마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
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Immunology and Infection

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Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

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Abstract

대 식세포와 수지상 세포 (DC가)는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 담당 조직과 림프 기관에서 발견되는 선천성 면역 세포이다. 그러나 따라서, 시험 관내 모델이 개발되었으며, 자세하게 공부 충분한 수의 분리하기가 어렵다. 골수 유래 대 식세포 및 수상 세포의 체외 배양 면역 연구 노포 가치있는 방법이다. 여기서, 배양 및 사이토킨 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용하여 기본 마우스 골수 세포의 단일 배양액으로부터 수지상 세포 및 대식 세포를 모두 식별하기위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 제 루츠 동부 등에 의해 개발 된 기존의 방법에 기초한다. 골수 유래 수지상에 대한 1천9백99인치 문화는 이질적이며, MHCII 및 형광 표지 히알루 론산 (FL-HA)의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구분하는 데 사용됩니다. 이러한 GM-CSF는 유래 대 식세포 프로밀접하게 표현형과 기능 모두에서 폐포 대 식세포 유사 체외 파생 된 대 식세포의 편리한 소스를 제공해 줄.

Introduction

몇몇 시험 관내 배양 방법은 골수 유래 대 식세포 (BMDMs) 및 하나 이상의 성장 인자의 조합을 사용하여 골수 - 유래 수지상 세포 (BMDCs)를 생성하기 위해 설명되었다. BMDMs는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 또는 GM-CSF, 2를 사용하여 골수 세포를 배양하여 생성 될 수있다. BMDCs를 들어, 골수 문화 FLT3 리간드의 추가 (B220 + 각각의 CD11c 높은 / MHCII 높이의 CD11c 보라)을 문화 3,4 9 일 후 비 부착 클래식 형질 수지상을 발생시킨다. 대조적으로, 비 - 부착 세포는 GM-CSF 단독 5,6- 함께 배양 7 내지 10 일 후에 생성, GM-CSF 및 IL-4 7 또는 GM-CSF 및 FLT3 리간드 8,9 BMDCs 더 자세히 염증성 수지상 닮은 생성 (중 CD11c 높은, MHCII 높은 CD11b를 +) 10. 이러한 시험 관내 배양 물 식세포를 생성하는데 사용되는 동안 또는각각의 문화는 순수한 인구를 초래하는 경우 DC가, 그것은 명확하지 않다. 예를 들면, GM-CSF에 부착 배양 세포가 동질 및 관찰 가변성 인 추정 식세포 5 수지상 6,11-13로 사용되는 것과 동일한 배양에서 비 부착 세포 인 것으로 설명되었지만 때문에 개발 14, 15의 다른 단계에. 또한, 연구는 생체 16,17 폐포 대 식세포 현상에 필수적인 성장 인자로 GM-CSF를 발견하고, 폐포 대 식세포 16,17,18 형상을 생성하는 시험 관내에서 사용될 수있다.

접착 이외에, GM-CSF 치료 골수 배양에서 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하기위한 절차는 GM-CSF 골수 배양 물 내에 존재하는 이질성 제안 매우 유사하다. 이것은 참으로이 논문은 BMDC 문화의 비 접착 부분에 BMDMs의 존재를보고 같은 경우 것으로 보인다. 한 논문에서, 그들은 identifiED 가장 밀접 폐포 대 식세포를 닮은 및 T 세포 (19)를 활성화하기 위해 환원 능력을 가진 유전자 발현 특성을 발현하는 CD11c +를,는 CD11b +, MHCII 미드, MerTK + 및 CD115 +와 같은 세포 집단. MHCII 및 FL-HA 사용되는 두 번째 종이는 폐포 대 식세포와 같은 인구를 식별하는 (중 CD11c +를, MHCII 중간 / 낮음, FL-HA 고) 미숙 구별했다 (중 CD11c +를, MHCII 중반, FL-HA 낮음) 성숙 DC가 (중 CD11c +를, MHCII 고), 모두 표현형 및 기능 18. 이 논문 모두는 대 식세포와 BMDC 문화에서 데이터를 해석 할 때주의해야 그 치료를 나타내는 DC 인구를 모두 포함, GM-CSF BMDC 문화가 이질적인 것을 보여줍니다.

이 프로토콜은 골수, GM-CSF에서 배양 골수 세포를 분리하고, 폐포 대 식세포 등을 식별하는 방법을 설명바인딩 및 MHCII 식 FL-HA를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 골수 문화의 미성숙과 성숙 수지상에서 인구. .이 절차는 루츠 (6)의 설정 순서에 기초하여, 5 생성 할 수있다 - 10 ㎖의 배양 7 일째에 10 × 106 비 - 부착 세포. 문화는 일에서 7 ~ 10에 사용할 수 하루 7이 성장하고 대량으로 체외 폐포와 같은 식세포를 분리하는 간단한 방법을 제공에서 대 식세포, 미성숙과 성숙 수지상뿐만 아니라 일부 전구 세포의 이종 인구를 산출한다.

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Protocol

마우스는 브리티시 컬럼비아 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인 절차에 의한 윤리적 인 동물 연구를위한 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 안락사시켰다.

1. 마우스 대퇴골과 경골에서 단일 세포 골수 서스펜션 취득

  1. 생물 안전 캐비닛 (BSC) 70 % 에탄올로, 다음 청소 / 스프레이 B​​SC 표면을 캐비닛 공기를 제거하고 공기 흐름의 안정화를 허용하는 과정의 시작에 앞서 15 분에 전환합니다. 프로토콜의 전체에 대한 가능한 한 무균 모든 것을 유지. 비 멸균 상태에서 뼈를 절단하지 마십시오.
  2. 70 % 에탄올에 몸을 담근에 의해 해부 도구를 준비, 5 % 소 태아 혈청 (HBSS-FCS), 멸균 페트리 접시 (100mm X 15mm), 1 행크의 균형 소금 솔루션 (해부 가위, 집게 2 쌍의 1 쌍) BSC에있는 ML의 주사기 26½ 게이지 바늘 원추형 수집 튜브 (15 ml를 50 ml)에 용해시키고, 종이 타월.
  3. 사용하여 마우스를 안락사기관의 동물 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜. 상기 BSC로 가져와 하나 또는 두 종이 수건 위에 배치하고 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.
  4. 뚜껑에 2 ml의 - BSC에에서 나누어지는,베이스에 HBSS-FCS 10 ml의 1을 멸균 페트리 접시에 무균를 엽니 다.
  5. 이 위를 향하도록 뒷면과의 뱃속에 마우스를 놓고 비 지배적 인 손의 손가락으로 가슴 부분 주위의 피부를 들어 올립니다. 피부가 상승 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다.
  6. 위의 절개 대회의이 끝날 때까지 당겨 계속 위장 뒤쪽에서 마우스 주위의 피부를 떨어져 당겨 조심스럽게 잘라 양쪽 끝, 각각의 손으로 한쪽 끝을 잡아와.
  7. 이 위를 향하도록 위장에 마우스를 플립, 그리고 한 손으로 아래로 다리쪽으로 피부의 아래쪽을 당겨 다리가 노출 될 때까지 피부를 뒤로 당겨 유지한다.
  8. 마우스까지의 발을 잡고 발목 관절 위의 아킬레스 힘줄을 잘라근육 접속 인대 위 경골의 하단부에 발한다. 이 다리 뼈에서 발을 느슨하게.
  9. 발에서 다리를 들고 있지만, 낮은 다리에서 허벅지 근육을 절단하는 대퇴골의 하단부에 모든 무릎 관절 주위에 가위로 근육과 인대를 잘라. 부드럽게 떨어져 비골과 대퇴 표면에서 느슨하게 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 무거운 출혈을 방지하기 위해 대퇴 동맥을 절단하지 않도록주의하십시오.
  10. 한 손으로는 발에 들고, 고관절에서 대퇴골의 상단에서 아래로 눌러 열린 가위, 다리를 회전하고 무료로 마지막 컷을 만들기 위해 가위를 사용하는 동안 고관절에서 대퇴골을 분리 부드럽게 당겨 몸에서 다리.
  11. 이후이 시점에서, 전용 살균 집게로 조직을 개최합니다. 일단 다리에 잡고 다른 쪽 다리를 잡아 당깁니다.
    참고 : 연결하는 인대 단계에서 절단으로이 많은 힘을 필요가 없습니다1.9. 또한, 단지 뼈가 융합 발목 위의 경골을 잘라.
  12. 한 집게 세트와 서로 경골과 비골의 기단부와 대퇴골의 말단에 의해 다리를 잡고 조심스럽게 대퇴골과 슬개골에서 그들을 분리하는 무릎 관절의 반대 방향으로 경골과 비골을 구부.
  13. 여전히 낮은 다리 뼈에 부착 남아있는 인대와 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 이 골수 세포를위한 플러시 너무 작아 여기, 집게 결합 조직과 함께 제거 비골. 반전 페트리 접시 뚜껑에 청소 경골를 놓습니다.
  14. 한 집게 세트와 서로 슬개골과 대퇴골의 하단을 잡고 제거를위한 공동의 반대 방향으로 슬개골과 주변 조직을 구부리십시오. 그리고 대퇴골에서 결합 조직을 나머지 닦아; 집게와 함께 그들을 떼어과 반전 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다. 슬개골을 폐기하십시오.
  15. 1.7 반복- 다른 다리와 1.13이 필요합니다. 필요한 경우 교통 1 ml의 멸균 HBSS - FCS를 포함하는 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 뼈를 전송합니다.
  16. 1, 반전 페트리 접시 뚜껑에 뼈를 배치 - HBSS-FCS 2 ㎖ 여전히 경골과 대퇴골에 연결된 모든 잔여 조직을 청소 집게를 사용하여 다음 HBSS- 10 ㎖를 포함하는 페트리 접시의 바닥에 뼈를 전송 FCS. 대안 적으로, 뼈를 세척하고 70 % 에탄올 불린 조직을 사용하여 부착 근육 조직을 제거한다.
  17. 가위로 반으로 뼈의 각을 잘라. 뼈가 접시에 머물 수 있도록 절단하면서 부분적으로 멸균 뚜껑 페트리 접시를 보호. 대안으로, 다음 단계에서 세척 할 수 있도록 각각의 뼈의 단부를 잘라.
  18. 1 ML의 주사기에에 26½ G 바늘을 부착하고, 페트리 접시에서 1 ml의 HBSS-FCS를 그립니다. 뼈 조각의 끝 부분에 바늘의 끝을 삽입하고 골수 세포 (뼈 안에 부드러운 빨간색 조직)를 세척하십시오. 머리에 바늘을 삽입뼈와 구단의 모든 적색 골수가 제거 될 때까지. 색 흰색으로 뼈를 관찰합니다.
  19. 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 주사기를 통해 몇 번 골수의 눈에 보이는 덩어리를 전달합니다.
  20. 플러시 뼈를 폐기하십시오. 잘 세포 현탁액을 혼합하고 포집 관에 전송하는 데 10 ml를 피펫을 사용합니다. 접시에 잔류 세포를 수집하는 HBSS-FCS의 5 ㎖로 한 번 페트리 접시를 씻어. 얼음에 세포를 놓습니다.
    주 :이 저장되면 골수 세포 현탁액은 아직 실행 가능 - 39 ° C에서 3 시간.

골수 세포의 2. 도금 및 배양 (골수)

  1. 다음 시약 및 소모품을 준비합니다.
    1. 2 mM 트리스 pH를 7.2의 최종 용액에 0.84 %의 염화 암모늄함으로써 적혈구 (RBC) 용해 완충액을 준비하고, 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하여 멸균.
    2. 10 % FCS, 20 mM의 HEPES, 1X 비 필수 아미노산, 55 #를 추가하여 BMC 매체를 준비181; RPMI 배지 1640 M 2- 머 캅토 에탄올, 50 U / ㎖ 페니실린 및 스트렙토 마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 2 mM L- 글루타민.
    3. 시중에서 판매하는 재조합 GM-CSF를 구하거나 GM-CSF 유전자 (20)로 형질 Ag8.653로 융합 시킴으로 수 수득 골수종 세포에서 뜨는을 포함하는 GM-CSF를 사용합니다. ELISA에 의해 상층 액에서 GM-CSF의 농도를 결정하고 BMC 미디어에 20 ng를 / ㎖의 등가를 추가합니다.
  2. 5 분 동안 314 XG에서 골수 세포를 스핀 다운. 펠렛을 적혈구에 의한 적색이다. BSC에에서, 흡입 진공 활용하여 펠렛을 푼 다음 RBC의 용해 버퍼 10 ㎖를 추가 부착 된 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 뜨는을 대기음. 소용돌이 세포를 재현 탁하고 실온에서 5 분간 RBC 용해 완충액에서 배양.
  3. HBSS-FCS 후 5 분 동안 314 XG에서 세포를 회전하고 뜨는을 대기음의 10 ML을 추가합니다. 화이트 색상으로 세포 펠렛을 준수하십시오. BMC 미디어의 원하는 볼륨에서 세포를 재현 탁.
  4. resu를 계산0.4 % 트리 판 블루와 죽은 세포를 염색 후 혈구를 사용하여 spended 세포.
    참고 한 다리 (단일 경골 및 대퇴골)에서 골수를 사용하는 경우, BMC 배지 5 ㎖에 재현 탁 세포 현탁액 10 μL를 가지고 블루 0.4 % 트리 판 70 μL로 희석하여 잘 혼합하고 10 μl를 전송할 혈구 챔버 1/8 셀 희석. 사분면 내 생존 세포 수 : 네 사분면 카운트의 평균 희석 계수 × 104 = mL의 세포 수를 X. RBC 용해 후 4 × 10 7 세포 - 대퇴골과 한쪽 다리에서 경골은 일반적으로 약 2를 얻을 것입니다.
  5. 배양이 끝날 때 실험을 위해 필요한 총 세포 수에 기초하여 하류 실험에 필요한 골수 배양 물 10 ㎖ 접시의 수를 추정한다.
    주 : 각 접시는 2 × 10 6 골수 초기 시딩에서 세포와 수익률 5 필요 - 7 일에서 10 × 10 6 세포를.
    1. 알리5 분 동안 314 XG에서 스핀 다운 새 튜브에 도금을위한 셀의 총 개수를 quot 상등액을 흡인하고, BMC 배지에서 4 × 106 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁.
  6. BMC 매체의 9.5 ml의 GM-CSF (재조합 또는 상층 액을 포함하는 GM-CSF)에서 200 NG를 포함하여 새로운 멸균 100mm X 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 10ml에 2 × 105 세포 / ml의 최종 농도 페트리 접시의 중앙에 4 × 106 세포 / ㎖의 골수 세포 500 μl를 추가한다.
    : 멸균 페트리 접시가 아닌 조직 배양 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 세포를 추가 할 때 또한, 세포가 중앙에 집중 남아 보장하고 파종 후 미디어를 변경하는 동안 요리에 방해를 최소화 할 수 있습니다. 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 품어. 이것은 문화의 날 0입니다.
  7. 3 일에, 세포의 각 접시에 GM-CSF의 200 NG를 포함하는 신선한 BMC 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 방해 O를 최소화하기 위해주의서스펜션에 집중 세포 F. 세포 배양의 총 부피는 이제 20 ㎖이다.
  8. 100X 배율의 광학 현미경 하에서 세포를 관찰한다. 다수의 비 부착 세포 (원형)과 몇 부착 세포 (평면)를 관찰한다. 꽃의 서너 닮은 꽃잎 군에서 세포 증식을 나타내는 볼 수있다.
  9. 하루 6 일 반 용지 변경을 수행합니다. 조심스럽게 5 분, 흡인에 대한 314 XG에 스핀 다운, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 10 ㎖를 제거하고 상층 액을 버린다.
  10. GM-CSF, 부드럽게 선회 및 20 ㎖ 총 부피의 원래 세포 배양 접시에 20 ng를 추가 / ㎖을 함유하는 신선한 BMC 배지 10 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁. 현미경으로 세포를 관찰한다.
    참고 : 7 일 문화는 70 %에 있거나 부착 평면 셀 라운드 비 부착 세포의 밀도 구름 포화 상태에 더해야한다.

3. 수집 및 유동 세포 계측법에 대한 BMDC와 BMDMs 준비

    <리> 4 ° C에서 모든 버퍼를 유지합니다.
  1. 셀, 50 ML 원뿔 포집 관에 배양 상등액의 제 1 이송 10ml를 수확하기 위해 하루 10으로 7 일에서 세포를 수확 후 약 30도에 의해 수직으로 접시를 기울이고 나머지 10 ml를 피펫 팅하여 요리를 씻어 요리의 상단에서 문화. 이 세척 5 회, 1/3 접시를 회전 할 때마다 반복합니다.
  2. 동일 수집 튜브에 세포의 나머지 10 ml의 이동 플레이트 및 부착 세포를 버린다.
    주 : 세척 비 부착 느슨하게 부착 세포를 제거합니다; 평탄 부착 세포의 세척에 저항. 일반적으로, 5 사이 - 10 × 10 (6) 비 부착 세포는 하루 7과 2에 하나의 플레이트에서 예상 -, 10 일에 5 × 10 6 셀 루츠 있지만. 하루에 10에서보고 된 10 × 10 6 세포를 부착 세포는 정상적으로 수행되지 않습니다. 그러나, 이들 세포는 필요하다면 비 - 부착 세포와 비교 될다음, 그들은 제거 될 수있다. 1X PBS, 비 부착 세포를 제거한 후 접시 pH 7.4의 0.7 mM의 EDTA 5 mL를 추가 분리 튜브에 부착 세포를 제거하고 수집하도록 상하로 5 분, 피펫, 37 ° C에서 배양한다.
  3. 5 분 314 XG에서 수집 된 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 5 ml의 멸균 BMC 매체에 재현 탁은, 소용돌이 부드럽게 혼합하고, 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 계산합니다.
    참고 : 5 얻을 것입니다 각 접시 - 하루 7 문화 10 × 10 (6) 비 부착 세포를. 지금부터, 4 ° C에서 모든 단계를 수행합니다.
  4. 유세포 분석, 5 ㎖ 폴리스틸렌 둥근 바닥 튜브에 2 × 105 세포를 각각의 샘플에 대한 전달은 각 4 ° C (1X 인산 완충 식염수, 2 mM의 EDTA, 2 % 소 혈청 알부민)로 FACS 완충액 300 μL를 추가 견본.
  5. 5 분 314 XG에서 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 상기 보이는 흰색, 불투명 한 펠렛을 관찰튜브의 바닥.
  6. 표지 된 Ab의 Fc 수용체 100 ㎕에 재현 탁 된 세포 (골수종 세포주의 제조에서 사용 2.4G2 1/10 뜨는) Fc 수용체 결합을 차단하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양. 그런 다음 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운, 각 샘플 부드럽게 소용돌이에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가하고 뜨는을 대기음.
  7. 0.2 ㎍ / ㎖의에서의 CD11c-PeCy7 100 ㎕에 재현 탁 세포, 0.25 ㎍ / ㎖의에서 GR1 - 퍼시픽 블루, 0.05 ㎍ / ㎖의에서 MHCII-APC 및 FL-HA는 약 / ㎖ 2 μg의는 대 식세포와 수지상 세포를 식별합니다.
    주 : FL-HA는 형광 및 닭 빗 히알루 론산 나트륨을 사용하여 집으로 준비는 이전에 설명 21.
  8. 세포 표면에 결합 할 수 있도록 39 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. 각 샘플에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가, 부드럽게 소용돌이 후 4 ° C에서 5 분 동안 314 XG에 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음 참고 :. 바이오 경우형광 스트렙 타비 딘과 9 - tinylated 항체 3.8에 사용되는 3.8를 반복합니다.
  9. 혼합 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운 FACS 버퍼의 또 다른 300 μl를 부드럽게 소용돌이와 세포를 씻으십시오. 뜨는을 대기음 0.1 포함 FACS 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁 - 생존 할 셀 라벨을 프로피 디움 아이오다 이드 또는 DAPI 1 ㎖ 당 0.2 μg의합니다. 셀은 유세포 분석 (22)에 대한 준비가되어 있습니다.
    결과를 참조하고, 인구의 자세한 내용은 그림 3과 세포를 어떻게 게이트했다 : 주.

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Representative Results

이 방법의 주요 단계를 요약하는 흐름도가도 1에 도시되어있다. 배양 여러 번 골수 배양의 밀도 및 형태가도 2에 도시되어있다. 제 1 일에, 세포가 작은 저밀도이지만 날 (3)이다 거기에 더 많은 세포는 몇 가지 큰하고 몇 준수하기 시작했다. 6 일 일정한 부착 성 및 비 - 부착 부분 (도 2A)가 존재한다. 배양은 7 일부터 수확 될 수있는 - 일 10도 2b에 존재하는 CD11c + 세포를 높은 비율로 10 것은 수확 전 7 일째 배양뿐만 아니라 분리 된 점착성 및 비 점착성 세포 분획을 나타낸다. 자기편 부분은 비 접착 부분을 제거 빛 세척 후 남아있는 세포로 구성되어 있습니다. 비 - 부착 성 분획을 크게 확대 디지털 메신저에보다 명확하게 알 수있는 수지상 형태로 세포 충실도 2b의 세트에서 세. 비 - 부착 성 분획 (7 일 또는 10 일)을 제거하면 전술 한 바와 같이, 세포 계측법 주요 세포 표면 마커에 대해 형광 항체 표지 후에 흐름에 의해 분석된다.도 3을 비 접착의 플롯 계측법 대표적인 흐름을 도시 7 일 및 10 일에 문화의 일부.

중 CD11c +와의 대 식세포 및 수지상 세포 모두의 식별 용 게이트 GR1 - 셀 크기 및 생균 (도 3A와 B)의 제 게이팅 후. 7 일째 배양에서의 CD11c + GR1 - 인구 비 - 부착 세포 분획의 총 생균 전형적으로 60 내지 70 %이며, 이는 10 일 (도 3b)에 90 % 이상으로 증가된다. 하는 CD11c + GR1 - 7 일째 및 10 일째에 인구 MHCII 및 FL-HA의 BINDI를 사용하여 세 개의 주요 서브 세트들로 분할 될 수있다NG : MHCII 중간 / 낮은 FL-HA 높은 식세포에게 (P1)를 결합, MHCII 중반 FL-HA가 미성숙 수지상 세포를 포함하는 (P2) 세포를 결합하고, MHCII 높은 FL-HA 바인딩 낮은 성숙 수지상 세포 (P3) (그림 3C와 18를 참조 ). 7 일째에 관찰 된 FL-HA 낮은 MHCII 낮은 인구 (P0)는 P1-P3 셀 (18) 전구 세포를 포함하는 것으로 나타났다. 이것은 인구 배양 더 성숙이 발생했음을 의미 일 10에서 명백하지 않다. 이것은 또한 대 식세포 마커로 간주 (10)도 3D가 MerTK을 보여줍니다 문화에서의 CD11c 세포의 큰 비율뿐만 아니라 일의 P2와 P3 DC 인구의 약간 높은 비율, 지원하는, 매우 모두 대식 세포에서 발현되며, 미성숙 DC 인구 (P1 및 P2),하지만이 성숙 수지상 세포 (P3 세포)에 대한 낮은 정도 표현된다. 특히, 부착 성 분획의 분석은 P0, P1의 존재를 드러내고P2 집단 아니지만 P3 성숙 DC 인구 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 식세포는 점착성 및 비 부착 성 분획에 존재하지만 성숙한 수지상 세포를 비 - 부착 부분에 존재한다.

그림 1
.도 1 - 이들은 추가 실험 정제 또는 FACS 분석에 사용에 사용하기 위해 수거되는 경우 십일 방법의 주요 단계를 나타내는 흐름도 일차 세포는 골수에서 채취 도금 7 배양에서 유지된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 골수 세포 유래 GM-CSF의 현미경 검사. 에이) 세포 수, 형태의 변화와 구별 점착성 및 비 점착성 분획 출현 증가를 나타내는 일 1, 3, 6의 골수 배양. B) 왼쪽 패널은 7 일 골수 문화와 전형적인 세포 밀도를 보여줍니다. 중간 패널은 일을 비 접착 부분과 오른쪽 패널의 수확 후 7 부착 세포를 보여줍니다 7 인 세트 디지털 수지상 형태이 부분에서 세포의 이미지를 확대하는 일에 수확 비 접착 부분을 보여줍니다. 흰색 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 주 7 일 10시 GM-CSF 문화의 대표 표현형 비 접착문화의 세포 중 CD11c이 GR1, MHCII, FL-HA 및 MerTK 7 일 또는 10 일에 세포가 먼저. B 세포를 살아 크기에 문이 있었다 유동 세포 계측법. A)에 의해 자신의 표현형 분석)는 쇼로 표시되어 있습니다 인구 식세포와 수지상 세포를 포함하는 -의 CD11c과 GR1 (호중구 / 단핵 세포 마커)와 문이 세포의 줄거리와는하는 CD11c + GR1를 식별합니다. 이 인구, C)에 게이팅은 미성숙 수지상 세포 (P2에서 폐포와 같은 식세포 (P1)의 분리를 보여줍니다 결합 MHCII 및 FL-HA의 유동 세포 계측법의 플롯을 보여줍니다)과 풍에 설명 된대로) 수지상 세포 (P3 성숙 등. (18). D) 일 7 일 10시 (대 식세포)가 P1 사이 P2 (미성숙 수지상), 및 P3의 인구 (DC가 성숙) MerTK 식을 비교 히스토그램 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오레.

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Discussion

이 논문에서는 루츠 외. (6)로부터 구성되는 단일 마우스 골수 배양 물에서 GM-CSF 유도 된 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 이 문화의 미성숙 수지상 세포와 대 식세포을 구별 결합 MHCII 표현과 FL-HA 이전에 곤란 하였다 (그림 3C 참조). 이것은, 함께 Helft 등. (19)에 의해 다른 보고서로, 이전에는 수지상 것으로 생각되었다 GM-CSF 유도 BMDC 문화에서 이질성을 보여줍니다. Helft 등. (19)은 아직도 상당한 대식 세포 인구를 발견 BMDCs를 생성하는 매우 다른 배양 조건을 사용했다. GM-CSF에 의한 대 식세포는 폐포 대 식세포 유사 및 FLT3 리간드 보충 BMDC 문화는 고전과 형질 DC가 3,4를 생산하는 반면, GM-CSF 유도 수지상 세포는 염증 DC가 유사. 다른 DC와 대식 세포 인구는 생체 유엔에서 관찰된다항상성과 염증 상태를 데르, 그리고 DC와 대 식세포 (10)를 정의하는 것과 같은 분야에서 많은 논의가있다. 이 단핵구 유래 수지상 세포 염증에 있어서는 이것이이 BMC에서 중요한 경우 특히 그러하다. 이는 특정 집단의 특성을 여러 마커 표현형, 기능 데이터, 아마도 유전자 발현 데이터를 사용하는 것이 중요하다. 이들 시험 관내 DC와 대식 세포는 집단의 분할 기능적인 표현형 마커로서 발견되어 상기 수 있다는 것도 가능하다.

이 방법에있어서, 상기 마커의 CD11c, GR1, MHCII 및 FL-HA는 BMC 문화의 비 부착 성 분획 미성숙 및 성숙 수상 세포로부터 대 식세포를 구별하기 위해 사용된다. 이것은 성숙 수지상 세포에서 대 식세포 인구를 구별하는 마커의 CD11c를 사용 Helft 등. 19, CD11b를, CD115, CD135, MerTK 및 MHCII 다릅니다. MerTK 발현 수준 distinguis 수도대 식세포 사이의 시간 (P1) 및 DC가 (P3)을 성숙하지만, 미숙하지 수지상 세포 (P2) (그림 3D). 따라서 FL-HA 및 MHCII은 미성숙과 성숙 DC 인구 모두에서 대 식세포를 구별하는 유용한 지표이다. 이 대 식세포이 BMC 문화도 DC가에서 기능적으로 구별하고이 다른 18보다 상세하게 설명된다. 간단히, LPS 자극 후 BMC의 대 식세포는 성숙 수지상 다른 사이토 카인을 생산하고 순진한 T 세포 (18)를 활성화하지 않습니다. TNF-α LPS 자극 생산은 아직 순진 T 세포 (18)를 활성화 할 수 없습니다 후이 대 식세포는 밀접하게 모두 바인드 FL-HA로 모두 표현형과 기능, 폐포 대 식세포 유사과의 CD11c, MerTK, CD200R, CD206과 F4 / 80을 표현합니다. 그러나,도 차이가 같습니다 BMC의 대 식세포는 CD11b를 +하며,이 세포를 제안, 전 생체 내 폐포 대 식세포에 비해 Siglec F의 낮은 수준이 유사하지만 식별자하지 않습니다폐포 대 식세포에 칼.

이 프로토콜의 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이후 골수를 노출하는 불임을 유지하는 것이 중요하다. 에서와 BSC 밖으로 이동하는 경우, 장갑을 낀 손과 70 % 에탄올로 개체를 스프레이. 이 살균 70 % 에탄올에 도구를 씻어 도움이 있지만 도구를 공기 - 건조하고 에탄올 그들과 접촉 뼈 또는 셀을 가져 전에 증발 보장하기 때문에, 에탄올, 골수 세포에 독성이다. 또한, 골수 수확하는 동안 비 멸균 장비 또는 손으로 마우스 조직 또는 세포를 접촉하지 마십시오. 페니실린과 스트렙토 마이신 보충이 언론에 제공되지만, 세포의 부주의 한 취급은 효모 나 곰팡이 오염으로 이어질 수 있습니다. 탐식 활성 면역 세포 배양이 생성되기 때문에, 또한 경미한 오염 단순히 현미경 세포 배양 관찰에 의해 검출되지 않을 수 있고, 따라서 중요한 t를 식별하는 것이다그는 오염의 서명합니다. 예를 들어, 세포 수는 감소 될 수 있고, 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때와 같은 CD40 및 CD86과 같은 세포 활성화 마커의 발현이 증가 될 수있다. 미디어 색상도 오염으로 인해 pH 변화를 반영하는 노란색 설정 할 수 있습니다. 오염이 발생하면 BMC 문화는 사용할 수 없습니다. 실험적인 일관성을 유지하기 위해, 볼 텍싱하여 골수에서 단일 세포 현탁액을 생성하고 BMC 배양을 설정 정확한 세포 수를 얻는 것이 중요하다. 뼈에서 어떤 결합 조직을 단일 세포 현탁액에 끝나는 경우에도, 그것을 제거하는 멸균 70 마이크론 필터를 통해 필터링. 10 × 10 6 세포 - 7 일의 비 접착 부분의 한 판에 대한 일반적인 세포 수익률은 5 사이입니다. 세포 수는 일반적으로 프로토콜은 잘 작동하는지 좋은 지표이다. 루츠는 10 × 10 6 세포를보고하는 반면, 10 일에 6 × 10 5 세포 -이 과정을 통해 우리는 일반적으로이 사이를 구하십시오. 우리는 일에 RBC 용해을 수행루츠 등에 의한 프로토콜 반면 E 초기 골수 세포. 하지 그래서이 단계는 선택 사양 일 수 없습니다. 의 CD11c 세포뿐만 아니라 숫자와 대 식세포와 수지상 세포의 비율의 비율의 변화는 다른 소스 또는 FCS의 배치에서 발생할 수 있고, 그래서 일관된 실험 결과에 대한 BMC 문화에 FCS의 새로운 배치를 테스트하는 것이 중요합니다. GM-CSF 농도를 40 ml의 NG / ml가 5 NG /까지 변화시키고, 이로 인해 전지의 수율에 영향을 미치지 않았다. 세포 밀도는 또한 문화의 성숙에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어이 Helft 외. 높은 MHCII 식 (19)와 세포의 더 큰 퍼센트를 생산 4 ml의 배지에서 1 × 10 7 세포를 접종. 세포 수확 시점은 비 - 부착 부분에 존재하는 인구의 비율에 영향을 미칠 수있다. 세포는 일반적으로 일 7 사이에 수집 - (10) 25-27 있지만, 일부 연구는 하루 6 19,23,24에서 골수를 수집합니다. 이상의 세포 배양 골수 필요한 경우같은 밀도 (40) 용액에 더 큰 150mm X 15mm 배양 접시입니다. 이때 하프 볼륨 미디어 변경이 행해진 다 모두 3 일 및 6 일 (즉, 분리 매체, 세포를 스핀 다운, 20 NG / ㎖ RGM-CSF 보충 된 신선한 20 ㎖ 미디어로 대체 20 mL)을 첨가 하였다. FL-HA는 BMC 문화의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구별하기 위해, 함께 MHCII으로 중요한 시약 일 7에서 접시 당 6 × 10 7 세포 -이 판은 일반적으로 3을 생성합니다. 이 이루어진다 따라서 일단 이러한 폐포 대 식세포 18 BW5147 T 세포로서 구조적 HA 바인딩 공지 셀에 사용하기 위해 FL-HA 적정 및 HA 차단 CD44 항체를 사용하여 그의 특이성 확인 (KM-81, 시판) 레이블이없는 HA 또는 CD44 결핍 세포. 중 CD11c은 - 문화의 GR1 + 세포가 비 HA-결합 셀에 대한 내부 통제 및 형광을 뺀 제어 (FMO) 또는 CD44 결핍 BMC의 문화로서 기능 할 수있는 것은 매우 정확한 settin 추천합니다FL-HA 결합 게이트의 g.

실험 균질 배양을 사용하여 수행 될 수 있지만, GR1, MHCII 및 HA 바인딩 DC 또는 형광 활성 세포 분류 또는 CD11c 양성의 발현에 기초하여 항체가 코팅 된 자성 비드 (18)를 사용하여 대 식세포 인구 농축하는 것이 바람직하다. 가능한 실험은 유동 세포 계측법에 의해 활성화 및 사이토 카인 생산, T 세포 활성화 분석, 또는 추가 특성을 측정하는 등의 LPS와 같은 수신자 같은 수용체 작용제 자극을 포함한다. 예를 들어, 자극의 8 또는 24 시간 후, 유세포 분석기 (18)에 기술 된 바와 같이, 사이토 카인 및 / 또는 CD40 및 CD86과 같은 동시 자극 분자의 표면 라벨링 세포 오염을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 라벨 절차 분비를 방지하고 사이토 카인은 세포 내부에 구축 할 수 있습니다 Brefeldin A,와 세포의 전처리가 필요합니다. 리드 아웃 영역 (LOA)을 포함하는 T 세포 활성 분석법항원의 땡 같은 항원 제시 세포에 의해 OVA 펩티드로, 정제 된 대 식세포는 미숙 한 상태에서 T 세포를 활성화하고 의지 (18) DC가 성숙되지 않습니다 결합 MHCII 및 HA를 기반으로. 단독으로 정렬 절차가 중요한 모든 실험에서 음성 대조군을 포함하도록 만들고, 어느 정도 수상 세포를 활성화 할 수 있다는 것을 주목해야한다.

모든 시험 관내 방법으로서, 장점과 단점은 생체 내 또는 생체 외 세포의 사용에 비해있다. 단점은 생체 유래 세포에 정확히 모방 생체 세포하지만 그들이 기능, 생화학 분석을 허용하기에 충분한 숫자를 생성 할 수있는 장점 종종 생체 외 세포하지 가능한 무언가가 없을 수 있다는 것이다. 대식 세포 및 DC 식별하는이 방법은 앞으로의 연구는 이전 과소 헤테로 함께 배양 물에서 더 균일 한 세포 집단을 수득 할 수 있도록geneity. 이 GM-CSF 문화에서 정제 된 대 식세포가 밀접하게 폐 (18)로부터 폐포 대 식세포를 닮은, 그것은 체외 분석 폐포와 같은 식세포의 편리한 소스를 제공합니다. 예를 들어, 이러한 HA 바인딩 식세포 폐포 대 식세포의 기능을 변화 약물 스크리닝하고 결핵균 감염 내성의 메커니즘을 조사하는데 사용될 수있다. GM-CSF와 M-CSF의 골수 유래 대 식세포 이식 생쥐 (28, 29)에서 폐 단백을 완화 할 수있는 최근의 발견을 감안할 때, GM-CSF 문화에서 대 식세포를 식별하기 위해이 방법이 제안 치료의 효과를 높일 수 있습니다.

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Acknowledgements

이 작품은 건강 연구 (CIHR) (교부금 MOP-119503)과 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회 (NSERC)의 캐나다 연구소에 의해 투자되었다. NSERC도 YD하는 여름 studentships을 지원 AA YD는 4 년 교제 수상 브리티시 컬럼비아 대학 (UBC)에서 지원, AA는 대학원생의 석사 수상 (CGS-M)와 CIHR에 의해 지원됩니다. 우리는 그림 2의 이미지를 생성하는 데 사용되는 현미경으로 지원 캘빈 Roskelley 감사합니다. 우리는 또한 UBC 동물 및 유동 세포 계측법 시설의 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

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References

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