Medien veröffentlicht werden 24 bis 72 Stunden später gesammelt. Die Viruspartikel mit Polyethylenglykol (PEG) konzentriert, eine bequeme und einfache Methode der viralen Konzentration vor Titer Schätzungs ein p24-Antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit. Anschließend werden undifferenzierte primäre HBE - Zellen in Proliferationsmedium (bronchiale epitheliale Wachstumsmedium oder BEGM) transduziert 8, während Anbringen (nach trypsiniert wird), bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) Faktor 4, Hexadimethrinbromid Zugabe und für 16 Stunden inkubiert ( über Nacht). Die Zellen werden dann zu differenzieren gelassen. Da die virale Transgen langfristig (unter Verwendung des geeigneten Promotor, siehe Diskussion) ausgedrückt wird, wird die Expression im gesamten Differenzierung in einem mehrreihigen Luftwegsepithel gehalten werden oder kann (unter Verwendung eines induzierbaren Promotors) nach der Differenzierung induziert werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stufe 1: Kultur von HEK 293T

  1. Bereiten HEK-Zellen-Medien (wie HEK Medien bezeichnet) um 10% Zusatz (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin zu hohen Glukose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM).
  2. Mantel eine 10 cm-Gewebekulturschale mit Kollagen I. Mix 30 ul Kollagen I in 2 ml destilliertem Wasser. Verbreiten Sie die Mischung auf dem Teller und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Entfernen Sie die Mischung und lassen Sie die Schale trocken in einem Laminar-Flow-Schrank für 15 min.
  4. Platte HEK - Zellen auf die beschichtete Schale bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen in 10 ml HEK Medien und Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2.
  5. Wenn HEK - Zellen 50-60% konfluent (Abbildung 1a, 2-3 Tage nach der Plattierung) sind, gehen 2. Visuelle Beurteilung der Konfluenz zu Stufe ist ausreichend. Keine Quantifizierung erforderlich.
    Anmerkung: HEK-Zellen, sind in HEK Medium (siehe oben). Wenn sie Konfluenz erreichen, they kann für die spätere Verwendung aufgeteilt (zB 1/5) oder eingefroren.

2. Stufe 2: Herstellung und Konzentration von Lentiviren (LVs) in HEK-Zellen

Hinweis: Die Protokolle sollten mit institutionellen und staatlichen Vorschriften unter BSL-2 + (Enhanced BSL-2) Bedingungen in den USA in Zeile ausgeführt werden.

  1. Transfizieren eine Calciumfällungsverfahren unter Verwendung von (Lipofectamin und anderen Transfektionsmittel waren nicht so effizient wie der Calciumausfällung Verfahren). Verwendung eines handelsüblichen Transfection Kit empfohlen Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wenn das Verfahren wie folgt modifiziert. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur. Dies ist Tag 0.
  2. Für jede 10 cm Schale von HEK293-Zellen, 4,5 ug Umschlag DNA PMD2-VSVG, 7,5 ug Verpackung DNA pMDLg / pRRE, 3,75 g DNA pRSV-rev, 10 ug DNA von lentiviralen Expressionsvektor mischen, 86 ul einer 2 M Calciumlösung und steriles Wasser in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 700 ul(Letztere beiden Lösungen werden in der kommerziellen Transfection Kit bereitgestellt).
  3. Tropfenweise, fügen Sie 700 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS, bei der Transfektion Kit enthalten), während Verwirbelung (im Laminarflowbox) und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur (führen Sie Schritt 4 während des Wartens).
  4. Während der frühen Inkubationszeit Ablagerung 5 ul der Mischung auf einer Folie. Schauen Sie sich die Tröpfchen unter einem Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, die sich langsam auf und ab. Ein feiner Niederschlag sollte sichtbar sein, der Calciumphosphat - Fällungsverfahren bestätigt (Abbildung 1b).
  5. Stoppen Sie die Fällung nach 30 Minuten durch Zugabe von 10 ml HEK-Zellen Medien und Pipette nach oben und unten zu mischen.
  6. Nehmen Sie die Schale von HEK-Zellen aus Schritt 2,1-2,5, und entfernen Sie das Medium (Tag 0). Fügen Sie den Niederschlag Lösung aus Schritt 2.5 vorsichtig und langsam am Rand der Schale.
  7. Am nächsten Tag (Tag 1), zu entfernen und das Medium, das den Niederschlag verwerfen und ersetzen Sie es with 10 ml HEK Medium. Prüfen Sie, ob der feine Niederschlag unter dem Mikroskop: Es sollte in der Schale in leeren Räumen zwischen den Zellen (Abbildungen 1c und d) zu sehen sein.
  8. Am Tag 2 sammeln Medien mit einer Spritze, filtriert durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen 3,8 ml einer 40% Polyethylenglycol (PEG) -Lösung enthält. Invert 5x zu mischen und bei 4 ° C für mindestens 24 h (für die PEG bilden auszufallen, aber nicht mehr als 5 Tage), bis alle der Virensammlungen sind abgeschlossen.
  9. Wiederholen Sie Schritt 2.8 an den Tagen 3 und 4. Am Tag 4 nicht mit HEK Medium ersetzen, sondern mit 10% Bleichmittel dekontaminieren und die Schale wegwerfen.
  10. Zentrifuge alle Sammelrohre (in der Regel alle Sammlungen zusammen am Tag 5) bei 1.650 xg für 20 min bei 4 ° C, um das Virus zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und Spin wieder bei 1.650 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu sammeln und entfernen Sie alle verbleibenden von PEG-Überstand.
  11. ResusPEND das Pellet jeder Röhre in 200 ul bronchiale Epithel - Wachstumsmedium (BEGM) ohne Amphotericin B 8. Pool sie zusammen und aliquoten bei 200 & mgr; l. Store-Virus bei -80 ° C. Aliquotieren zusätzliche 10 ul der HIV-1 Gag (p24) Antigen ELISA-Assay durchzuführen.
  12. Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen ELISA-Kit, führen Sie eine p24-Antigen-Test nach dem Protokoll des Herstellers. Der Test gibt eine Schätzung der viralen p24 in pg / ml.

3. Stufe 3: Kultur Primäre HBE-Zellen

  1. Platte HBE - Zellen in 10 ml BEGM Medium (mit 100 & mgr; l Amphotericin B , wenn Passage 0 - Zellen werden verwendet , um mögliche Pilzkontamination zu eliminieren) bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen in einer Kollagen I 10 cm Gewebekulturschale aufgebracht. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Medium und ersetzen mit 10 ml BEGM (mit 100 & mgr; l Amphotericin B für die Passage 0-Zellen) für insgesamt 4 Tage. Rückkehr zum Inkubator.
  3. Nach 4 days, verwenden Sie nur BEGM ohne Amphotericin B. Wechsel jeden zweiten Tag Medien.
  4. Wenn die Zellen 80-90% konfluent (Abbildung 2a; ~ 7 Tage nach der Plattierung) sind, mit Transduktion gehen (achten Sie auf 3,5 für die Vorbereitung vor Übertragung). Auch hier ist die visuelle Beurteilung von Konfluenz ausreichend. Keine Quantifizierung erforderlich.
  5. Vor der Transduktion, beschichten die durchlässigen Stützeinlagen mit einer Kollagen-IV-Lösung verdünnt 1/10 mit sterilem destilliertem Wasser. In 200 ul zu jedem Einsatz und trocknen lassen über Nacht im Laminarflowbox.

4. Stufe 4: Transduction von HBE-Zellen

  1. Entfernen Medien, 3 ml 0,1% Trypsin in 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure in phosphatgepufferter Salzlösung (EDTA / PBS) und inkubiere 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (10X-Objektiv), um zu sehen, ob alle Zellen abgelöst werden. Wenn nicht, Rückkehr in den Inkubator für weitere 5 min.
  2. Wenn alle Zellen abgelöst werden, fügen Sie 3ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (SBTI 1 mg / ml), mischen und in ein Rohr 15 ml Zentrifugen. Pelletieren Sie die Zellen von bei 460 xg für 5 min bei Raumtemperatur zu drehen.
  3. Überstand entfernen und Pellet in 3 ml BEGM und fahren Sie mit dem Zählen.
  4. Resuspendieren HBE - Zellen (Passage nun 1 oder P1) in einem Verhältnis von 2 x 10 5 Zellen pro 12 mm permeable Stützeinsatz in 400 ul BEGM (siehe Tabelle 2). Extrapolieren diese Zahlen bezogen auf die Menge der durchlässigen Stützeinlagen, die transduziert werden.
</ Tr>
Oberfläche Oberfläche Anzahl der Zellen Medien Volume (Medien)
10-cm-Schale 52,7 cm 2 1 x 10 & sup6 ; BEGM 10 ml
12 mm Filter 1,13 cm 2 2 x 10 & sup5 ; BEGM 400 ul
24 mm Filter 4,52 cm 2 8 x 10 & sup5 ; BEGM 800 ul

Tabelle 2: Medien Extrapolation pro Zellzahl.

  1. Verwendung einer Multiplizität der Infektion (MOI) Faktor 4, fügen Sie das entsprechende Volumen des Virus an die Zellsuspension.
  2. Hinzufügen Hexadimethrinbromid in ein 2 & mgr; g / ml Endkonzentration.
  3. Dispense 400 ul der Mischung (BEGM, HBE Zellen, Viren und Hexadimethrinbromid) pro durchlässigen Trägereinsatz in das apikale Kompartiment und 1 ml BEGM allein zur basolateralen Fach. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. Immer Platte HBE - Zellen ohne Virus als Kontroll- und Test Puromycin Auswahl falls zutreffend.
  4. Am nächsten Tag, remove apikalen und basolateralen Medien, waschen mit PBS, und ersetzen Sie beide Kammern mit Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) Medien 8.
  5. Wenn die Zellen konfluent sind, entfernen apikalen Fluid (bekannt als ein Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zur Festlegung). Weiter das Medium (ALI) in der unteren Kammer Wechsel jeden zweiten Tag, bis sie ihre volle Reife erreichen; Regel 3 bis 4 Wochen später.
    Hinweis: Wenn der lentiviralen Vektor ein Selektionsgen wie Puromycin enthält, können die Zellen durch Zugabe von Puromycin ausgewählt werden, entsprechend einer Auswahl Konzentrationskurve. Für HBE-Zellen, eine Konzentration von 1 ug / ml wurde für eine konsistente Selektion von transduzierten Zellen ideal zu sein, bestimmt. Allerdings könnte diese Konzentration für andere Zellen oder Bedingungen unterscheiden und durch Abtöten Kurven bestimmt werden. Die Zugabe von Puromycin kann so früh wie ein Tag starten, nachdem die Medien von ALI Medien oder später ersetzt worden (2-3 Tage), um den vollen Ausdruck des Selektionsgens zu ermöglichen. Achten Sie darauf, Puromycin zu einem Einsatz, dass h hinzufügennicht transduziert wurden. Puromycin können hinzugefügt werden, bis die Zellen vollständig differenziert sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt verschiedene wichtige Schritte von Zellen und Lösungen während der Transfektionsprozess bewerten. Abbildung 1a zeigt die optimale Konfluenz von HEK293T - Zellen vor der Transfektion für die Virusproduktion. Es ist wichtig , dass die Zellen gleichmäßig über die Schale verteilt sind. 1b den Niederschlag in einem Tropfen der Transfektionsgemisch Verwendung Hellfeldoptik und einem 10X - Objektiv zeigt. Je mehr die Präzipitate aussehen wie Sandkörner, anstatt Agglomerate, desto effizienter ist die Transfektion wird. In diesem Bild ist der Niederschlag ein wenig grob. Der Niederschlag ist ein zuverlässiger Indikator, ob die Transfektion mit einem hohen Titer von Virus produzieren wird. Wenn einer der Bestandteile nicht vorhanden oder von schlechter Qualität (Vektor-DNA zum Beispiel), wird Agglomerate bilden, die ein bedrohliches Zeichen. Wenn dies der Fall ist, ist es klüger, um den Vorgang abzubrechen und das Verfahren neu zu starten, um sicherzustellen, dassalle Inhaltsstoffe sind in der Mischung, und / oder die Qualität der Vektor - DNA und DNA Verpackung prüfen. 1c die gleiche Schale wie A, nach Inkubation über Nacht zeigt. Der Niederschlag wird (und sollte) in zwischen den Zellen sichtbar. Wir haben festgestellt, dass die Zellen nicht vermehren viel während der 24 Stunden nach der Transfektion.

Figur 2 zeigt , wie HBE - Zellen vor aussehen und 3 Tage nach der Transduktion. 2a zeigt ca. 80% konfluente primäre HBE - Zellen vor der Trypsinierung und Transduktion. Eine 10 cm - Schale bei 80% Konfluenz ergibt etwa 4 x 10 6 Zellen. 2b zeigt nahezu 100% Transduktion von undifferenzierten P1 HBE - Zellen eine MOI von 4 auf permeable Stützeinsatz verwendet wird . Wenn HBE-Zellen auf diesen durchlässigen Stützeinlagen plattiert sind, sind die Zellen relativ flach. Auf diesem Bild ist die Höhe der Zellen, die nur wenige Mikrometer, die erklärt, warum die0,4 um Poren sind allerdings die Zellen sichtbar.

Abbildung 3 zeigt Experimente Optimierung der dargestellten Protokoll führt. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung auf Kollagen I beschichteten Vertiefungen (24-well - Platte), mit 2 x 10 5 primäre HBE - Zellen pro Vertiefung durchgeführt. Die meisten Experimente verwendet, um eine MOI von 0,4 mit einer 2 & mgr; g / ml Endkonzentration von Hexadimethrin bromidein BEGM Medien. Fluoreszierender Zellen wurden 3 Tage nach der Transduktion gezählt. Auch wenn die anfängliche Optimierungs des Protokolls wurde auf Kunststoff durchgeführt wurde, wurden die Ergebnisse auf permeable Stützeinlagen bestätigt. Zusätzlich versucht ausdifferenzierten P1 HBE-Zellen zu transduzieren hat Bestätigung nicht gelingen (Daten nicht gezeigt), früheren Berichten. Wie in 3a zu sehen ist , sind in BEGM Medien im Vergleich zu ALI ein höherer Prozentsatz der HBE - Zellen transduziert. Wenn die Zellen am Tag vor der Transduktion in BEGM Medien ausplattiert werden, die Effizienzsignifikant verringert im Vergleich zu transduzieren , während Zellen (3b) befestigt wird . Wenn P1 HBE-Zellen am Tag vor der Transduktion in ALI Medien (statt BEGM) plattiert werden, nimmt die Transduktionseffizienz noch weiter (Daten nicht gezeigt). Der Unterschied zwischen diesen zwei Medien ist die Konzentration von Calcium. BEGM Medien enthalten eine niedrige Konzentration von Calcium (0,1 mM) im Vergleich zu ALI Medien (1 mM). Calcium bildet und unterhält feste Verbindungen und daher könnte es schwierig machen , für die Viruspartikel 9 zu überqueren und ihre Rezeptoren an der basolateralen Membran gelangen. In der Tat waren einige Infektionen erfolgreich auf einem niedrigen Niveau von tight junctions stören unter Verwendung von Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA) zum Beispiel 10. Wie bereits erwähnt, vollständig differenziert sind P1 HBE - Zellen refraktären und kann nur mit geringer Effizienz 5-7, transduziert werden , die aufgrund von tight junctions in hohen Calcium - enthaltenden Medien sein könnte. Eine andere Erklärung fürgeringe Effizienz Übertragung in vollständig differenzierten Zellen ist ein aktiver mukoziliäre Transportmechanismus, bei dem Schleim als Barriere wirken könnten. Oder, wie von Bals et al., Dem Stadium der Differenzierung in denen HBE - Zellen sind, ist ein bestimmender Faktor der Transduktionseffizienz 10. Die Tatsache , dass mehr Zellen in BEGM transduzierten bekommen als in ALI Medien unterstützt diese Aussage (Abbildung 3a).

Wie in 3b zu sehen ist , wurde eine Zunahme von fast 50% Transduktionseffizienz beobachtet , wenn die Zellen während Anbringen Vergleich zu Zellen transduziert wurden am Tag vor ausplattiert. In ihrer Studie, Ricks et al. Zeigten einen Anstieg von 20% , wenn Übertragung nach Trypsinierung 11 durchgeführt wurde. Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Medien und die Reifezustand der Zellen Transduktionsbeginn Erfolg entscheidend ist.

Das Panel in Abbildung3c zeigt Hexadimethrin atrivial Rolle in Transduktionswirksamkeit bromideplaying. Dennoch ist seine Verwendung in diesem Protokoll vorgeschlagen, da es keine negativen Auswirkungen hat, aber potenziell von Nutzen sein könnte. Hexadimethrinbromid ist ein kationisches Polymer , das in virology 12 verwendet wird Transduktionseffizienzen zu verbessern. Andere haben die Verwendung von Protamin, ein anderes kationisches Polymer veröffentlicht, aber kein signifikanter Unterschied bezüglich Transduktionseffizienz Vergleich gefunden Hexadimethrin - Bromid 13. Hexadimethrinbromid hat keine Auswirkungen auf das Wachstum noch Differenzierung 14-16.

Schließlich verschiedenen MOIs in Figur 3d wurden untersucht: die höchste Transduktionseffizienz mit einer MOI von 4. aufgetreten Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen MOI 0,4 und 4, MOI 4 transduziert 100% der HBE - Zellen während MOI 0,4 transduziert nur 75%. Das Innenministerium legt fest, wie viele Viruspartikel will das Potenzial haben, eine Zelle zu infizieren. Es gibt verschiedene Methoden, um die MOI zu bestimmen. Einer von ihnen ist die Anzahl der Übertragungseinheiten (TU) zu definieren. Verwendung eines ELISA, kann die Menge an p24-Antigen in pg / ml bestimmt werden. Virale p24 in Picogramm können in TU umgewandelt werden, die notwendig sind, um das Trägheitsmoment zu berechnen. Die MOI wird durch Dividieren der Anzahl der TU durch die Anzahl der Zellen berechnet. Es gibt 10 bis 100 Übertragungseinheiten (UE) pro Pikogramm p24. Alle Verweise im Text MOI sind in Bezug auf die auf Berechnungen mit 100 TU pro Pikogramm p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).

Abbildung 1
Abb . 1: Transfektion von HEK 293T - Zellen (a) HEK 293T - Zellen 50-60% Konfluenz gezüchtet , wie unter einem 10X - Objektiv gesehen. (B) Man fällt sichtbar in einem 5 ul Tropfen 5 min nach dem alle reage Mischnts unter dem Mikroskop (10X-Objektiv). (C) Man fällt in die Schüssel neben den Zellen nach über Nacht Transfektion (10X - Objektiv). (D) Vergrößerung des Zentrums von (c). Weißer Pfeil auszufällen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m; Das gleiche gilt für a, b und c. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Transduktion von NHBE Zellen (a) HBE - Zellen für 5 Tage in einem Kollagen I beschichtete Schale auf 80-90% Konfluenz (ungefähr 4 x 10 & sup6 ; Zellen) in BEGM Medien gezüchtet (10X - Objektiv).. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) eGFP transduziert HBE - Zellen auf durchlässigen Stützeinlagen (12 mm), 3 Tage nach der Transduktion (konfokale, 20X). In diesem Zustand HBE cel ls sind flach und die Poren der Membran sind sichtbar. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Optimierung der Übertragungsprotokoll (a) Auswirkungen von Medien auf Transduktionswirksamkeit.. (B) Vergleich der Transduktion in HBE - Zellen plattiert am Tag vor und Transduktion von Zellen während befestigen. (C) Einfluss der Hexadimethrinbromid auf Transduktionswirksamkeit. (D) Bewertung der verbesserten Transduktionseffizienzen verschiedenen MOI verwenden. Die Analyse wurde unter Verwendung des Student-t-Test oder Kruskal-Wallis und Dunn-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Die Fehlerbalken stellen SE und alle * repräsentieren p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das Protokoll hier skizzierte sichert zu 100% Transduktionseffizienzen schließen. Allerdings gibt es Schritte während des Prozesses, sind wichtig, dieses Ziel zu erreichen. Zum Beispiel während der Transfektionsprozess das Vorhandensein von Präzipitaten in der Transduktion mix (drop) oder in der Schale am Tag nach der Transduktion (Figuren 1b und d) sind sowohl relevant für eine gute Transfektion. Das Fehlen eines Niederschlag oder das Vorhandensein von Agglomeraten zu einer Auslassung eines der Transfektionsreagenzien, einem pH-Problem, oder eine schlechte Plasmidpräparation fällig. Wenn der Niederschlag fehlt, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass keines der nächste Tag sichtbar. Darüber hinaus das Hinzufügen der Transfektionsgemisch oder HEK Medien zu schnell können die HEK-Zellen führen zu lösen, Transfektion und Ausbeute zu behindern. Ein weiteres Indiz für eine gute Ausbeute an Tag 6 vor dem Zentrifugationsschritt: ein weißer Niederschlag sollte in dem Boden des Rohres sichtbar. Eine schlechte Transfektion mit fastkein Virus wird diese weiße Niederschlag nicht erstellen. Während der Übertragungsprozess ist es entscheidend, primäre HBE-Zellen zu verwenden, die de-differenziert wurden und die in einem Stammzell-ähnlichen Zustand, um eine hohe Transduktionseffizienzen zu erreichen. Die Verwendung eines Vektors, der ein fluoreszierendes Protein wie eGFP oder mCherry enthält, die leicht sichtbar ist, kann ein gutes Werkzeug sein.

Modifikationen gemacht werden könnte, dieses Protokoll zu unterschiedlichen primären Zellen anzupassen. Ein Ansatz wäre, die Calciumkonzentration in den Medien zu reduzieren. Wie in 3a zu sehen ist , BEGM Medien verwenden , die eine geringere Konzentration an Calcium in signifikant höheren Transduktionseffizienz in primären HBE - Zellen führte enthält. Ein weiterer Ansatz könnte sein, das MOI zu erhöhen. In Abbildung 3d, desto höher ist die MOI, desto besser ist die Transduktionseffizienz Wie gezeigt. Allerdings könnte sich eine höhere MOI mit toxisch für einige Zellen.

Dennoch gibt es einige limita gen auf diesem Protokoll. Diese Technik wurde unter Verwendung von Durchgang 1 HBE-Zellen entwickelt. Lungs für die Transplantation abgelehnt wurden mit geeigneten Zustimmung für die Forschung, die den Normen durch die Deklaration von Helsinki erhalten. Gewinnung von primären HBE-Zellen aus kommerziellen Quellen kann teuer werden. Diese Zellen sind in der Regel auch nur bei einer höheren Durchgang zur Verfügung. Dieses Protokoll hat sich auf Passagen getestet höher als 2. Ein weiterer limitierender Faktor der p24-ELISA-Antigen-Test nicht. Mehrere Unternehmen bieten das Kit aber zu hohen Kosten. Darüber hinaus ist die virale Konzentration durch den Assay gegeben, nur ein ungefährer Wert , da der Test während transienter Transfektion freigegeben 17 Lentivirus p24 und freie p24 erkennt. Daher ist diese Auswertung der MOI nur eine Schätzung. Schließlich baut anderen Ausdruck mit (größer oder kleiner) können nicht die gleichen Ergebnisse liefern. Zum Beispiel wurden verschiedene Effizienzen unter Verwendung mCherry und eGFP aufgezeichnet (Daten nicht gezeigt).

ent "> Es gibt Vorteile dieses Protokolls gegenüber anderen Methoden. Einer von ihnen die Transfektionsprozess ist. In der Tat kann das vorgeschlagene Protokoll so hohe Virustiter ergeben, dass die gesammelten Medien Viren müssen nicht mehr konzentriert werden enthält, und verwendet werden könnten, direkt Zellen zu transduzieren. Polyethylenglycol (PEG), in diesem Protokoll verwendeten Virus zu konzentrieren, bis 18 Säugerzellen toxisch zu sein ist bekannt. Darüber hinaus, wenn höhere MOI verwendet würde, würde dies das Toxizitätsrisiko noch weiter erhöhen. jedoch wenn die PEG-Konzentration Schritt obsolet wird, Forscher, die nicht erfolgreich waren zu transduzieren aufgrund der Toxizität Auswirkungen könnte die Verwendung von Lentiviren denken. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls das Fehlen von Unterschieden in Transduktionseffizienzen auf Kunststoff oder durchlässigen Stützeinlagen. der Vorteil des Seins können auf Kunststoff zu transduzieren ist, dass weniger Zellen und Viruspartikeln notwendig sind. Als Folge können die Zellen Post Transduktion und übertragen erweitert werdenauf permeable Stützeinlagen wenn konfluent (Daten nicht gezeigt).

Die Wahl der Vektoren hängt von verschiedenen Themen, wie Auswahl von transduzierten Zellen mit Puromycin oder Expression von Markerproteinen, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP). Es gibt mehrere kommerzielle Vektoren zur Verfügung , die geeignet sind (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pcdh-EF1-MCS-IRES-Puro, pcdh-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Die Auswahl von Promotoren stellt eine Herausforderung, da die üblicherweise verwendeten CMV - Promotor in differenzierten Epithelzellen der Atemwege 15 zum Schweigen gebracht wird. Für ciliated zellspezifische Expression, die Verwendung des Fuchs-j1 Promotor wird empfohlen. Alternativ kann das EF-1 Promotor für die Expression in allen 20,21 Atemwegszellen verwendet werden. Wenn Protein-Überexpression gesucht wird, wird die Größe des Einsatzes bestimmen, teilweise Transduktionseffizienz. Jedoch können große Größen untergebracht werden , wie durch erfolgreiche Transduktion von voller Länge löslichen Adenylylcyclase gesehen 22 .Die Labor hat veröffentlichte mehrere erfolgreiche Überexpression konstruiert 15,16,20-22. Für shRNA Ausdruck (in der Regel unter der U6 oder H1-Promotor), haben mehrere Konstrukte, erkundet zu werden. Dies kann am Ende der Differenzierung (PCR und Western-Blotting), aber das Verfahren abgekürzt werden kann, nicht durchgeführt mit Tests mühsam sein, da nicht differenzierten Zellen können keine gute Repräsentation des Erfolgs für Zellen, die eine Differenzierung. Auch hier hat das Labor shRNA Konstrukte 14,20,21,23 mehrere erfolgreich veröffentlicht.

Mit diesem Protokoll könnte mehr Forschern ermöglicht werden, um deutlich vorherigen schlechten Transduktionen verbessern. Einige finden es sinnvoll, die Effizienz zu erhöhen, indem sie ein paar Anpassungen. Manche mögen dieses Tool verwenden, um neue biologische Prozesse zu entdecken oder in der Lage zu sein, Konzepte zu beweisen, beide unter Verwendung von Knockdown oder Überexpression Strategien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wir danken dem Leben Allianz Organ Recovery-Agentur von der University of Miami für Lungen bieten. Wir danken auch Dr. Lisa Künzi für die DNA-Präparation für die Experimente in 2B gezeigt ist, verwendet und 3-D, Dr. Ben Gerovac und Lisa Novak für die mCherry Virus für die Versuche in den 3A bis C verwendet Wir danken auch Gabriel Gaidosh von der Abbildungseinrichtung, Department of Ophthalmology an der Universität von Miami.

Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, der CF-Stiftung und der Flight Attendant Medical Research Institute an Dr. Matthias Salathe gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12 mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

Comments

3 Comments

  1. Using the methodology described, were you able to get these Primary HBE's to fully differentiate after the lentiviral transduction?

    Reply
    Posted by: Eugene G.
    February 15, 2017 - 3:04 PM
  2. Hi Eugene. Yes, primary HBE cells differentiate just fine after the transduction. However, it depends what shRNA is used. If the gene silenced is important for the differentiation process, this might be an issue.
    Let me know if there is anything I can help you with. Here is my email address nschmid@med.miami.edu.

    Reply
    Posted by: Nathalie B.
    February 16, 2017 - 8:13 AM
  3. Yes, they differentiate very well. See refs 15 and 22 for examples.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 15, 2017 - 4:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics